一種用于遞呈生長因子的類糖胺聚糖納米粒子的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥【技術領域】，具體涉及一種用于遞呈生長因子的類糖胺聚糖納米粒子的制備方法。其以糖胺聚糖中的主要成分透明質(zhì)酸為基礎，經(jīng)硫酸化修飾后通過靜電結合與帶正電荷的殼聚糖作用形成表面帶負電荷的納米粒子，模擬細胞外基質(zhì)中生長因子的存在形式，將FGF-2穩(wěn)定結合在類糖胺聚糖納米粒子的硫酸化基團上，從而達到提高生長因子穩(wěn)定性和緩釋的目的。
【專利說明】—種用于遞呈生長因子的類糖胺聚糖納米粒子的制備方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領域，具體涉及一種用于遞呈生長因子的類糖胺聚糖納米粒子的制備方法。

【背景技術】
[0002]眾所周知，細胞因子在細胞增殖、分化、遷移以及一些代謝途徑中發(fā)揮著重要的作用。在臨床上細胞因子已被用于創(chuàng)傷修復、骨疾病等，但由于生長因子存在體內(nèi)半衰期短，清除率高，生物利用度低等缺點，限制了細胞因子在神經(jīng)、血管、軟骨等組織工程中的應用。為此，為了更好地發(fā)揮細胞因子在再生醫(yī)學中的作用，解決生長因子的穩(wěn)定性和遞呈性是目前關注的重點。
[0003]載藥納米技術利用其緩釋性、靶向性可提高藥物的作用效果。納米載藥系統(tǒng)作為新型的藥物投遞和控制釋放系統(tǒng)，受到國外學者的廣泛關注。控制納米微粒的大小，可以使納米微粒到達特定的部位，起到祀向作用。通過控制納米粒子的降解可以控制藥物釋放，延長藥物的作用時間，可以提高藥物的穩(wěn)定性，避免藥物在到達受體部位前被降解。聚合物形成的納米粒子能夠達到保護生長因子免受酶降解，同時使其緩慢釋放的目的。研究表明，葡聚糖和明膠形成的納米粒子能將生長因子遞呈至小鼠間充質(zhì)干細胞，并使細胞維持十天之久的活力。另有研究表明，硫酸化殼聚糖和未修飾的殼聚糖組成的納米粒子也能達到生長因子向成纖維細胞的遞呈作用。而在正常組織中，生長因子往往被貯存于細胞外基質(zhì)中，通過與糖胺聚糖中的硫酸乙酰肝素糖鏈結合而達到穩(wěn)定存儲及信號傳導的作用。因此采用類糖胺聚糖的納米粒子裝載生長因子有可能改善生長因子在血漿中的穩(wěn)定性以及達到緩釋作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種用于遞呈生長因子的類糖胺聚糖納米粒子的制備方法。
[0005]本發(fā)明的技術方案為:以糖胺聚糖中的主要成分透明質(zhì)酸為基礎，經(jīng)硫酸化修飾后通過靜電結合與帶正電荷的殼聚糖作用形成表面帶負電荷的納米粒子，模擬細胞外基質(zhì)中生長因子的存在形式，將FGF-2穩(wěn)定結合在類糖胺聚糖納米粒子的硫酸化基團上，從而達到提高生長因子穩(wěn)定性和緩釋的目的。
[0006]本發(fā)明提出的用于遞呈生長因子的類糖胺聚糖納米粒子的制備方法的具體操作步驟如下:從透明質(zhì)酸出發(fā)，經(jīng)硫酸化修飾得到攜帶負電荷的透明質(zhì)酸衍生物，超過量的硫酸化透明質(zhì)酸與一定量的富含正電荷的殼聚糖充分攪拌，經(jīng)靜電結合作用后，取上清離心得到類糖胺聚糖納米粒子，將一定量生長因子FGF-2加入上述類糖胺聚糖納米粒子水溶液中，使生長因子結合于類糖胺聚糖納米粒子表面的糖鏈上，形成載生長因子FGF-2的類糖胺聚糖納米粒子，從而實現(xiàn)生長因子的穩(wěn)定遞呈和緩慢釋放。
