一種phbv聚合物、制備方法及利用phbv聚合物制作的止血材料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種PHBV聚合物、制備方法及利用PHBV聚合物制作的止血材料，所述PHBV聚合物是3-羥基丁酸3HB和3-羥基戊酸3HV的共聚物，所述聚合物的主鏈上包括至少五十個(gè)聚3-羥基丁酸的嵌段和至少五十個(gè)聚3-羥基戊酸的嵌段。所述制備方法包括：將Haloferax mediterranei ES1菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵溫度為37℃，攪拌轉(zhuǎn)速為300-500r/min，通氣量為1.25:1vvm，通過(guò)2M鹽酸溶液或2M氫氧化鈉溶液自動(dòng)流加調(diào)節(jié)pH穩(wěn)定在6.9-7.1范圍內(nèi)；通氣量為1.25:1vvm，罐體內(nèi)壓為1個(gè)大氣壓的條件下發(fā)酵36～48h；從發(fā)酵液中提取所述PHBV聚合物。
【專利說(shuō)明】-種PHBV聚合物、制備方法及利用PHBV聚合物制作的止血 材料

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其設(shè)及一種P皿V聚合物、制備方法及利用P皿V聚合 物制作的止血材料。

【背景技術(shù)】
[0002] 聚哲基脂肪酸醋（Polyhy化oxya：Lkanoates，PHA)是一類由哲基脂肪酸作為單體 組成的生物聚醋，由多種細(xì)菌和某些嗜鹽古菌在營(yíng)養(yǎng)條件不均衡時(shí)產(chǎn)生。PHA在胞內(nèi)W疏水 性的顆粒存在，主要作為胞內(nèi)碳源、能源及還原力的貶藏性物質(zhì)。PHA具有與傳統(tǒng)的石油化 工塑料相似的材料學(xué)性質(zhì)，但可由再生的碳源合成，并且可完全降解進(jìn)入自然界的生態(tài)循 環(huán)，因此被認(rèn)為是一種"綠色塑料"。作為一種生物可降解塑料，PHA具有從剛性材料到彈性 體的性能，可應(yīng)用于各種包裝材料和日常消費(fèi)用塑料制品W及紡織纖維等等。特別是在醫(yī) 療領(lǐng)域，PHA具有的良好的生物相容性及生物可降解性，使其在細(xì)胞組織工程領(lǐng)域有很大的 應(yīng)用潛力。
[0003] 研究發(fā)現(xiàn)組成PHA的單體已超過(guò)150種，包括直鏈、支鏈、飽和、不飽和及芳香族 的各種哲基脂肪酸，因此PHA的種類繁多。目前，研究最多的短鏈PHA包括聚哲基了酸醋 (P皿）和聚哲基了酸哲基戊酸醋（P皿V)，且已實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。P皿性脆，斷裂伸長(zhǎng)率很 低，且在加熱溫度高于烙點(diǎn)（18(rC )10°C時(shí)，就會(huì)分解，從而增加了 P皿的后處理加工的難 度，該些缺點(diǎn)大大限制了它的應(yīng)用范圍。P皿V由兩種單體[3-哲基了酸（3皿），3-哲基戊酸 (3HV)]共聚而成。3-哲基戊酸單體的滲入使P皿V的結(jié)晶結(jié)構(gòu)明顯改變，帶來(lái)硬度下降、強(qiáng) 度下降、烙點(diǎn)下降，但分解溫度卻沒(méi)有下降，而且隨著3HV的加入，結(jié)晶的晶體規(guī)整性下降 且呈現(xiàn)不同的結(jié)晶形態(tài)，該對(duì)P皿V性能都有改進(jìn)作用。
