短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑液體制劑的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑液體制劑在制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的生物制劑中的應(yīng)用，所述的液體制劑的有效成分由短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑組成，所述的短小芽孢桿菌為保藏編號為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成的發(fā)酵菌液，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為109-1011cfu/g，所述的免疫增強(qiáng)劑為維生素C、黃芪、杜仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：能夠顯著提高魚體抵抗嗜水氣單胞菌的感染能力，增強(qiáng)養(yǎng)殖魚類的機(jī)體免疫力，顯著抑制魚類腸道致病菌的生長，促進(jìn)魚體快速生長，提高養(yǎng)殖魚類的增重率和抗病力。
CCTCC NO: M2013240
20130602
【專利說明】短小芽孢桿菌和免疫増強(qiáng)劑液體制劑的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體地說，是一種短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑液體制劑 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 細(xì)菌性疾病一直是困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要原因之一。近年來，高密度集約化 的生產(chǎn)模式在促進(jìn)水產(chǎn)業(yè)提高產(chǎn)量的同時，也使得細(xì)菌疾病發(fā)生的機(jī)會增大、頻率增加、危 害加大；此外，抗生素使用導(dǎo)致的耐藥性、藥物殘留以及對生態(tài)環(huán)境的破壞也成為社會關(guān)注 的焦點(diǎn)。因此，尋找抗生素的替代藥物、探索新的防治方式已經(jīng)成為水產(chǎn)病害防治研宄重要 方向之一。
[0003] 群體感應(yīng)（Quorum sensing，簡稱QS)是指細(xì)菌能自發(fā)產(chǎn)生并釋放一些特定的信 號分子，感知自身濃度的變化，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。目前，調(diào)節(jié)細(xì)菌群體感應(yīng)的信號 分子主要有三種，（a)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs)，是廣泛存在于革蘭氏陰性細(xì)菌中的群 體感應(yīng)的信號分子；(b)自體誘導(dǎo)肽（Autoinducing peptides，AIP)，AIP是一類短肽分子， 是革蘭氏陽性細(xì)菌中常見的信號分子；（c)自體誘導(dǎo)物II類分子（Auto inducing II，AI2)， 是以費(fèi)氏弧菌（Vibrio fischeri)為代表的由IuxS酶催化的Al 2系統(tǒng)的信號分子。研 宄表明，在革蘭氏陰性細(xì)菌中，如銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila)等，其生物被膜形成、有害毒素產(chǎn)生、致病因子釋放等行為均受到 AHLs類信號分子的調(diào)節(jié)。Dong(2000)等人在賭樣芽孢桿菌（Bacillus cereus)中發(fā)現(xiàn)了 aiiA基因，能夠合成AHLs信號分子降解酶，阻斷QS信號分子在細(xì)菌間的傳遞；尹守亮等 (2009)從膠州灣海域篩選出一株能夠降解AHLs信號分子的真菌，表明海洋微生物也可以 作為QS抑制劑的潛在研宄對象；Bhavanath等（2013)發(fā)現(xiàn)紫杉狀海門冬（Asparagopsis taxiformis)的粗提物能夠降解AHLs信號分子，并且對銅綠假單胞菌生物膜有一定的抑制 作用。Defoirdt等（2011)首次從南美白對蝦和海水鱸魚等水產(chǎn)動物的腸道中分離出了能 夠抑制哈氏弧菌（Vibrio harveyi)QS信號分子傳遞的芽孢桿菌，Natrah等（2011)分離出 一株能夠抑制AHLs信號分子的微藻，該微藻能夠阻斷哈氏弧菌QS系統(tǒng)，降低其致病力。這 些研宄為探討從群體感應(yīng)角度防控水產(chǎn)細(xì)菌性疾病提供了理論依據(jù)和科學(xué)數(shù)據(jù)的支撐。芽 孢桿菌（Bcaillus sp)具有易生產(chǎn)、便運(yùn)輸、耐儲藏等特點(diǎn)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可以起到凈化水 質(zhì)、防治疾病和促進(jìn)生長等作用，是常用的益生微生物菌株。
