針對dd3基因的小干擾rna及其表達載體構(gòu)建與應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種針對DD3基因的小干擾RNA及其表達載體構(gòu)建與應用。其正義鏈序列為SEQ ID NO.1；反義鏈序列為SEQ ID NO.2；并成功構(gòu)建了pGLV3/H1/GFP+Puro Vector-DD3-siRNA真核表達載體。本發(fā)明將成功構(gòu)建的真核表達載體感染LNCaP細胞及RWPE-1細胞，結(jié)果顯示，DD3基因被干擾后能明顯降低LNCaP細胞增殖速率，而對RWPE-1細胞無明顯影響；將成功構(gòu)建的真核表達載體注射到前列腺癌動物實體瘤中，結(jié)果顯示，DD3基因被干擾后能有效抑制LNCaP細胞實體瘤的增殖。因此，通過siRNA干擾DD3基因在前列腺癌細胞中的表達，從而抑制了癌細胞的增殖。
【專利說明】針對DD3基因的小干擾RNA及其表達載體構(gòu)建與應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及小干擾RNA技術，特別涉及一種針對DD3基因的小干擾RNA及其表達 載體構(gòu)建與應用。具體地說，涉及一種抗前列腺癌的小干擾RNADD3基因序列及重組慢病毒 表達載體，提供了一種重組慢病毒表達載體介導的抗前列腺癌DD3小干擾RNA基因，具有靶 向性抑制前列腺癌細胞增殖、侵襲、遷移及動物瘤體的生長，從而達到抑制前列腺癌的發(fā)展 與轉(zhuǎn)移的作用。

【背景技術】
[0002] 前列腺癌（carcinoma of prostate)已成為美國男性最常見的腫瘤。在美國男性 腫瘤中的致死率中排第二位，僅次于肺癌。在歐盟排第三，次于肺癌和大腸癌。在我國，隨 著社會人口的老齡化出現(xiàn)，前列腺癌的發(fā)病率也逐年增高。因此，對前列腺癌分子發(fā)病機制 及前列腺癌診治新技術、新療法的研究尤為重要和迫切。
[0003] 長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA，LncRNA)，是指那些由DNA轉(zhuǎn)錄卻并不翻 譯成蛋白的RNA,近來還有研究發(fā)現(xiàn),在一些腫瘤組織中，LncRNA有著過表達或者低表達的 現(xiàn)象。提示在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，它們可能發(fā)揮著重要的作用。細胞增殖、分化以及凋 亡的異常導致腫瘤的發(fā)生，而LncRNA作為一個重要調(diào)控單位，參與調(diào)控相關基因的表達， 它們的異常表達有可能引起這些現(xiàn)象的發(fā)生。
[0004] DD3 (differential display code 3)是一種長鏈非編碼 RNA (>NR_015342. 1)，又 稱為前列腺癌基因3 (prostate cancer gene 3, PCA3)，是近年來發(fā)現(xiàn)的前列腺癌高度特異 性基因，是一個臨床潛力很高的前列腺癌標志物。DD3基因僅在前列腺上皮細胞中表達，具 有較高的腫瘤特異性。DD3基因定位于9q21 - 22染色體上，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。 目前國外更多研究表明DD3基因的特異性區(qū)域位于外顯子4中。前列腺癌患者外周血中的 DD3基因表達水平較正常對照組升高約34倍。前列腺腺上皮細胞產(chǎn)生的分泌物、脫落的前 列腺腺上皮細胞經(jīng)過導管排泄到尿道，前列腺癌細胞同樣可以排到尿道內(nèi)并且可以檢測出 來，前列腺按摩后尿液標本可以檢測到DD3的高表達。而尿液沉淀物能夠包含所有細胞和 細胞碎片，更能準確檢測DD3的表達。DD3可作為一種潛在的前列腺癌標志物應用到診斷 中，甚至在不久的將來有可能會應用到前列腺癌的治療中。
