短小芽孢桿菌和免疫增強劑粉狀制劑的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及短小芽孢桿菌和免疫增強劑粉狀制劑的制備方法，包括以下步驟：將保藏編號為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌經(jīng)經(jīng)固態(tài)發(fā)酵或液體發(fā)酵制成粉狀菌劑，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為109-1011cfu/g，將所述的粉狀菌劑、維生素C、黃芪、杜仲、黨參、當歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子分別粉碎過100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的粉狀制劑。本發(fā)明優(yōu)點在于：制備得到的粉狀制劑能夠顯著提高魚體抵抗嗜水氣單胞菌的感染能力，增強養(yǎng)殖魚類的機體免疫力，顯著抑制魚類腸道致病菌的生長，促進魚體快速生長，提高養(yǎng)殖魚類的增重率和抗病力。
CCTCC NO: M2013240
20130602
【專利說明】短小芽孢桿菌和免疫増強劑粉狀制劑的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領域，具體地說，是一種短小芽孢桿菌和免疫增強劑粉狀制劑 的制備方法。

【背景技術】
[0002] 細菌性疾病一直是困擾水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的重要原因之一。近年來，高密度集約化 的生產(chǎn)模式在促進水產(chǎn)業(yè)提高產(chǎn)量的同時，也使得細菌疾病發(fā)生的機會增大、頻率增加、危 害加大；此外，抗生素使用導致的耐藥性、藥物殘留以及對生態(tài)環(huán)境的破壞也成為社會關注 的焦點。因此，尋找抗生素的替代藥物、探索新的防治方式已經(jīng)成為水產(chǎn)病害防治研宄重要 方向之一。
[0003] 群體感應（Quorum sensing，簡稱QS)是指細菌能自發(fā)產(chǎn)生并釋放一些特定的信 號分子，感知自身濃度的變化，進而調(diào)控相關基因的表達。目前，調(diào)節(jié)細菌群體感應的信號 分子主要有三種，（a)N-?；呓z氨酸內(nèi)酯（AHLs)，是廣泛存在于革蘭氏陰性細菌中的群 體感應的信號分子；(b)自體誘導肽（Autoinducing peptides，AIP)，AIP是一類短肽分子， 是革蘭氏陽性細菌中常見的信號分子；（c)自體誘導物II類分子（Auto inducing II，AI2)， 是以費氏弧菌（Vibrio fischeri)為代表的由IuxS酶催化的Al 2系統(tǒng)的信號分子。研 宄表明，在革蘭氏陰性細菌中，如銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa)、嗜水氣單胞菌 (Aeromonas hydrophila)等，其生物被膜形成、有害毒素產(chǎn)生、致病因子釋放等行為均受到 AHLs類信號分子的調(diào)節(jié)。Dong(2000)等人在賭樣芽孢桿菌（Bacillus cereus)中發(fā)現(xiàn)了 aiiA基因，能夠合成AHLs信號分子降解酶，阻斷QS信號分子在細菌間的傳遞；尹守亮等 (2009)從膠州灣海域篩選出一株能夠降解AHLs信號分子的真菌，表明海洋微生物也可以 作為QS抑制劑的潛在研宄對象；Bhavanath等（2013)發(fā)現(xiàn)紫杉狀海門冬（Asparagopsis taxiformis)的粗提物能夠降解AHLs信號分子，并且對銅綠假單胞菌生物膜有一定的抑制 作用。Defoirdt等（2011)首次從南美白對蝦和海水鱸魚等水產(chǎn)動物的腸道中分離出了能 夠抑制哈氏弧菌（Vibrio harveyi)QS信號分子傳遞的芽孢桿菌，Natrah等（2011)分離出 一株能夠抑制AHLs信號分子的微藻，該微藻能夠阻斷哈氏弧菌QS系統(tǒng)，降低其致病力。這 些研宄為探討從群體感應角度防控水產(chǎn)細菌性疾病提供了理論依據(jù)和科學數(shù)據(jù)的支撐。芽 孢桿菌（Bcaillus sp)具有易生產(chǎn)、便運輸、耐儲藏等特點，在水產(chǎn)養(yǎng)殖上可以起到凈化水 質(zhì)、防治疾病和促進生長等作用，是常用的益生微生物菌株。