[0004] 中國專利文獻(xiàn)CN103525723A公開了一種具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢 桿菌，具有抑制細(xì)菌群體感應(yīng)的作用，可用于制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的微生物制劑。但是 關(guān)于一種具有顯著防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害、提高存活率的短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑液體制 劑的應(yīng)用目前還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑液 體制劑的應(yīng)用。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑液體制 劑在制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的生物制劑中的應(yīng)用，所述的液體制劑的有效成分由短小芽 孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑組成，所述的短小芽孢桿菌為保藏編號為CCTCC M 2013240的短小芽 孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成的發(fā)酵菌液，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇ncfu/g，所述的免 疫增強(qiáng)劑為維生素 C、黃芪、杜仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子，所述的 短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑的重量份分別為：短小芽孢桿菌14-16份、維生素 C 10-12份、 黃芪7-8份、杜仲4-5份、黨參2-4份、當(dāng)歸3-5份、金銀花6-8份、柴胡9-10份、烏梅3-5 份、石植皮4-6份、五味子9-10份。
[0007] 優(yōu)選的，所述的液體制劑中短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑的重量份分別為：短小芽 孢桿菌16份、維生素 C 12份、黃芪8份、杜仲5份、黨參4份、當(dāng)歸5份、金銀花8份、柴胡 10份、烏梅5份、石植皮6份、五味子10份。
[0008] 優(yōu)選的，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖2%，豆餅粉8%，玉米漿1%， MgSO4 ·7Η20 0.02%，NaCl 0.4%，KH2PO4 0.1%，MnCl2 0.04%。
[0009] 優(yōu)選的，所述的液體的制備方法為：將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成發(fā)酵 菌液，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為10 9-10ncfu/g ;將黃芪、杜仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、 烏梅、石榴皮、五味子，分別粉碎過100目篩后，加入10份水浸泡30min，然后加熱至沸騰，微 沸煎煮50-60min，共煎煮3次，每次加水量相同，合并3次藥液過濾，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃 縮，使藥液濃度為1000mg/mL左右，冷卻至室溫后加入所述的短小芽孢桿菌發(fā)酵菌液、維生 素 C，即得所述的液體制劑。
[0010] 優(yōu)選的，所述的液體制劑作為水產(chǎn)飼料添加劑或水產(chǎn)養(yǎng)殖水體添加劑使用。
[0011] 優(yōu)選的，所述的水產(chǎn)為淡水魚類。
[0012] 優(yōu)選的，所述的液體制劑在飼料中的添加量為1% _3%。
[0013] 本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)在于：
[0014] 本發(fā)明的液體制劑用于防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害，對魚類的免疫保護(hù)率高達(dá)74-91 %， 能夠顯著提高魚體抵抗嗜水氣單胞菌的感染能力，增強(qiáng)養(yǎng)殖魚類的機(jī)體免疫力，顯著抑制 魚類腸道致病菌的生長，促進(jìn)魚體快速生長，提高養(yǎng)殖魚類的增重率和抗病力。

【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合實施例對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細(xì)說明。
[0016] 本發(fā)明提供一種短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑液體制劑在制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病 害的生物制劑中的應(yīng)用，所述的液體制劑的有效成分由短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑組成， 所述的短小芽孢桿菌為保藏編號為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成的發(fā) 酵菌液，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇ncfu/g，所述的免疫增強(qiáng)劑為維生素 C、黃芪、杜 仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子，所述的短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑的 重量份分別為：短小芽孢桿菌14-16份、維生素 C 10-12份、黃苗7-8份、杜仲4-5份、黨參 2-4份、當(dāng)歸3-5份、金銀花6-8份、柴胡9-10份、烏梅3-5份、石榴皮4-6份、五味子9-10 份。