[0005] 小干擾RNA(small interference RNA, siRNA)是生物體內(nèi)抑制特定基因表達的一 種現(xiàn)象，它是指當細胞內(nèi)存在與內(nèi)源性mRNA編碼區(qū)內(nèi)同源的雙鏈RNA時，該mRNA發(fā)生降解 而導致基因表達沉默的現(xiàn)象。由于siRNA能抑制特定基因的表達，應用siRNA進行基因治 療有非常廣闊的臨床應用前景。目前，各大生物技術公司都在積極開發(fā)這類藥物，并即將進 入臨床試驗階段。原癌基因是細胞基因組中的正常組成成分，當受到多種因素的作用使其 發(fā)生變異時，激活成為癌基因，癌基因與細胞異常增殖及癌的發(fā)生有關?？梢詰胹iRNA技 術來抑制癌基因的mRNA，從而抑制腫瘤生長，同時，還可通過siRNA技術促進癌細胞凋亡、 調(diào)控細胞周期以及抑制血管生成等方面來治療癌癥。盡管RNAi技術作為腫瘤基因治療的 新型工具仍然存在著許多急待解決的問題，如怎樣提高腫瘤細胞的靶向性等等。但隨著科 學工作者對RNAi研究的不斷深入，siRNA技術將會成為一種非常有前景的腫瘤治療手段。
[0006] 慢病毒（Lentivirus)載體是以HIV-I (人類免疫缺陷I型病毒）為基礎發(fā)展起來 的基因治療載體。區(qū)別一般的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，它對分裂細胞和非分裂細胞均具有感染能 力。該載體可以將外源基因有效地整合到宿主染色體上，從而達到持久性表達。在感染能 力方面可有效地感染神經(jīng)元細胞、肝細胞、心肌細胞、腫瘤細胞、內(nèi)皮細胞、干細胞等多種類 型的細胞，從而達到良好的的基因治療效果，在美國已經(jīng)開展了臨床研究，效果非常理想， 因此具有廣闊的應用前景。
[0007] 因此，如果能利用RNAi技術，涉及特異性針對DD3基因的siRNA，徹底研究清楚 DD3和前列腺癌轉(zhuǎn)移的組織間的關系，將會為前列腺癌癌相關的癌癥的治療提供一種有益 的途徑。因此，本發(fā)明的技術目的在于利用RNAi技術研究清楚DD3與前列腺癌的關系。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了克服現(xiàn)有技術的缺點與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種針對DD3基因 的siRNA。本發(fā)明通過大量篩選和實驗工作得到針對DD3基因的siRNA。
[0009] 本發(fā)明的另一目的在于提供所述的針對DD3基因的SiRNA的編碼基因。
[0010] 本發(fā)明的另一目的在于提供一種載有針對DD3基因的siRNA重組表達載體。
[0011] 本發(fā)明的再一目的在于提供所述的SiRNA及載有針對DD3基因的SiRNA重組表達 載體的應用。
[0012] 本發(fā)明的目的通過下述技術方案實現(xiàn)：一種針對DD3基因的siRNA(本發(fā)明的名 稱為 DD3-siRNA)，所述的 siRNA 的正義鏈序列為：5' -GCUCAGGUGCUUUCACUAAUG-3'（SEQ ID NO. 1);反義鏈序列為：5'-CAUUAGUGAAAGCACCUGAGC-3'（SEQ ID N0.2);
[0013] 本發(fā)明提供上述的針對DD3基因的siRNA的編碼基因，其核苷酸序列分別為： 5' -GCTCAGGTGCTTTCACTAATG-3'（SEQ ID NO. 3)，或 5' -CATTAGTGAAAGCACCTGAGC-3'（SEQ ID NO. 4)；
[0014] 上述siRNA經(jīng)Blast Search檢索確認與DD3以外的人類已知基因序列無同源性；
[0015] siRNA是一種段片段雙鏈RNA分子，能夠以同源互補序列的mRNA為靶目標降解特 定的mRNA;
[0016] 上述siRNA干擾的靶序列位于DD3基因的mRNA編碼序列的第2368到2388個堿 基之間，即 5'-GCUCAGGUGCUUUCACUAAUG-3' ；
[0017] 進一步，本發(fā)明提供上述siRNA的siRNA重組表達載體；優(yōu)選地，所述表達載體為 原核表達載體或真核表達載體，更優(yōu)選地，所述表達載體為真核表達載體，最優(yōu)選地，所述 真核表達載體為重組慢病毒表達載體；
