運載阿霉素的靶向性脂質(zhì)二氧化硅復合體及制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種運載阿霉素的靶向性脂質(zhì)/二氧化硅復合體的制備方法，首先二氧化硅顆粒包埋阿霉素藥物；然后靶向性脂質(zhì)體的制備；最后將上述兩種溶液混合，脂質(zhì)與二氧化硅治療比為1:10，后經(jīng)漩渦震蕩5分鐘后，靜止放置24小時，經(jīng)12000rpm離心后除去上層游離的脂質(zhì)層，將沉淀部分冷凍干燥，既得靶向性脂質(zhì)/SiO2復合體。本發(fā)明提供一種具有靶向指向作用的穩(wěn)定性好、生物相容性高、緩釋時間長、載藥量大、藥物包裹效率高的包覆方法。
【專利說明】運載阿霉素的靶向性脂質(zhì)二氧化硅復合體及制備和應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明是復合型醫(yī)藥材料制備和應用，涉及一種包埋藥物的顆粒型材料，是脂質(zhì)體技術與無機顆粒載體技術的交叉應用。

【背景技術】
[0002]脂質(zhì)體作為藥物載體，具有進入體內(nèi)被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬而激活機體的自身免疫功能，改變被包封藥物的體內(nèi)分布、使藥物在肝、脾、肺和骨髓等組織器官中蓄積、從而提高藥物的治療指數(shù)、減少藥物治療劑量和降低藥物的毒性。然而，脂質(zhì)體體系是由磷脂、膽固醇等組成的熱力學不穩(wěn)定體系，弱穩(wěn)定性限制了它的使用，影響其作為藥物載體的應用。脂質(zhì)體在存儲期間，磷脂易氧化水解，膜層易相變，小粒徑脂質(zhì)體易相互聚集融合，包裹其中的藥物易發(fā)生泄漏。二氧化硅是一種具有良好生物兼容性的材料，通過控制前體硅酸四乙酯水解反應制備不同形貌的二氧化硅納米粒子(如介孔二氧化硅和二氧化硅空心球)，實現(xiàn)作為藥物載體的用途。
[0003]阿霉素作為臨床使用頻繁的化療藥物，具有抗癌譜廣、化療指數(shù)高，其副作用存在有骨髓移植、惡心、嘔吐、脫發(fā)、高熱等癥狀，累計劑量大時會發(fā)生心肌壞死甚至充血性心力衰竭。使用二氧化硅材料包埋阿霉素藥物形成的納米藥物具有緩釋功能，延長藥物作用時間，增加在體內(nèi)的半衰期，保護被包埋的藥物分子不受體內(nèi)酶的破壞，增強生物相容性等特點。靶向性脂質(zhì)體是指在脂質(zhì)體表面聯(lián)接識別分子(如Lyp-1、RPARPAR、RGERPPR和ang1prep-2等)，通過識別分子特異性專一地與靶細胞表面的互補相互作用，將脂質(zhì)體轉運到靶區(qū)釋放藥物。
[0004]本發(fā)明解決的技術問題是靶向脂質(zhì)體載體穩(wěn)定性弱，易氧化的問題。S12作為內(nèi)殼層，靶向脂質(zhì)體作為外殼層復合包載阿霉素的途徑，提供一種具有靶向指向作用的穩(wěn)定性好、生物相容性高、緩釋時間長、載藥量大、藥物包裹效率高的包覆方法，同時工藝簡單、成本低的優(yōu)點。復合結構克服脂質(zhì)體不穩(wěn)定的特點，同時又能發(fā)揮靶向性脂質(zhì)體細胞靶向的功能。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明針對脂質(zhì)體包封藥物穩(wěn)定性的不足，使用硅酸四乙酯水解后形成的二氧化硅殼層包載水溶性藥物分子，而后靶向性脂質(zhì)分子物理吸附于藥物顆粒表層形成復合結構，并使其具有特定的組織靶向性。