[0004] 中國專利文獻CN103525723A公開了一種具有群體感應系統(tǒng)抑制作用的短小芽孢 桿菌，具有抑制細菌群體感應的作用，可用于制備防治水產(chǎn)細菌性病害的微生物制劑。但是 關于一種具有顯著防治水產(chǎn)細菌性病害、提高存活率的短小芽孢桿菌和免疫增強劑粉狀制 劑的制備方法目前還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術中的不足，提供一種短小芽孢桿菌和免疫增強劑粉 狀制劑的制備方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術方案是：短小芽孢桿菌和免疫增強劑粉狀制 劑的制備方法，包括以下步驟：將保藏編號為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌經(jīng)經(jīng)固態(tài) 發(fā)酵或液體發(fā)酵制成粉狀菌劑，其中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇 ncfu/g，將所述的粉狀 菌劑、維生素 C、黃芪、杜仲、黨參、當歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子分別粉碎過 100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的粉狀制劑；所述的粉狀制劑中短小芽孢桿菌 和免疫增強劑的重量份分別為：短小芽孢桿菌14-16份、維生素 C 10-12份、黃芪7-8份、杜 仲4-5份、黨參2-4份、當歸3-5份、金銀花6-8份、柴胡9-10份、烏梅3-5份、石榴皮4-6 份、五味子9-10份。
[0007] 優(yōu)選的，所述的粉狀制劑中短小芽孢桿菌和免疫增強劑的重量份分別為：短小芽 孢桿菌16份、維生素 C 12份、黃芪8份、杜仲5份、黨參4份、當歸5份、金銀花8份、柴胡 10份、烏梅5份、石植皮6份、五味子10份。
[0008] 優(yōu)選的，所述的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由料和水組成，所述的料按總質(zhì)量分數(shù)100%計， 包括米糠10 %，麩皮25 %，豆柏32 %，玉米粉30 %，酵母提取物2 %，NaCl 1 %，料水比為 1:1〇
[0009] 優(yōu)選的，所述的粉狀制劑作為水產(chǎn)飼料添加劑或水產(chǎn)養(yǎng)殖水體添加劑使用。
[0010] 優(yōu)選的，所述的水產(chǎn)為淡水魚類。
[0011] 優(yōu)選的，所述的粉狀制劑在飼料中的添加量為1% -3%。
[0012] 本發(fā)明優(yōu)點在于：
[0013] 本發(fā)明制備得到的粉狀制劑對魚類的免疫保護率高達73-90%，能夠顯著提高魚 體抵抗嗜水氣單胞菌的感染能力，增強養(yǎng)殖魚類的機體免疫力，顯著抑制魚類腸道致病菌 的生長，促進魚體快速生長，提高養(yǎng)殖魚類的增重率和抗病力。

【具體實施方式】
[0014] 下面結合實施例對本發(fā)明提供的【具體實施方式】作詳細說明。
[0015] 本發(fā)明提供短小芽孢桿菌和免疫增強劑粉狀制劑的制備方法，包括以下步驟：將 保藏編號為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌經(jīng)經(jīng)固態(tài)發(fā)酵或液體發(fā)酵制成粉狀菌劑，其 中短小芽孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇 ncfu/g，將所述的粉狀菌劑、維生素 C、黃芪、杜仲、黨參、當 歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子分別粉碎過100目篩后，按照重量份配比混勻，即 得所述的粉狀制劑；所述的粉狀制劑中短小芽孢桿菌和免疫增強劑的重量份分別為：短小 芽孢桿菌14-16份、維生素 C 10-12份、黃芪7-8份、杜仲4-5份、黨參2-4份、當歸3-5份、 金銀花6-8份、柴胡9-10份、烏梅3-5份、石植皮4-6份、五味子9-10份。
[0016] 所述的短小芽孢桿菌（Bacillus pumilus)，保藏單位：中國典型培養(yǎng)物保藏中 心（CCTCC)，地址：武漢大學生命科學院保藏中心，保藏日期2013年6月2日，保藏編號為 CCTCC NO :M 2013240。已證實其具有群體感應系統(tǒng)抑制作用。
[0017] 實施例1短小芽孢桿菌液體發(fā)酵