[0018] 上述siRNA的siRNA重組表達載體；所述表達載體為pGLV3/Hl/GFP+Puro Vector, 購自上海吉瑪制藥技術有限公司；構(gòu)建得到的慢病毒表達載體為pGLV3/Hl/GFP+Puro Vector-DD3-siRNA ；
[0019] 本發(fā)明提供上述siRNA及siRNA重組表達載體在抑制DD3基因表達中的應用。
[0020] 本發(fā)明提供上述siRNA及siRNA重組表達載體在制備治療前列腺癌藥物中的應 用。
[0021] 將上述SiRNA重組表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞，優(yōu)選地，所述宿主細胞為原核細胞或 真核細胞，更優(yōu)選地，所述宿主細胞為真核細胞，更優(yōu)選地，所述宿主細胞為哺乳動物細胞， 最優(yōu)選地，所述宿主細胞為前列腺癌細胞LNCaP或RWPE-I細胞（人正常前列腺上皮細胞 RWPE-1)。
[0022] 換言之，在本發(fā)明中，分別針對在前列腺癌高轉(zhuǎn)錄的DD3基因的靶位點，委托上海 吉瑪制藥技術有限公司化學合成一段siRNA序列，并構(gòu)建其慢病毒表達載體。本發(fā)明的研 究發(fā)現(xiàn)，通過感染這種siRNA片段，可以敲除DD3mRNA在前列腺癌細胞系中的內(nèi)源性RNA高 表達，從而抑制前列腺癌細胞的增殖、侵襲。因此，本發(fā)明首次證實DD3mRNA表達的敲除與 前列腺癌細胞增殖、侵襲以存在直接對應的關系，DD3基因完全可以作為前列腺癌的治療靶 點，本發(fā)明的siRNA也有望作為一種生物治療技術應用到前列腺癌的治療中。
[0023] 本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術具有如下的優(yōu)點及效果：
[0024] (1)本發(fā)明使用RNA干擾技術，成功獲得針對DD3基因的siRNA，所述siRNA與載 體pGLV3/Hl/GFP+Puro Vector連接，與包裝質(zhì)粒、包膜質(zhì)粒共感染LNCaP細胞能有效地干 擾DD3基因的表達，通過RT-PCR檢測，在穩(wěn)定干擾DD3的細胞系中，DD3基因的干擾效率達 到（80. 25 士 0· 96) %。
[0025] (2)本發(fā)明將成功構(gòu)建的針對DD3_siRNA慢病毒表達載體感染前列腺癌LNCaP細 胞及正常前列腺上皮細胞RWPE-I，結(jié)果顯示，DD3基因被干擾后能明顯降低LNCaP細胞增殖 速率，而對前列腺上皮細胞RWPE-I無明顯影響。
[0026] (3)本發(fā)明將成功構(gòu)建的針對DD3_siRNA慢病毒表達載體注射到前列腺癌動物實 體瘤中，結(jié)果顯示，DD3基因被干擾后能有效抑制LNCaP細胞實體瘤的增殖。
[0027] (4)本發(fā)明明確了DD3基因是一種癌基因，并且通過siRNA干擾DD3基因在前列腺 癌細胞中的表達，從而抑制了癌細胞的增殖。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1是RT-PCR檢測前列腺癌細胞LNCaP，PC-3M，DU145,人正常前列腺上皮細胞 RWPE-I共4株細胞系中DD3mRNA的表達水平的結(jié)果圖。
[0029] 圖2是重組DD3_siRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建的結(jié)果圖；其中，圖2A是經(jīng)測序獲 得正確的DD3-siRNA的編碼序列；圖2B是慢病毒滴度測定圖；圖2B中ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ'ΙΟ- 4 分別代表慢病毒滴度稀釋倍數(shù)。
[0030] 圖3是轉(zhuǎn)染DD3-siRNA后，LNCaP細胞內(nèi)DD3mRNA的相對表達水平的結(jié)果圖。