[0007]本發(fā)明的獨到之處有兩點:首先，通過靜電作用將帶負電荷的硫酸化透明質(zhì)酸與帶正電荷的殼聚糖相互作用形成表面帶負電荷的納米粒子，其表面的糖鏈結構類似于細胞外基質(zhì)中的硫酸乙酰肝素糖鏈；其次，模擬細胞外基質(zhì)中生長因子的存在形式，將FGF-2穩(wěn)定結合在類糖胺聚糖納米粒子表面的糖鏈上，在細胞周圍形成一個穩(wěn)定且持續(xù)的高濃度生長因子環(huán)境。

【具體實施方式】
[0008]以下利用實施例進一步詳細說明本發(fā)明，但不能認為是限定發(fā)明的范圍。
[0009]實施例一:硫酸化透明質(zhì)酸的制備
[0010]Ig透明質(zhì)酸溶解于10mL 2M NaOH中，在氮氣保護下60°C反應24小時，反應結束后冷卻至室溫，用HCl調(diào)節(jié)pH為7，透析凍干得到脫乙酰化透明質(zhì)酸。將脫乙?；该髻|(zhì)酸溶液經(jīng)過強酸型苯乙烯系陽離子交換樹脂短柱，流出液用四丁基氫氧化銨溶液中和，凍干得白色粉末。將2g上述白色粉末溶于40mL DMF中，加入10mg DMF - SO3復合物劇烈攪拌，4V反應24小時。加入等體積冷水結束反應，用2M NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，乙醇洗滌沉淀，用超純水作為透析液，截流分子量為12000的透析袋透析，凍干后得到硫酸化透明質(zhì)酸。
[0011]實施例二:類糖胺聚糖納米粒子的制備
[0012]分別將硫酸化透明質(zhì)酸和殼聚糖溶于0.1M醋酸緩沖液(pH 5.0)中，經(jīng)0.22 μ mPVDF濾膜過濾，得終濃度分別為1.0mg/mL和0.9mg/mL的溶液。取5mL殼聚糖溶液在劇烈攪拌下一次性加入35mL硫酸化透明質(zhì)酸溶液中，反應3小時后靜置過夜，取上清1000rcf離心15分鐘，棄去上清將沉淀用去離子水復溶即得以硫酸化透明質(zhì)酸和殼聚糖為基礎的類糖胺聚糖納米粒子，測得其流體力學半徑為255nm, Zeta-電位為_40mV。
[0013]實施例三:載生長因子FGF-2的類糖胺聚糖納米粒子的制備
[0014]取5μ g生長因子FGF-2加入5mL上述類糖胺聚糖納米粒子水溶液(1.0mg/mL)中，在4°C，800r/min電磁攪拌的條件下充分反應60分鐘，然后1000rcf離心、蒸餾水洗滌、冷凍抽干，得到固化的載生長因子FGF-2的類糖胺聚糖納米粒子，測得其流體力學半徑為255nm, Zeta-電位為-3.5mV。
[0015]實施例四:載生長因子FGF-2的類糖胺聚糖納米粒子載藥率和包封率的測定
[0016]收集制備載生長因子FGF-2的類糖胺聚糖納米粒子過程中所有棄液，用ELISA法測定其中FGF-2的含量，并用冷凍抽干法得到棄液中殘留的納米粒子的量。計算載生長因子FGF-2的類糖胺聚糖納米粒子的質(zhì)量，以及其中FGF-2的含量。測定得到類糖胺聚糖納米粒子載藥率為0.08%，包封率為70.31%。
[0017]實施例五:載生長因子FGF-2的類糖胺聚糖納米粒子體外釋藥
[0018]取一系列載藥納米粒子,每份Img,分別裝入1.5mL離心管中,加入ImL pH 7.4的磷酸鹽緩沖液；將離心管放在37°C的水浴恒溫振蕩器內(nèi)(頻率60r/min)，間隔一段時間取出一個離心管離心沉淀(1000rcf)載藥納米粒子，將上清液和沉淀分別收集。用ELISA法檢測上清液中FGF-2的含量，并用冷凍抽干機冷凍干燥釋放后的納米粒子并精確稱重。經(jīng)繪制的載藥釋放曲線得知，生長因子在前3小時有突釋現(xiàn)象，從第2開始進入穩(wěn)定釋放階段，F(xiàn)GF-2每天的釋放量基本維持平衡。