[0018] 將短小芽抱桿菌菌株按斜面、液體種子、液體發(fā)酵的順序培養(yǎng)，斜面培養(yǎng)基為常規(guī) 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為常規(guī)營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基；液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方（W/ V):葡萄糖 2%，豆餅粉 8%，玉米漿 1%，MgSO4 · 7Η200· 02%，NaCl 0.4%，KH2PO4O. 1%， MnCl2O. 04 %，發(fā)酵溫度30 °C，通風培養(yǎng)24-48h。得到高濃度的發(fā)酵菌液，其中活菌數(shù) 109-10nCfu/g。將發(fā)酵菌液離心去除發(fā)酵液，得到濕菌泥，添加抗熱保護劑后，噴霧干燥，得 到固體粉狀菌劑，活菌數(shù)l〇 9_l〇ncfu/g。
[0019] 實施例2短小芽孢桿菌固態(tài)發(fā)酵
[0020] 將短小芽抱桿菌菌株按斜面、液體種子、固態(tài)發(fā)酵的順序培養(yǎng)，斜面培養(yǎng)基為常規(guī) 營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，液體種子培養(yǎng)基為常規(guī)營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基。將種子培養(yǎng)液以5-10%的 接種量接種到固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基中進行固態(tài)發(fā)酵，發(fā)酵時間為24-48h，發(fā)酵溫度30°C，發(fā)酵 產(chǎn)物烘干粉碎后，即得短小芽孢桿菌粉狀菌劑。其中活菌數(shù)l〇 9-l〇ncfu/g。
[0021] 其中固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基由料和水組成，所述的料按總質(zhì)量分數(shù)100%計，包括米糠 10%，麩皮25%，豆柏32%，玉米粉30%，酵母提取物2%，NaCl 1%，料水比為1:1。
[0022] 實施例3粉狀制劑的制備
[0023] 將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成粉狀菌劑，所述的粉狀菌劑中短小芽孢桿 菌活菌數(shù)為l〇 9-l〇ncfu/g，將所述的粉狀菌劑16份、維生素 C 12份、黃芪8份、杜仲5份、 黨參4份、當歸5份、金銀花8份、柴胡10份、烏梅5份、石榴皮6份、五味子10份。分別粉 碎過100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的粉狀制劑。
[0024] 實施例4粉狀制劑的制備
[0025] 將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)液體發(fā)酵制成粉狀菌劑，所述的粉狀菌劑中短小芽孢桿 菌活菌數(shù)為l〇 9-l〇ncfu/g，將所述的粉狀菌劑14份、維生素 C 10份、黃芪7份、杜仲4份、 黨參2份、當歸3份、金銀花6份、柴胡9份、烏梅3份、石榴皮4份、五味子9份。分別粉碎 過100目篩后，按照重量份配比混勾，即得所述的粉狀制劑。
[0026] 實施例5粉狀制劑的制備
[0027] 將所述的短小芽孢桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成粉狀菌劑，所述的粉狀菌劑中短小芽孢桿 菌活菌數(shù)為l〇 9-l〇ncfu/g，將所述的粉狀菌劑15份、維生素 C 11份、黃芪7份、杜仲4份、 黨參3份、當歸4份、金銀花7份、柴胡10份、烏梅4份、石榴皮5份、五味子10份。分別粉 碎過100目篩后，按照重量份配比混勻，即得所述的粉狀制劑。
[0028] 實施例6粉狀制劑的水體潑灑效果實驗
[0029] 鯽魚，購買自江蘇徐州淡水魚養(yǎng)殖中心，體重100±0. 5g，提前飼喂10天，無任何 嗜水氣單胞菌癥狀。飼料購買自寧波天邦股份有限公司，按照體重的3%飼喂。
[0030] 在試驗前先馴養(yǎng)一周確定無任合嗜水氣單胞菌癥狀，然后取體重（l〇〇±2. 3)g的 鯽魚90條，隨機分為三組每組三個重復，每組10條，養(yǎng)殖在700 X 500 X 50mm，體積90L水族 箱中，保持水溫16?20°C。