[0006]一種運載阿霉素的靶向性脂質(zhì)/ 二氧化硅復合體的制備方法，其特征在于，具體步驟如下:
(I) 二氧化硅顆粒包埋阿霉素藥物:
將10體積的環(huán)己烷、2.2?2.6體積的聚乙二醇對異辛基苯基醚和2.0?2.4體積的正己醇混合均勻，向混勻后的混合液中加入0.5?I體積、濃度為10-20mg/mL的氟化鈉溶液，攪拌均勻后形成反乳相微乳液；向該反相微乳液中加入0.1?0.13體積、0.01?0.05mol/L的阿霉素溶液和0.13?0.27體積的正硅酸乙酯(TEOS)，反應完全后得到包埋阿霉素的二氧化硅納米顆粒(DOX-SiNP)微乳液體系；在破乳前加入0.02?0.05的氨丙基三乙氧基硅烷，室溫下攪拌至反應完全；然后加入乙醇破乳，離心收集納米顆粒，洗滌后制得包埋藥物阿霉素的Si02m米顆粒；
(2)革El向性脂質(zhì)體的制備:
將腫瘤細胞穿膜肽溶于PH7.0的2毫升PBS溶液中，取馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復合物(DSPE-PEG-MAL)，其摩爾當量為腫瘤細胞穿膜肽的0.8倍，溶于0.5毫升二甲基甲酰胺(DMF)，加入多肽水溶液中，超聲去除氣泡，攪拌反應I小時至DSPE-PEG-Mal反應完全，透析，截留分子量3500Da，透析介質(zhì)為水，去除過量的腫瘤細胞穿膜肽和DMF，冷凍干燥，得到腫瘤細胞穿膜肽-PEG-DSPE材料；將處方的摩爾組成為氫化大豆磷脂/膽固醇/mPEG-DSPE/RGERPPR-PEG-DSPE=55:45:2:1,將各組分用氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，加水溶液至脂質(zhì)膜中，超聲分散并在水浴60度旋轉震蕩，得脂質(zhì)體混懸液；擠壓過50nm孔徑大小的碳酸脂膜，得到粒徑大小均勻的靶向性脂質(zhì)體；
(3)靶向性脂質(zhì)/S12復合體的制備:
將上述兩種溶液混合，脂質(zhì)與二氧化硅治療比為1:10，后經(jīng)漩渦震蕩5分鐘后，靜止放置24小時，經(jīng)12000rpm離心后除去上層游離的脂質(zhì)層，將沉淀部分冷凍干燥，既得靶向性脂質(zhì)/3102復合體。
[0007]所述的腫瘤靶向細胞穿膜肽為C-RGERPPR，Lyp-1，RPARPAR，RGERPPR，cRGD，NGR,ang1prep-2中的一種或其組合。
[0008]一種運載阿霉素的靶向性脂質(zhì)/ 二氧化硅復合體，其特征在于，根據(jù)上述任一權利要求所述方法制備得到。
[0009]一種運載阿霉素的靶向性脂質(zhì)/ 二氧化硅復合體針對腦膠質(zhì)瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌治療的應用。
[0010]本發(fā)明解決的技術問題是克服靶向性脂質(zhì)體穩(wěn)定性弱，易氧化的問題。靶向脂質(zhì)體復合二氧化硅包載阿霉素，提供一種具有靶向指向作用的穩(wěn)定性好、生物相容性高、緩釋時間長、載藥量大、藥物包裹效率高的包覆方法，同時工藝簡單、成本低的優(yōu)點
本發(fā)明有如下優(yōu)勢:
該方法使用硅酸四乙酯水解后的穩(wěn)定S12S內(nèi)殼層，增強藥物的穩(wěn)定性，同時具有藥物緩釋效果；靶向性脂質(zhì)體作為外殼層包覆于S12ODOX外層，賦予特異性的細胞靶向性。
[0011]操作簡便，成本低，容易工業(yè)化實現(xiàn)；