[0031] 圖4是轉(zhuǎn)染DD3-siRNA后細胞的增殖抑制率的結(jié)果圖；其中。圖4A是DD3-siRNA 對細胞株LNCaP細胞增殖的影響的結(jié)果圖；圖4B是DD3-siRNA對細胞株RWPE-I細胞增殖 的影響的結(jié)果圖。
[0032] 圖5是轉(zhuǎn)染DD3-siRNA后細胞侵襲遷移實驗結(jié)果圖；其中，圖5A是DD3-siRNA對 LNCaP細胞遷移實驗照片及柱狀圖；圖5B是DD3-siRNA對LNCaP細胞侵襲實驗照片及柱狀 圖；圖5C是DD3-siRNA對RWPE-I細胞遷移實驗照片及柱狀圖；圖是DD3-siRNA對RWPE-I 細胞侵襲實驗照片及柱狀圖。
[0033] 圖6是轉(zhuǎn)染DD3_siRNA后對動物實體瘤生長的影響的結(jié)果圖；其中，圖6A是動物 瘤體生長曲線圖；圖6B是動物瘤體拍照圖。

【具體實施方式】
[0034] 下面結(jié)合實施例及附圖對本發(fā)明作進一步詳細的描述，但本發(fā)明的實施方式不限 于此。
[0035] 下述實驗方法如無特別說明，均為常規(guī)方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均 可容易地從商業(yè)公司獲取。
[0036] 實施例lDD3mRNA高表達細胞系的篩選
[0037] RT-PCR及所采用的引物如下：
[0038] DD3 上游引物 F :5'-CAACAGCAGGACCCAACGCA-3' ；
[0039] DD3 下游引物 R:5' -AGCAACAGAGCAGAGAGAG-3' ；
[0040]產(chǎn)物大?。?00bp ;
[0041] 18S 上游引物 F :5' -CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3' ；
[0042] 18S 下游引物 R :5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3' ；
[0043]產(chǎn)物大?。?75bp;
[0044] RT (逆轉(zhuǎn)錄）的條件：各取 5 μ g 細胞總 RNA 用Supeicript?First-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit (Invitrogen 公司產(chǎn)品）完成 cDNA 第一鏈合成。
[0045] PCR條件：取5 μ L逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA第一鏈作為模板，20 μ L PCR反應體系：模 板5 μ L、上游引物0· 5 μ L、下游引物0· 5 μ L、2XSYBR Green PCR Master Mix 10 μ UddH2O 4. 0μ L ;PCR反應條件為：95°C預變性5min ;95°C變性15s，65°C退火15s，72°C延伸32s，循 環(huán)數(shù) 40cycles;72°C延伸 lOmin。運用 ABI PRISlVP;7500Sequence Detection System 進 行檢測。
[0046] 利用qRT_PCR(實時熒光定量RT-PCR)的方法，檢測DD3mRNA高表達細胞系。在 LNCaP，PC-3M(人前列腺癌細胞系PC-3M)，DU145(前列腺癌細胞DU145)三種腫瘤細胞系 及人正常前列腺上皮細胞RWPE-I中，上述細胞均為商業(yè)化的細胞系，LNCaP細胞系DD3的 mRNA表達量較其它細胞系高（見圖1)。故選擇其作為干擾RNA的研究對象。
[0047] 實施例2重組DD3_siRNA慢病毒表達載體的構(gòu)建
[0048] 分別針對該DD3基因的靶位點，委托上海吉瑪制藥技術有限公司化學合成所述針 對DD3基因的siRNA的編碼基因，其核苷酸序列如下：
[0049] 5'-GCTCAGGTGCTTTCACTAATG-3'（SEQ ID NO. 3);