[0019]實施例六:載生長因子FGF-2的類糖胺聚糖納米粒子對間充質(zhì)干細胞生長的影響
[0020]將載藥納米粒子、空納米粒子、FGF-2分別作用于間充質(zhì)干細胞，培養(yǎng)0、3、7、14天后采用CCK-8體外細胞增殖檢測試劑盒檢測間充質(zhì)干細胞的活力。體外培養(yǎng)第I天，細胞活力差異無顯著性，培養(yǎng)3?14d，載藥納米粒子組細胞活力明顯高于普通培養(yǎng)組，可能是載藥納米粒子在細胞周圍形成一個穩(wěn)定且持續(xù)的高濃度生長因子環(huán)境相關。
【權利要求】
1.一種用于遞呈生長因子的類糖胺聚糖納米粒子的制備方法，是從透明質(zhì)酸出發(fā)，經(jīng)硫酸化修飾得到攜帶負電荷的透明質(zhì)酸衍生物，超過量的硫酸化透明質(zhì)酸與一定量富含正電荷的殼聚糖充分攪拌，經(jīng)靜電結合作用后，取上清離心得到類糖胺聚糖納米粒子，將一定量生長因子FGF-2加入上述類糖胺聚糖納米粒子水溶液中，使生長因子結合于類糖胺聚糖納米粒子表面的糖鏈上，形成載生長因子FGF-2的類糖胺聚糖納米粒子，從而實現(xiàn)生長因子的穩(wěn)定遞呈和緩慢釋放。
2.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:將Ig透明質(zhì)酸溶解于10mL2M NaOH中，在氮氣保護下60°C反應24小時，反應結束后冷卻至室溫，用HCl調(diào)節(jié)pH為7，透析凍干得到脫乙?；该髻|(zhì)酸，將脫乙?；该髻|(zhì)酸溶液經(jīng)過強酸型苯乙烯系陽離子交換樹脂短柱，流出液用四丁基氫氧化銨溶液中和，凍干得白色粉末，將2g白色粉末溶于40mL DMF中，力口入10mg DMF - SO3復合物劇烈攪拌，4°C反應24小時，反應結束用2M NaOH調(diào)節(jié)pH至7.5，乙醇洗滌沉淀，用超純水作為透析液，截流分子量為12000的透析袋透析，凍干后得到硫酸化透明質(zhì)酸。
3.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:將硫酸化透明質(zhì)酸和殼聚糖溶于0.1M醋酸緩沖液(pH 5.0)中，經(jīng)0.22 um PVDF濾膜過濾，得終濃度分別為1.0mg/mL和0.9mg/mL的溶液，取5mL殼聚糖溶液在劇烈攪拌下一次性加入35mL硫酸化透明質(zhì)酸溶液中，反應中硫酸化透明質(zhì)酸為過量，以確保形成表面帶負電荷的納米粒子。
4.根據(jù)權利要求1和3所述的方法，其特征在于:硫酸化透明質(zhì)酸和殼聚糖溶液攪拌反應3小時，靜置過夜，取上清1000rcf離心15分鐘，棄去上清將沉淀用去離子水復溶。
5.根據(jù)權利要求1所述的方法，其特征在于:取5μ g生長因子FGF-2加入5mL類糖胺聚糖納米粒子水溶液(1.0mg/mL)中，在4°C,800r/min電磁攪拌的條件下充分反應60分鐘，然后1000rcf離心、蒸餾水洗滌、冷凍抽干，得到固化的載生長因子FGF-2的類糖胺聚糖納米粒子。
【文檔編號】A61K38/18GK104399087SQ201410753133
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權日:2014年12月10日
【發(fā)明者】滕麗萍, 付海田, 王敏, 陳敬華 申請人:江南大學