本復合結構具有高生物相容性，也可包裹CdS量子點等發(fā)光材料，輕易實現(xiàn)靶向組織熒光成像。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0012]圖1為實施例1所得的TEM照片。
[0013]圖2為實施例3所得的TEM照片。
[0014]圖3為實施例5所得的TEM照片。
[0015]圖4為實施例1，3，5所得的藥物釋放曲線。
[0016]其中方框為S12ODox,圓圈為mPEG-DSPE/Si02@Dox, 三角為細胞穿膜月太-PEG-DSPE/S12ODox。
[0017]圖5為實施例2所得的體外靶向分布數(shù)據(jù)圖片。
[0018]圖6為實施例4所得的體外靶向分布數(shù)據(jù)圖片。
[0019]圖7為實施例6所得的體外靶向分布數(shù)據(jù)圖片。
[0020]圖8為實施例1，2，3載藥顆粒的細胞抑制曲線。
[0021]其中黑色方框為被包覆的Dox，左斜線方框為S12ODox,右斜線方框為mPEG-DSPE/Si02iDox,交叉線方框為細胞穿膜肽-PEG-DSPE/S12ODox。

【具體實施方式】
[0022]以下通過具體的實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步描述。以下的實施例是對本發(fā)明的進一步說明，而不限制本發(fā)明的范圍。
[0023]實施例1:
(1)S12包埋阿霉素:將環(huán)己烷5.5g、曲拉通TX100 2g和正己醇1.6g混合均勻，向混勻后的混合液中加入10yL 10mg/mL的氟化鈉溶液作為分散相，攪拌均勻后形成反相微乳液；向該反相微乳液中加入80 μ L 0.05mol/L的阿霉素溶液和100 μ L正娃酸乙醋，反應24h后得到DOX-SiNP微乳液體系；
(2)功能化基團的修飾S12:采用反相微乳液體系中功能化基團同步修飾方法在上述制得的DOX-SiNP表面修飾氨基基團，即在上述反應24h后的DOX-SiNP微乳液體系中加入20 μ L的APTES，室溫攪拌繼續(xù)反應24h后，加入乙醇破乳，離心收集其中的納米顆粒，并依次用乙醇、水洗滌收集的納米顆粒，冷卻干燥后制得包埋阿霉素的表面氨基化的二氧化娃納米顆粒(Si02@Dox)，其形貌照片如圖1所示
實施例2:
將實施例1中的S12ODox配置成為10mg/ml的乙醇分散液，將FITC-APTES配置成為0.lmg/ml的乙醇溶液，將上述溶液等比例混合，反應4h后離心分離去除游離的FITC-APTES，可FITC-APTES修飾S12ODox表面用于激光共聚焦成像及流式細胞計數(shù)。
[0024]實施例3:
一種將實施例1制得的S12ODox納米粒子與普通長循環(huán)脂質(zhì)體復合。具體步驟為:將實施例1制備得到的S12ODox用超凈水離心清洗一次，將其配置成2mg/ml的超純水分散液；將mPEG-DSPE用氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，加超純水溶液至脂質(zhì)膜中，超聲分散并在水浴60度旋轉震蕩，得脂質(zhì)體混懸液；擠壓過50nm孔徑大小的碳酸脂膜，得到粒徑大小均勻的脂質(zhì)體，配置成為0.2mg/ml的超純水分散液；分別取上述溶液各Iml，1:1等比例混合，靜止放置24h ;使用12000rpm離心后除去溶液層，將沉淀層冷凍干燥，得到復合長循環(huán)脂質(zhì)體的S12ODox納米顆粒(mPEG-DSPE/Si02@Dox)，其形貌如圖2所示。