[0050] 根據(jù)shRNA設計原則，將上述siRNA設計成發(fā)夾shRNA插入片段以使其插入載體 中從而穩(wěn)定表達siRNA,編碼發(fā)夾shRNA的shDNA的核苷酸序列如下：
[0051] shRNA 的正義鏈：5' -GATCCGCTCAGGTGCTTTCACTAATGTTCAAGAGACATTAGTGAAAGCACC TGAGCTTTTTTG-3' ；（SEQ ID NO. 9)
[0052] shRNA 的反義鏈：5' -AATTCAAAAAAGCTCAGGTGCTTTCACTAATGTCTCTTGAACATTAGTGAA AGCACCTGAGCG-3' ；（SEQ ID NO. 10)
[0053] 上述發(fā)夾shRNA插入片段包含有21個堿基對的siRNA作用片段；shRNA模板中的 loop結(jié)構(gòu)選用了 TTCAAGAGA以避免形成終止信號；shRNA的轉(zhuǎn)錄終止序列采用T6結(jié)構(gòu)（序 列為TTTTTTG)。正義鏈模板的5'端添加了 GATCC，與BamHI酶切后形成的粘端互補；反義 鏈模板的5'端添加了 AATTC，與EcoRI酶切后形成的粘端互補，3'端引入接頭序列G。
[0054] 并將上述發(fā)夾shRNA定向連接至用BamHI和EcoRI雙酶切后的pGLV3/Hl/ GFP+Puro Vector載體質(zhì)粒上，克隆至DH5α感受態(tài)細胞轉(zhuǎn)化，將重組質(zhì)粒、包裝質(zhì)粒、包膜 質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293Τ細胞（293Τ細胞是表達SV40大T抗原的人腎上皮細胞系）72小時后，收 集病毒并測定病毒的滴度。
[0055]成功構(gòu)建 DD3-siRNA 的慢病毒表達載體 pGLV3/Hl/GFP+Puro Vector-DD3-siRNA。 經(jīng)測序獲得正確的DD3-siRNA的編碼序列（見圖2A)，收集病毒，測到病毒滴度為I X IO9TU/ mL(見圖 2B)。
[0056] 實施例3感染DD3-siRNA后，細胞株內(nèi)DD3的mRNA表達水平。
[0057] RT-PCR反應以及引物同實施例1。
[0058] NC(negative control,購自上海吉瑪制藥技術有限公司，為通用陰性對照，貨號 為A08DZ)。在本實驗中，該序列的轉(zhuǎn)染不會敲降DD3以及任何其他的基因，從而起到陰性對 照的作用。DD3-siRNA感染細胞后，DD3mRNA的表達量為8. 23%士 0. 21%，表明這種siRNA 片段都能夠有效的降低DD3mRNA表達水平（見圖3)。
[0059] 實施例4DD3_siRNA對細胞株增殖的影響
[0060] 將LNCaP細胞以每孔I X IO4個細胞接種96孔板，分別感染DD3-siRNA、NC及設立 空白對照組（control)，然后繼續(xù)培養(yǎng)約24小時、48小時、72小時，每孔加50 μ L I XMTT 溶液，置入孵箱孵育4h，使MTT還原為甲臢。吸出上清液，每孔加150 μ L DMSO (二甲基亞 砜），使甲臢溶解，用平板搖床搖勻。用酶標儀在490nm處測每孔的光密度，進而計算細胞 增殖抑制率。增殖抑制率（％) = [(空白對照組OD值-實驗組OD值）/空白對照組OD 值]X100%。
[0061] DD3-siRNA感染細胞（24、48、72小時）后，能有效抑制LNCaP細胞增殖，其增殖抑 制率分別為（12 士 3. 6%、35 士 2. 1%、59 士 6. 3% )(見圖4A)。而對人正常前列腺上皮細 胞RWPE-I作用不明顯（見圖4B)。
[0062] 實施例5DD3_siRNA對細胞株侵襲、遷移的影響
[0063] 用預冷的DMEM/F12 (Gibco公司）以1:3的體積比稀釋Matrigel,取40 μ L加入 預冷的Transwell小室中，37°C孵育2h使Matrigel凝固。吸走小室中多余的液體，并在上 室、下室分別加入100 μ L、600 μ L DMEM/F12, 37°C平衡過夜。細胞轉(zhuǎn)染第二天，計數(shù)I X IO5 個細胞，用100 μ L DMEM/F12培養(yǎng)基重懸，加入Transwell小室上室，在下室加入600 μ L完 全培養(yǎng)基。在37°C，5% (v/v)C02孵育48小時后，取出小室，用棉簽擦去上室的細胞，倒置 顯微鏡下觀察小室中細胞并拍照。