[0004] 共聚物中單體種類的不同W及其比例的不同，給PHA結(jié)構(gòu)變化帶來(lái)了無(wú)限可能， 賦予了 PHA性能的多樣化。此外，PHA主鏈的微結(jié)構(gòu)也是影響其材料學(xué)性能的一大因素。目 前常見(jiàn)的高分子聚合物的微結(jié)構(gòu)有=種；無(wú)規(guī)則共聚物，嵌段共聚物，均聚物（由同一種單 體聚合而成，如P皿）。無(wú)規(guī)則共聚物和嵌段共聚物至少有兩種單體組成。組成無(wú)規(guī)則共聚 物的單體隨機(jī)分布在主鏈中；組成嵌段共聚物的單體在PHA主鏈中形成較長(zhǎng)的鏈段，不同 單體的鏈段交替共價(jià)連接在一起。嵌段聚合物將多種聚合物的優(yōu)良性質(zhì)結(jié)合在一起，得到 性能比較優(yōu)越的功能聚合物材料。組成P皿V的單體（3皿和3HV)的比例及其微結(jié)構(gòu)的多 樣性（3皿及3HV的聚合方式）帶來(lái)了其材料學(xué)性能的多樣性。細(xì)菌中合成的P皿V主要是 W無(wú)規(guī)則共聚的方式存在。真養(yǎng)產(chǎn)堿菌利用果糖和戊酸為共同碳源，可W合成P皿-b-P皿V 聚合物，一種含有P皿鏈段和無(wú)規(guī)則共聚P皿V鏈段的聚合物，該聚合物具有比相同3HV含 量的無(wú)規(guī)共聚物更加優(yōu)良的材料學(xué)性能。
[0005] 極端嗜鹽古菌是一類在高鹽環(huán)境中生長(zhǎng)的極端微生物，多數(shù)菌株能夠在碳源過(guò)量 的情況下合成P皿或者P皿V。其中，地中海富鹽菌是高效合成P皿V的菌株之一，它作為 P皿V的生產(chǎn)菌株具有如下優(yōu)點(diǎn)；胞外的高滲環(huán)境可簡(jiǎn)化滅菌甚至省略滅菌，極大的節(jié)省了 蒸汽等熱源；菌體在清水中非常容易裂解，從而使P皿V提取安全、簡(jiǎn)便；其生長(zhǎng)速率較其他 極端嗜鹽古菌快，可W利用淀粉、乳清等多種非相關(guān)廉價(jià)碳源合成P皿V。
[0006] 申請(qǐng)?zhí)枮?01210181052. 4的中國(guó)發(fā)明專利申請(qǐng)公開(kāi)了一種高效利用碳源 生成P皿V的重組極端嗜鹽古菌。該重組極端嗜鹽古菌是將地中海富鹽菌化loferax mediterranei基因組中的胞外多糖合成基因簇表達(dá)的至少一種蛋白功能缺失，獲得了胞外 多糖合成功能缺失的工程菌H. mediterranei ESI。該基因工程菌較野生菌株更高效的利用 葡萄糖，淀粉和乳清等多種碳源，在相同條件下P皿V產(chǎn)量提高了 20%左右。同時(shí)解決了胞 外多糖積累造成的培養(yǎng)液變粘、起泡和溶氧下降等問(wèn)題。該菌合成的P皿V中3HV單體含量 為lOmol %左右，3皿和3HV的聚合方式為無(wú)規(guī)則共聚。因此實(shí)現(xiàn)該菌合成新型微結(jié)構(gòu)和材 料性能優(yōu)化的P皿V，對(duì)拓寬其應(yīng)用領(lǐng)域是必需的。
[0007] 目前，已有很多PHAs在組成工程應(yīng)用的報(bào)道，如屯、臟閥n、屯、血管修補(bǔ)材料和移 植材料等。在外科創(chuàng)傷及手術(shù)急救中，傷口出血是常見(jiàn)問(wèn)題，若不能及時(shí)有效止血，將會(huì)導(dǎo) 致血液流失，對(duì)身體健康帶來(lái)?yè)p害，嚴(yán)重時(shí)會(huì)危及生命。同時(shí)，血液中營(yíng)養(yǎng)豐富，出血會(huì)增加 傷口感染機(jī)會(huì)，從而帶來(lái)健康風(fēng)險(xiǎn)。傳統(tǒng)的止血材料如止血紗布，綱帶等有一定的局限性， 存在止血時(shí)間長(zhǎng)、易與傷口粘連等問(wèn)題。傷口的凝血過(guò)程，主要包括小血管的收縮，血小板 的激活和凝血系統(tǒng)的啟動(dòng)。目前所用的具有促進(jìn)凝血的止血材料，主要原理是：材料與血液 接觸時(shí)，血漿蛋白在材料上聚集，之后引起血小板在材料上聚集，血小板的聚集本身具有一 定的止血功能，同時(shí)血小板釋放一些促凝血因子，加速凝血的過(guò)程。