[0025]實施例4:
一種將實施例2制得的熒光性S12ODox納米粒子與普通長循環(huán)脂質(zhì)體復合。具體步驟為:將實施例2制備得到的熒光性S12ODox用超凈水離心清洗一次，將其配置成2mg/ml的超純水分散液；將mPEG-DSPE用氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，加超純水溶液至脂質(zhì)膜中，超聲分散并在水浴60°C旋轉震蕩，得脂質(zhì)體混懸液；擠壓過50nm孔徑大小的碳酸脂膜，得到粒徑大小均勻的脂質(zhì)體，配置成為0.2mg/ml的超純水分散液；分別取上述溶液各Iml，1:1等比例混合，靜止放置24h ;使用12000rpm離心后除去溶液層，將沉淀層冷凍干燥，得到熒光性復合長循環(huán)脂質(zhì)體的S12ODox納米顆粒(mPEG-DSPE/Si02@Dox)。
[0026]實施例5:
一種將實施例1制得的S12ODox納米粒子與革E向性長循環(huán)脂質(zhì)體(RGERPPR-PEG-DSPE)復合。具體步驟為:將實施例1制備得到的S12ODox用超凈水離心清洗一次，將其配置成lmg/ml的分散液；將處方組成為氫化大豆磷脂/膽固醇/ mPEG-DSPE/RGERPPR-PEG-DSPE=55:45:2:1, molimol的脂質(zhì)用氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，加水溶液至脂質(zhì)膜中，超聲分散并在水浴60度旋轉震蕩，得脂質(zhì)體混懸液；擠壓過50nm孔徑大小的碳酸脂膜，得到粒徑大小均勻的脂質(zhì)體，配置成為0.lmg/ml的水溶液；分別取上述溶液各Iml ,1:1等比例混合，靜止放置24h ;使用12000rpm離心后除去溶液層，將沉淀層冷凍干燥，得到靶向性長循環(huán)脂質(zhì)體復合的S12ODox納米顆粒(RGERPPR-PEG-DSPE/S12ODox)其形貌如圖3所示。
[0027]實施例6:
一種將實施例2制得的S12ODox納米粒子與革E向性長循環(huán)脂質(zhì)體(RGERPPR-mPEG-DSPE)復合。具體步驟為:將實施例2制備得到的熒光性S12ODox粒子用超凈水離心清洗一次，將其配置成2mg/ml的分散液；將處方組成為氫化大豆磷脂/膽固醇 / mPEG-DSPE / RGERPPR-PEG-DSPE= 55:45:2:1，mol:mol)的脂質(zhì)用氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，加超純水溶液至脂質(zhì)膜中，超聲分散并在水浴60度旋轉震蕩，得脂質(zhì)體混懸液；擠壓過50nm孔徑大小的碳酸脂膜，得到粒徑大小均勻的脂質(zhì)體，配置成為0.2mg/ml的水溶液；分別取上述溶液各Iml ,1:1等比例混合，靜止放置24h ;使用12000rpm離心后除去溶液層，將沉淀層冷凍干燥，得到靶向性長循環(huán)脂質(zhì)體復合的熒光S12ODox納米顆粒(RGERPPR-PEG-DSPE/S12ODox)。