[0017] 所述的短小芽孢桿菌（Baillus pumilus)，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中心 (CCTCC)，地址：武漢大學(xué)生命科學(xué)院保藏中心，保藏日期2013年6月2日，保藏編號為 CCTCC NO :M 2013240。已證實其具有群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用。
[0018] 實施例1短小芽孢桿菌液體發(fā)酵
[0019] 將短小芽抱桿菌菌株按斜面、液體種子、液體發(fā)酵的順序培養(yǎng)，斜面培養(yǎng)基為常規(guī) 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為常規(guī)營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基；液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方（W/ V):葡萄糖 2%，豆餅粉 8%，玉米漿 1%，MgSO4 ·7Η200· 02%，NaCl 0.4%，KH2PO4 0.1%， MnCl2 0.04%，發(fā)酵溫度30°C，通風(fēng)培養(yǎng)24-48h。得到高濃度的發(fā)酵菌液，其中活菌數(shù) 109-10 ncfu/g〇
[0020] 也可以將發(fā)酵菌液離心去除發(fā)酵液，得到濕菌泥，添加抗熱保護(hù)劑后，噴霧干燥， 得到固體菌粉，活菌數(shù)10 9-10ncfu/g。
[0021] 實施例2液體制劑的制備
[0022] 將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成發(fā)酵菌液，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為 109-10 ncfu/g ;將黃芪8份、杜仲5份、黨參4份、當(dāng)歸5份、金銀花8份、柴胡10份、烏梅5 份、石榴皮6份、五味子10份，分別粉碎過100目篩后，加入10份水浸泡30min，然后加熱至 沸騰，微沸煎煮50-60min，共煎煮3次，每次加水量相同，合并3次藥液過濾，將濾液用旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)器濃縮，使藥液濃度為1000mg/mL左右，冷卻至室溫后加入所述的短小芽孢桿菌發(fā)酵 菌液16份、維生素 C 12份，即得所述的液體制劑。
[0023] 實施例3液體制劑的制備
[0024] 將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成發(fā)酵菌液，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為 109-10 ncfu/g ;將黃芪7份、杜仲4份、黨參2份、當(dāng)歸3份、金銀花6份、柴胡9份、烏梅3 份、石榴皮4份、五味子9份，分別粉碎過100目篩后，加入10份水浸泡30min，然后加熱至 沸騰，微沸煎煮50-60min，共煎煮3次，每次加水量相同，合并3次藥液過濾，將濾液用旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)器濃縮，使藥液濃度為1000mg/mL左右，冷卻至室溫后加入所述的短小芽孢桿菌發(fā)酵 菌液14份、維生素 C 10份，即得所述的液體制劑。
[0025] 實施例4液體制劑的制備
[0026] 將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成發(fā)酵菌液，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為 109-10 ncfu/g ;將黃芪7份、杜仲4份、黨參3份、當(dāng)歸4份、金銀花7份、柴胡10份、烏梅4 份、石榴皮5份、五味子10份，分別粉碎過100目篩后，加入10份水浸泡30min，然后加熱至 沸騰，微沸煎煮50-60min，共煎煮3次，每次加水量相同，合并3次藥液過濾，將濾液用旋轉(zhuǎn) 蒸發(fā)器濃縮，使藥液濃度為1000mg/mL左右，冷卻至室溫后加入所述的短小芽孢桿菌發(fā)酵 菌液15份、維生素 C 11份，即得所述的液體制劑。
[0027] 實施例5液體制劑的水體潑灑效果實驗
[0028] 鯽魚，購買自江蘇徐州淡水魚養(yǎng)殖中心，體重100±0. 5g，提前飼喂10天，無任何 嗜水氣單胞菌癥狀。飼料購買自寧波天邦股份有限公司，按照體重的3%飼喂。
[0029] 在試驗前先馴養(yǎng)一周確定無任合嗜水氣單胞菌癥狀，然后取體重（100±2. 3)g的 鯽魚90條，隨機(jī)分為三組每組三個重復(fù)，每組10條，養(yǎng)殖在700 X 500 X 50mm，體積90L水族 箱中，保持水溫16?20°C。
[0030] 實驗設(shè)計三個組，共90條，每組10條，三個重復(fù)，對照組：在水體中加入培養(yǎng)的嗜 水氣單胞菌菌液l〇〇mL(經(jīng)稀釋后最終菌液濃度達(dá)到10 8cfu/mL，在先實驗確定嗜水氣單胞 菌的絕對致死濃度為IX 108cfu/mL)，試驗組加入嗜水氣單胞菌菌液IOOmL和實施例3制備 得到的本發(fā)明的液體制劑l〇g，空白組為空白對照水體中不加入任何東西。每隔兩天換水， 加入曝過氣的自來水，和重新培養(yǎng)的菌液，記錄鯽魚的生長狀況以及死亡數(shù)。
