一種淫羊藿總黃酮的提取和分離純化工藝的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種淫羊藿總黃酮的提取和分離純化工藝，采用Ｌ９正交設計法，以浸膏得率和總黃酮含量為檢測指標優(yōu)選提取工藝；用ＡＢ-８型大孔吸附樹脂柱進行分離，乙酸乙酯、正丁醇萃取純化，本研究按這些方法提取淫羊藿總黃酮，再經大孔吸附樹脂柱分離，得到淫羊藿總黃酮的含量相差不大，為提高淫羊藿總黃酮的含量，實驗時采用水提，過大孔吸附樹脂柱分離后，再用乙酸乙酯、正丁醇進行萃取的方法，對提取物進行了精制。結果發(fā)現(xiàn)，經萃取后所得淫羊藿總黃酮的含量提高到６１％，表明，大孔吸附樹脂柱分離法和萃取法相結合可以達到純化淫羊藿總黃酮的目的。
【專利說明】一種淫羊藿總黃酮的提取和分離純化工藝

【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種淫羊藿總黃酮的提取和分離純化工藝，屬于生物醫(yī)藥【技術領域】。

【背景技術】
[0002]淫羊藿為小檗科植物淫羊藿E p imed iumbrev 1- co rnuMax im、箭葉淫羊藿 Ep imed i u m.s a g i t t a t u m (S e b.e tZucc.) M a x i m、柔毛淫羊藿 Epimedium pu-bescens Maxim
或朝鮮淫羊藿Epimedium koreanum Nakai的干燥葉，，味辛甘、
性溫，具有補腎陽，強筋骨、祛風濕功效，現(xiàn)代藥理學研宄表明，淫羊藿在免疫、生殖、核酸代謝、心血管以及抗衰老方面具有多種藥效。


【發(fā)明內容】

[0003]本發(fā)明的目的是:提供一種淫羊藿總黃酮的提取和分離純化工藝，能大大提高總黃酮的得率和含量，以克服現(xiàn)有技術的不足。
[0004]本發(fā)明的技術方案
一種淫羊藿總黃酮的提取和分離純化工藝，采用L 9正交設計法，以浸膏得率和總黃酮含量為檢測指標優(yōu)選提取工藝；用A B - 8型大孔吸附樹脂柱進行分離，乙酸乙酯、正丁醇萃取純化。
[0005]前述的一種淫羊藿總黃酮的提取和分離純化工藝中，最佳提取工藝為淫羊藿葉的粗粉中加入2 7倍量水，浸泡2 h后，煎煮3次，每次1 h ;淫羊藿提取液上AB - 8型大孔吸附樹脂柱分離，再用乙酸乙酯、正丁醇萃取。
[0006]由于采用上述技術方案，與現(xiàn)有技術相比，現(xiàn)有技術中關于淫羊藿總黃酮提取方法的研宄報道眾，常見的方法有水煎煮法、乙醇回流法、索氏提取法、超聲提取法，本研宄按這些方法提取淫羊藿總黃酮，再經大孔吸附樹脂柱分離，得到淫羊藿總黃酮的含量相差不大，雖然以6 0 %乙醇為溶媒時提取的淫羊藿總黃酮含量較高，但含量均低于5 0 %，為提高淫羊藿總黃酮的含量，考慮到水具有廉價環(huán)保等特點，實驗時采用水提，過大孔吸附樹脂柱分離后，再用乙酸乙酯、正丁醇進行萃取的方法，對提取物進行了精制，結果發(fā)現(xiàn)，經萃取后所得淫羊藿總黃酮的含量提高到6 1 %，表明，大孔吸附樹脂柱分離法和萃取法相結合可以達到純化淫羊藿總黃酮的目的。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0007]附圖1為提取工藝因素水平表；
附圖2為淫羊藿總黃酮提取工藝正交試驗與結果示意圖；
附圖3為提取工藝方差分析表；
附圖4為重現(xiàn)性試驗示意圖；
附圖5為不同洗脫劑對黃酮量的影響示意圖； 附圖6為萃取后的結果圖；
附圖7為萃取后總黃酮含量示意圖。