[0028]納米粒子的DOX釋放行為考察:將實施例1，3，5制得的S12ODox, mPEG-DSPE/S12ODox 和 RGERPPR-PEG-DSPE/S12ODox，溶于 ImL PBS(pH 7.4)中，然后裝于透析袋中于37°C、100r/min振蕩的條件下，在9mL PBS(pH 7.4)中進行透析。每隔一段時間取出200 μ L透析液，同時補充200 μ L PBS以維持透析液的總體積不變。用紫外-可見分光光度計檢測透析液中DOX的累積釋放量，檢測波長為570nm，檢測結果以時間-累積釋放率下的釋放曲線表示，如圖4所示。由圖4可見，在前8小時內(nèi)，累積釋放率與時間呈近似線性的變化，S12ODOX釋放速度較快，累積釋放率為15%，mPEG-DSPE/S12ODox和RGERPPR-PEG-DSPE/S12ODox累積釋放率達到8%和7.5%。在8小時至32小時時間段內(nèi)，釋放速度相對減緩，Si02@D0X，mPEG-DSPE/S12ODox 和 RGERPPR-PEG-DSPE/S12ODox 累積釋放率達到18%，14%和10.7%ο在32小時至126小時時間段內(nèi)，釋放速度進一步減緩mPEG-DSPE/S12ODox 和 RGERPPR-PEG-DSPE/S12ODox 累積釋放率達到 19.8 %，14.8% 和10.9%。
[0029]納米粒子的體外靶向性考察:在無血清培基中(200 μ L)，將實施例2，4，6制得的具有熒光發(fā)光性能 Si02@D0X，mPEG-DSPE/Si02@D0X，和 RGERPPR-PEG-DSPE/S12ODox 分別與靶向性細胞U87mg (105/mL)在0)2孵育箱下25°C孵育I hour ;然后用SOOyL的PBS溶液液離心清洗細胞兩次，將非特異性吸附在細胞表面的納米顆粒清除；第二次離心后，用200 yL的PBS重新將細胞分散并在在激光共聚焦顯微鏡下觀察S12ODOX,mPEG-DSPE/S12ODOX，和 RGERPPR-PEG-DSPE/S12ODox,對靶向性細胞 U87mg 的識別情況，其觀察結果如圖5所示。由圖5中的未修飾脂質(zhì)體分子的S12，即本發(fā)明實施例1制得的S12ODOX對U87mg細胞的吞噬率為45%，mPEG-DSPE/S12ODOX對細胞的吞噬率為73%，RGERPPR-PEG-DSPE/S12ODOX對細胞的吞噬率為90% ;這說明實施例3中修飾到Si納米顆粒表面的脂質(zhì)體會增強U87mg細胞攝取的被動EPR效應。與實施例5中比較，脂質(zhì)體表面的穿膜肽介導作用進一步增強了細胞對于藥物顆粒的胞吞效果。
[0030]納米粒子對腫瘤細胞靶向殺傷效果的評價:參照實施例1，3，5的步驟制備S12ODox, mPEG-DSPE/S12ODox 和 RGERPPR-PEG-DSPE/S12ODox。為考察其選擇性殺傷效果，選取對U87mg細胞，以2X104個細胞/孔的濃度接種于96孔細胞培養(yǎng)板內(nèi)(每孔100 μ L培基)，加入10 UL不同濃度的藥物材料，在無血清培基中37°C、5%的CO2條件下孵育32小時；共孵育后75 μ L無血清培養(yǎng)基溶液去除，補充含10%血清的新鮮培基至100 μ L，繼續(xù)培養(yǎng)4h ；10yL Cell Counting Kit單溶液細胞增殖檢測試劑盒加入每孔，孵育4h ；直接在酶標儀490nm處讀數(shù)據(jù)，計算出細胞在不同濃度作用下的存活率。由圖6可見，游離阿霉素藥物、Si02@Dox、mPEG-DSPE/S12ODox 和 RGERPPR-PEG-DSPE/S12ODox 在 10 ?60 μ g/mL的濃度范圍內(nèi)U87mg細胞的影響。隨著藥物濃度增大，細胞的存活率呈下降趨勢，由于游離阿霉素藥物與細胞直接接觸，32小時后U87mg細胞存活率為56.4%，由于二氧化硅及脂質(zhì)體的包覆作用，藥物具有緩釋效果，對于細胞的殺傷率與等當量游離阿霉素相比有所下降。由圖7可見，細胞殺傷率高低順序依次為RGERPPR-PEG-DSPE/Si02@DoX >mPEG-DSPE/S12ODox > S12ODox,溶液在60 μ g/mL的濃度時，其對靶向的U87mg細胞的存活率為72%相比于mPEG-DSPE/S12ODox的存活率78%和S12ODox的存活率81%，殺傷效果有所增加。