[0031] 在兩周的飼養(yǎng)周期內(nèi)，空白組沒有任何的死亡現(xiàn)象；對照組所有樣本在9天內(nèi)全 部死亡，而水體中加入嗜水氣單胞菌和本發(fā)明的液體制劑的試驗組，在七天后達(dá)到穩(wěn)定，最 終的存活率為91 %。
[0032] 實施例6液體制劑促生長和攻毒實驗
[0033] 生長實驗：試驗選擇健康、規(guī)格、重量基本一致的鯽魚，個體初均重約50g。隨機(jī)分 組，設(shè)有對照組、試驗一組、試驗二組、試驗三組和試驗四組，每組設(shè)3個平行試驗，每平行 組50尾試驗魚，共6個網(wǎng)箱（規(guī)格為250cmX 150cmX 100cm)。鯽魚馴化30d后，對照組投 喂普通飼料，試驗一組投喂添加3. 0%重量百分比本發(fā)明液體制劑的飼料，試驗二組投喂添 加1.0%重量百分比本發(fā)明液體制劑的飼料，試驗三組投喂添加3.0%重量百分比本發(fā)明 所述短小芽孢桿菌（不包括免疫增強(qiáng)劑的液體制劑）的飼料，試驗四組投喂添加3.0%重量 百分比免疫增強(qiáng)劑（不包括短小芽孢桿菌的免疫增強(qiáng)劑）的飼料，飼養(yǎng)56d，測定其生長的 影響。
[0034] 攻毒實驗：對照組、試驗一組、試驗二組、試驗三組和試驗四組每組隨機(jī)抽取15尾 鯽魚。IX 108cfu/mL嗜水氣單胞菌，按每IOOg魚重腹腔注射菌液1.0ml，后放養(yǎng)于同樣規(guī) 格容積的水泥池網(wǎng)箱中（規(guī)格為IOOcmX IOOcmX 100cm)，并保證充足的氧氣，每天觀察魚 體死亡情況，觀察l〇d，統(tǒng)計存活率。
[0035] 具體試驗結(jié)果見下表1。
[0036] 表1三組增重率和死亡率的對照
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑液體制劑在制備防治水產(chǎn)細(xì)菌性病害的生物制劑中的 應(yīng)用，所述的液體制劑的有效成分由短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑組成，所述的短小芽孢桿 菌為保藏編號為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成的發(fā)酵菌液，其中短小 芽孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇ncfu/g，所述的免疫增強(qiáng)劑為維生素 C、黃芪、杜仲、黨參、當(dāng)歸、金 銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子，所述的短小芽孢桿菌和免疫增強(qiáng)劑的重量份分別為：短 小芽孢桿菌14-16份、維生素 C 10-12份、黃芪7-8份、杜仲4-5份、黨參2-4份、當(dāng)歸3-5 份、金銀花6-8份、柴胡9-10份、烏梅3-5份、石植皮4-6份、五味子9-10份。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的液體制劑中短小芽孢桿菌和免疫 增強(qiáng)劑的重量份分別為：短小芽孢桿菌16份、維生素 C 12份、黃芪8份、杜仲5份、黨參4 份、當(dāng)歸5份、金銀花8份、柴胡10份、烏梅5份、石榴皮6份、五味子10份。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：葡萄糖 2 %，豆餅粉 8 %，玉米漿 1 %，MgS04 ? 7H20 0? 02 %，NaCl 0? 4 %，KH2P040. 1 %，MnCl20. 04 %。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的液體的制備方法為：將所述的短小 芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成發(fā)酵菌液，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇ncfu/g ;將黃芪、杜 仲、黨參、當(dāng)歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮、五味子，分別粉碎過100目篩后，加入10份水浸 泡30min，然后加熱至沸騰，微沸煎煮50-60min，共煎煮3次，每次加水量相同，合并3次藥 液過濾，將濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮，使藥液濃度為1000mg/mL左右，冷卻至室溫后加入所述 的短小芽孢桿菌發(fā)酵菌液、維生素 C，即得所述的液體制劑。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的液體制劑作為水產(chǎn)飼料添 加劑或水產(chǎn)養(yǎng)殖水體添加劑使用。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的水產(chǎn)為淡水魚類。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的液體制劑在飼料中的添加量為 1% _3%〇
【文檔編號】A61P37/04GK104491130SQ201410752641
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月10日
【發(fā)明者】宋增福, 許維素 申請人:蘇州埃瑞特生物技術(shù)有限公司