【具體實施方式】
[0008]下面結合附圖對本發(fā)明作進一步的詳細說明，但不作為對本發(fā)明的任何限制。
[0009]本發(fā)明的實施例:
1儀器及試藥
U V - 2 4 0 1型紫外可見分光光度計(上海棱光技術有限公司)，日本島津AY - 1 2 0電子分析天平，日本東京Ν 1 0 0 0 D Ν A旋轉蒸發(fā)儀，HHS-2 1-6電熱恒溫水浴鍋(杭州艾普儀器設備有限公司)。淫羊藿葉購于貴陽市三橋中藥材市場，淫羊藿苷對照品為成都曼斯特生物有限科技公司產品，批號MUS T - 1 0 0 7 0 9 0 1, AB - 8型大孔吸附樹脂(天津市海光化工有限公司)，9 5 %乙醇、乙酸乙酯(AR，上海申博化工有限公司)，正丁醇(A R，上海申博化工有限公司)，甲醇(A R，天津市大茂化工試劑廠)，純化水(實驗室自制)。
[0010]2 方法與結果
2.1提取工藝的優(yōu)選 2.1.1因素水平的選擇
為確定淫羊藿總黃酮的最佳提取工藝，以加水量、浸泡時間、煎煮時間和煎煮次數(shù)為影響因素，按每個因素3水平，選用L 9(3 4)正交表安排試驗，結果見附圖1，以浸膏得率和總黃酮含量為考察指標，選取最佳工藝。
[0011]2.1.2 標準曲線的繪制
精密稱取淫羊藿苷對照品1 0.0mg，置于1 0 0 m 1量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，即得濃度為1 0 0.0mg / L的淫羊藿苷對照品溶液。精密吸取對照品溶液 0.5 0 , 1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml 分另U 置于 2 5 m 1 量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，以甲醇為空白對照，用紫外分光光度計在2 7 0 n m處測定吸光度，以吸光度A對淫羊藿苷濃度C進行回歸，得到回歸方程為:A=0.0 3 6 3 C +0.0707，r = 0.9 9 9 8，結果表明在2.00?20.0 0 m g / L范圍內，線性關系良好。
[0012]2.1.3 樣品的制備和測定結果
按L 9 ( 3 4)正交表安排試驗，稱取淫羊藿粗粉5 0 g，按設定方案進行提取，濾過，提取液濃縮至5 Q m 1，加9 5 %乙醇至醇沉濃度為5 Q %，4 °C靜置1 2 h，濾去沉淀，減壓回收乙醇至無醇味，用適量乙酸乙酯分次萃取，合并乙酸乙酯層，減壓回收，真空干燥，計算浸膏重。按“2.1.2”項下方法測定總黃酮含量，并計算總黃酮得率，結果見附圖2和附圖3。
[0013]由附圖2中極差值R大小可知，RD>RA>RB> R C，各影響因素順序為D>A>B >C，因此D是影響淫羊藿總黃酮含量的重要因素，因素A、B次之，因素C影響最小；從附圖3方差分析可見，因素D對淫羊藿總黃酮的提取具有顯著意義(P< 0.0 5)，結合極差值R大小綜合分析，最佳提取工藝為A 3 B 3 C 2 D 30
[0014]2.1.4 工藝重現(xiàn)性考察稱取3份藥材粗粉，每份5 Q g，按最佳提取工藝加入2 7倍量的水，浸泡2 h，回流3次，每次1 h，合并提取液，濃縮、醇沉、加乙酸乙酯萃取，減壓回收，真空干燥，測定浸膏得率和總黃酮得率，本工藝重現(xiàn)性良好，見附圖4。
[0015]2.2 分離工藝的研宄
2.2.1大孔吸附樹脂的優(yōu)選
AB - 8型大孔吸附樹脂是分離純化淫羊藿中淫羊藿總黃酮的最優(yōu)樹脂，因此本工藝采用AB - 8型大孔吸附樹脂對淫羊藿總黃酮提取物進行分離。