【權利要求】
1.一種運載阿霉素的靶向性脂質(zhì)/ 二氧化硅復合體的制備方法，其特征在于，具體步驟如下: (1)二氧化硅顆粒包埋阿霉素藥物: 將10體積的環(huán)己烷、2.2?2.6體積的聚乙二醇對異辛基苯基醚和2.0?2.4體積的正己醇混合均勻，向混勻后的混合液中加入0.5?I體積、濃度為10-20mg/mL的氟化鈉溶液，攪拌均勻后形成反乳相微乳液；向該反相微乳液中加入0.1?0.13體積、0.01?0.05mol/L的阿霉素溶液和0.13?0.27體積的正硅酸乙酯(TEOS)，反應完全后得到包埋阿霉素的二氧化硅納米顆粒(DOX-SiNP)微乳液體系；在破乳前加入0.02?0.05的氨丙基三乙氧基硅烷，室溫下攪拌至反應完全；然后加入乙醇破乳，離心收集納米顆粒，洗滌后制得包埋藥物阿霉素的Si02m米顆粒； (2)革El向性脂質(zhì)體的制備: 將腫瘤細胞穿膜肽溶于PH7.0的2毫升PBS溶液中，取馬來酰亞胺-聚乙二醇-磷脂復合物(DSPE-PEG-MAL)，其摩爾當量為腫瘤細胞穿膜肽的0.8倍，溶于0.5毫升二甲基甲酰胺(DMF)，加入多肽水溶液中，超聲去除氣泡，攪拌反應I小時至DSPE-PEG-Mal反應完全，透析，截留分子量3500Da，透析介質(zhì)為水，去除過量的腫瘤細胞穿膜肽和DMF，冷凍干燥，得到腫瘤細胞穿膜肽-PEG-DSPE材料；將處方的摩爾組成為氫化大豆磷脂/膽固醇/mPEG-DSPE/RGERPPR-PEG-DSPE=55:45:2:1,將各組分用氯仿溶解，旋轉蒸發(fā)去除溶劑，加水溶液至脂質(zhì)膜中，超聲分散并在水浴60度旋轉震蕩，得脂質(zhì)體混懸液；擠壓過50nm孔徑大小的碳酸脂膜，得到粒徑大小均勻的靶向性脂質(zhì)體； (3)靶向性脂質(zhì)/S12復合體的制備: 將上述兩種溶液混合，脂質(zhì)與二氧化硅治療比為1:10，后經(jīng)漩渦震蕩5分鐘后，靜止放置24小時，經(jīng)12000rpm離心后除去上層游離的脂質(zhì)層，將沉淀部分冷凍干燥，既得靶向性脂質(zhì)/3102復合體。
2.根據(jù)權利要求1所述運載阿霉素的靶向性脂質(zhì)/二氧化硅復合體的制備方法，其特征在于，所述的腫瘤靶向細胞穿膜肽為C-RGERPPR，Lyp-1, RPARPAR，RGERPPR，cRGD，NGR,ang1prep-2中的一種或其組合。
3.—種運載阿霉素的靶向性脂質(zhì)/ 二氧化硅復合體，其特征在于，根據(jù)上述任一權利要求所述方法制備得到。
4.根據(jù)權利要求3所述運載阿霉素的靶向性脂質(zhì)/二氧化硅復合體針對腦膠質(zhì)瘤、胰腺癌、乳腺癌、前列腺癌治療的應用。
【文檔編號】A61K47/42GK104434801SQ201410661330
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月19日 優(yōu)先權日:2014年11月19日
【發(fā)明者】何丹農(nóng), 嚴一楠, 王萍, 夏智偉, 顏娟, 金彩虹 申請人:上海納米技術及應用國家工程研究中心有限公司