[0031] 實驗設計三個組，共90條，每組10條，三個重復，對照組：在水體中加入培養(yǎng)的嗜 水氣單胞菌菌液l〇〇mL(經(jīng)稀釋后最終菌液濃度達到10 8cfu/mL，在先實驗確定嗜水氣單胞 菌的絕對致死濃度為IX 108cfu/mL)，試驗組加入嗜水氣單胞菌菌液IOOmL和實施例3制 備得到的本發(fā)明的粉狀制劑l〇g，空白組為空白對照水體中不加入任何東西。每隔兩天換 水，加入曝過氣的自來水，和重新培養(yǎng)的菌液，記錄鯽魚的生長狀況以及死亡數(shù)。
[0032] 在兩周的飼養(yǎng)周期內(nèi)，空白組沒有任何的死亡現(xiàn)象；對照組所有樣本在9天內(nèi)全 部死亡，而水體中加入嗜水氣單胞菌和本發(fā)明的粉狀制劑的試驗組，在七天后達到穩(wěn)定，最 終的存活率為90%。
[0033] 實施例7粉狀制劑促生長和攻毒實驗
[0034] 生長實驗：試驗選擇健康、規(guī)格、重量基本一致的鯽魚，個體初均重約50g。隨機分 組，設有對照組、試驗一組、試驗二組、試驗三組和試驗四組，每組設3個平行試驗，每平行 組50尾試驗魚，共6個網(wǎng)箱（規(guī)格為250cmX 150cmX 100cm)。鯽魚馴化30d后，對照組投 喂普通飼料，試驗一組投喂添加3. 0%重量百分比本發(fā)明粉狀制劑（實施例3)的飼料，試驗 二組投喂添加1.0%重量百分比本發(fā)明粉狀制劑的飼料，試驗三組投喂添加3.0%重量百 分比本發(fā)明所述短小芽孢桿菌（不包括免疫增強劑的粉狀制劑）的飼料，試驗四組投喂添 加3.0%重量百分比免疫增強劑（不包括短小芽孢桿菌的免疫增強劑）的飼料，飼養(yǎng)56d， 測定其生長的影響。
[0035] 攻毒實驗：對照組、試驗一組、試驗二組、試驗三組和試驗四組每組隨機抽取15尾 鯽魚。IX 108cfu/mL嗜水氣單胞菌，按每IOOg魚重腹腔注射菌液1.0ml，后放養(yǎng)于同樣規(guī) 格容積的水泥池網(wǎng)箱中（規(guī)格為IOOcmX IOOcmX 100cm)，并保證充足的氧氣，每天觀察魚 體死亡情況，觀察l〇d，統(tǒng)計存活率。
[0036] 具體試驗結果見下表1。
[0037] 表1三組增重率和死亡率的對照
[0038]

【權利要求】
1. 短小芽孢桿菌和免疫增強劑粉狀制劑的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：將 保藏編號為CCTCC M 2013240的短小芽孢桿菌經(jīng)固態(tài)發(fā)酵或液體發(fā)酵制成粉狀菌劑，其中 短小芽孢桿菌活菌數(shù)為l〇9-l〇ncfu/g，將所述的粉狀菌劑、維生素 C、黃芪、杜仲、黨參、當 歸、金銀花、柴胡、烏梅、石榴皮和五味子分別粉碎過100目篩后，按照重量份配比混勻，即 得所述的粉狀制劑；所述的粉狀制劑中短小芽孢桿菌和免疫增強劑的重量份分別為：短小 芽孢桿菌14-16份、維生素 C 10-12份、黃芪7-8份、杜仲4-5份、黨參2-4份、當歸3-5份、 金銀花6-8份、柴胡9-10份、烏梅3-5份、石植皮4-6份、五味子9-10份。
2. 根據(jù)權利要求1所述的粉狀制劑的制備方法，其特征在于，所述的粉狀制劑中短小 芽孢桿菌和免疫增強劑的重量份分別為：短小芽孢桿菌16份、維生素 C 12份、黃芪8份、杜 仲5份、黨參4份、當歸5份、金銀花8份、柴胡10份、烏梅5份、石榴皮6份、五味子10份。
3. 根據(jù)權利要求1所述的粉狀制劑的制備方法，其特征在于，所述的固態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基 由料和水組成，所述的料按總質(zhì)量分數(shù)100 %計，包括米糠10 %，麩皮25 %，豆柏32 %，玉米 粉30%，酵母提取物2%，NaCl 1%，料水比為1:1。
4. 根據(jù)權利要求1-3任一所述的粉狀制劑的制備方法，其特征在于，所述的粉狀制劑 作為水產(chǎn)飼料添加劑或水產(chǎn)養(yǎng)殖水體添加劑使用。
5. 根據(jù)權利要求4所述的粉狀制劑的制備方法，其特征在于，所述的水產(chǎn)為淡水魚類。
6. 根據(jù)權利要求4所述的粉狀制劑的制備方法，其特征在于，所述的粉狀制劑在飼料 中的添加量為1% -3%。
【文檔編號】A61P31/04GK104435297SQ201410751169
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月10日 優(yōu)先權日:2014年12月10日
【發(fā)明者】宋增福, 許維素 申請人:蘇州埃瑞特生物技術有限公司