[0016]2.2.2 大孔吸附樹脂的預處理
采用乙醇濕法裝柱(4.8 c m X 25 c m)，用乙醇洗脫，檢測乙醇流出液，當乙醇流出液與水(1: 3)混合不呈現(xiàn)白色乳濁現(xiàn)象后，再用大量純化水反復洗脫，直至無醇味、樹脂高度不再下降即可，平行裝4根同規(guī)格的柱子(4.8 cm X 2 5 cm)。
[0017]2.2.3 洗脫溶劑的選擇
稱取2 0 0 g淫羊藿粗粉，按最佳工藝提取。提取液濃縮至4 0 0 ml，平均分成4份，分別上樣，吸附1 h后，所有柱子用足量純化水洗脫，當洗脫液接近無色時，再分別用
20 %, 6 0 %, 7 0 %, 9 0 %乙醇洗脫柱子，流速為2 m 1 / m i η，將乙醇洗脫液分別蒸干、稱重，測得總黃酮含量，計算總黃酮解析率，結果見附圖52.2.4 洗脫溶劑用量的確定
用3個柱體積的2 0 %乙醇可以將大部分雜質除去，再用5個柱體積的6 0 %乙醇洗脫，可將有效成分幾乎完全洗脫下來。由表5可知6 0 %乙醇洗脫物中總黃酮含量最高，解析率最佳，所以選用6 0 %乙醇為洗脫劑，同時選用純化水和2 0 %乙醇為除水溶性雜質的溶劑，為進一步提高總黃酮含量，對6 0 %乙醇的洗脫液再進行萃取處理。
[0018]2.3 萃取純化工藝研宄 2.3.1萃取溶劑的選擇
按照最佳提取工藝，提取2批淫羊藿粗粉，每批5 0 g，提取液濃縮至5 Q m 1，加9 5 %乙醇至醇沉濃度為5 0 %, 4 °C靜置1 2 h，過濾，取上清液，減壓回收乙醇至無醇味，分別上大孔樹脂柱分離，分開收集6 0 %乙醇的洗脫液，減壓回收乙醇，使每份濃縮至約5 0ml，第一份用乙酸乙酯萃取，第二份用正丁醇萃取，減壓回收溶劑，真空干燥，測定浸膏中總黃酮含量，結果見附圖6，與附圖5比較可知，經萃取后，淫羊藿總黃酮的含量高于未萃取前，但是這兩種溶劑均不能徹底將提取液中的淫羊藿總黃酮完全萃取，為保證浸膏得率和總黃酮含量，故對用兩種溶劑萃取進行研宄。
[0019]2.3.2 兩種溶劑萃取的考察稱取5份淫羊藿粗粉，每份5 Q g。按照最優(yōu)提取，分離工藝進行，得到約5 0 m 1 6 0 %乙醇的洗脫液(5份)后，向每份溶液依次加入9體積倍的乙酸乙酯萃取，然后再加入1 0體積倍的正丁醇萃取，分別減壓回收溶劑至稠膏后合并，真空干燥，得浸膏，測定含量，結果見附圖7，結果表明，依次用乙酸乙酯、正丁醇萃取得到的浸膏得率比只用乙酸乙酯萃取高出約1.5倍，得到的總黃酮含量比只用正丁醇萃取高出約6.2 %。由此可見在保證總黃酮得率和含量的情況下，依次乙酸乙酯、正丁醇萃取是比較理想的。
【權利要求】
1.一種淫羊藿總黃酮的提取和分離純化工藝，其特征在于:采用L 9正交設計法，以浸膏得率和總黃酮含量為檢測指標優(yōu)選提取工藝；用A B - 8型大孔吸附樹脂柱進行分離，乙酸乙酯、正丁醇萃取純化。
2.根據(jù)權利要求1所述的一種淫羊藿總黃酮的提取和分離純化工藝，其特征在于:最佳提取工藝為淫羊藿葉的粗粉中加入2 7倍量水，浸泡2 h后，煎煮3次，每次I h ;淫羊藿提取液上A B - 8型大孔吸附樹脂柱分離，再用乙酸乙酯、正丁醇萃取。
【文檔編號】A61K36/296GK104435047SQ201410739922
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月8日 優(yōu)先權日:2014年12月8日
【發(fā)明者】敖云霞 申請人:敖云霞