[0064] Transwell檢測表明降低表達DD3_siRNA后細胞株侵襲、遷移能力明顯低于轉(zhuǎn)染 陰性對照組RNA的細胞株（分別見圖5A、圖5B)，說明降低DD3-siRNA可抑制腫瘤細胞的惡 性度以及腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移能力。而DD3-siRNA對人正常前列腺上皮細胞RWPE-I作用不明 顯（分別見圖5C、圖OT)。
[0065] 實施例6DD3_siRNA對動物實體瘤生長的影響
[0066] 雄激素BALB/c裸小鼠（購自廣東省實驗動物中心）15只，體重量18?20g，對 數(shù)生長期LNCaP細胞，胰酶消化，洗滌，臺盼藍染色計數(shù)，調(diào)整濃度為I X IO7個/mL，每次 取0. ImL,與基質(zhì)Matrigel混合后，分別皮下注射到6?8周雄性裸鼠的肋腹部，待瘤體 生長到約120mm3,裸小鼠隨機分成空白對照組（PBS，100 μ L)，DD3-siRNA(500nM)組、NC組 (16 μ g)，分別皮下注射，觀察瘤體生成情況，并記錄生長曲線。
[0067] 給裸鼠分別注射不同劑量的PBS、DD3_siRNA、NC后，記錄瘤體生長曲線，繼續(xù)飼養(yǎng) 至18天，無一裸鼠死亡，斷頭處死，取出瘤體，并計算瘤體平均體積?？瞻讓φ战M瘤體平均 體積2300. 46 士 163mm3、NC組瘤體平均體積1003. 60 士 135mm3、DD3-siRNA組瘤體平均體 積509. 74 士 56mm3,說明降低表達DD3mRNA后可抑制實體瘤的生長（圖6A、B)。
[0068] 所述的PBS (磷酸鹽緩沖液）是10mM、pH7.2?7.4的PBS。
[0069] 上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
【權利要求】
1. 一種針對DD3基因的siRNA，其特征在于：所述的siRNA的正義鏈序列為SEQ ID NO. 1 ;反義鏈序列為SEQ ID NO. 2 ; 所述的siRNA干擾的靶序列位于DD3基因的mRNA編碼序列的第2368到2388個堿基 之間。
2. 根據(jù)權利要求1所述的siRNA，其特征在于：所述的針對DD3基因的siRNA的編碼基 因，其核苷酸序列分別為：SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 4。
3. -種含有權利要求1或2所述的siRNA的重組表達載體。
4. 根據(jù)權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于：所述的表達載體為原核表達載 體或真核表達載體。
5. 根據(jù)權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于：所述的表達載體為真核表達載 體。
6. 根據(jù)權利要求3所述的重組表達載體，其特征在于：所述的重組表達載體為pGLV3/ Hl/GFP+Puro Vector-DD3-siRNA。
7. 權利要求1或2所述的siRNA在抑制DD3基因表達中的應用。
8. 權利要求3?6任一項所述的重組表達載體在抑制DD3基因表達中的應用。
9. 權利要求1或2所述的siRNA在制備治療前列腺癌藥物中的應用。
10. 權利要求3?6任一項所述的重組表達載體在制備治療前列腺癌藥物中的應用。
【文檔編號】A61K31/713GK104357451SQ201410719747
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年12月2日 優(yōu)先權日:2014年12月2日
【發(fā)明者】何金花 申請人:廣州市番禺區(qū)中心醫(yī)院