[000引當(dāng)前的止血材料從作用機(jī)制上大致可分為3類；第一類是直接或間接提供外來(lái)的 凝血成分來(lái)提高傷口部位凝血成分濃度，進(jìn)而加速產(chǎn)生凝血（如纖維蛋白類止血材料）； 第二類是通過(guò)材料的物理或化學(xué)作用使傷口部位自身的凝血成分濃縮、聚集，從而加速凝 血（如高分子多糖類、無(wú)機(jī)類沸石等）；第S類是利用材料對(duì)組織很強(qiáng)的粘著力直接封閉創(chuàng) 面，從而實(shí)現(xiàn)止血。PHAs作為一種具有競(jìng)爭(zhēng)力的生物醫(yī)用材料，其應(yīng)用領(lǐng)域?qū)?huì)不斷拓展。 已有研究報(bào)道基于PHAs通過(guò)化學(xué)共聚的方式可W合成多嵌段聚氨醋共聚物，改類聚合物 具有優(yōu)良的凝血效果。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提供一種P皿V聚合物、制備方法及利 用P皿V制作的止血材料，所述P皿V材料利用地中海富鹽菌多糖合成功能缺失的工程菌 Haloferax mediterranei ESI (H. mediterranei ESI)合成。H. mediterranei ESI 菌株的 構(gòu)建方法，已于2012年申請(qǐng)中國(guó)發(fā)明專利，申請(qǐng)?zhí)枮椋?01210181052. 4。
[0010] 本發(fā)明的目的通過(guò)W下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)：
[0011] 一種raBV聚合物，所述聚合物是3-哲基了酸3皿和3-哲基戊酸3HV的共聚物， 所述聚合物的主鏈上包括至少五十個(gè)聚3-哲基了酸的嵌段和至少五十個(gè)聚3-哲基戊酸的 嵌段，還包括3-哲基了酸與3-哲基戊酸的無(wú)規(guī)共聚鏈段。
[001引一種raBV聚合物的制備方法，該方法包括如下步驟；
[0013] (1)將H. mediterranei ESI菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵溫度為37°C，攬拌 轉(zhuǎn)速為300-5(K)r/min，通氣量為1. 25: Ivvm，通過(guò)2M鹽酸溶液或2M氨氧化鋼溶液自動(dòng)流加 調(diào)節(jié)抑穩(wěn)定在6. 9-7. 1范圍內(nèi)；通氣量為1. 25:lvvm，罐體內(nèi)壓為1個(gè)大氣壓的條件下發(fā) 酵36?4她；
[0014] (2)從發(fā)酵液中提取所述P皿V聚合物。
[0015] 一種利用P皿V聚合物制作的止血材料，將P皿V材料制成厚度為0. 2-0. 6mm的薄 膜，WGB/13022方法進(jìn)行測(cè)定的力學(xué)性能如下；斷裂伸長(zhǎng)率100 %?400%，拉伸強(qiáng)度10? 20Mpa，楊氏模量 1000 ?2000Mpa。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的一個(gè)或多個(gè)實(shí)施例可W具有如下優(yōu)點(diǎn)：
[0017] 本發(fā)明主要通過(guò)利用H. mediterranei ESI菌株作為生產(chǎn)菌株，通過(guò)在發(fā)酵培養(yǎng)基 中添加戊酸，得到了一種具有特殊微結(jié)構(gòu)的P皿V，包含3皿嵌段片段，3HV嵌段片段和P皿V 無(wú)規(guī)則聚合片段的高規(guī)整聚合物。其聚合方式兼具無(wú)規(guī)則共聚和嵌段共聚兩種，此種微結(jié) 構(gòu)的P皿V為首次發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)未見(jiàn)報(bào)道。通過(guò)發(fā)酵，P皿V的產(chǎn)量達(dá)到5g/L。本發(fā)明為 該具有特殊微結(jié)構(gòu)新材料的進(jìn)一步應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。且進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，由該材料無(wú)需任何化學(xué) 修飾制成的膜，具有很強(qiáng)的血小板吸附能力和促進(jìn)凝血的能力，可W用于傷口止血。同時(shí)， 該材料具有生物相容性和生物可降解性，在外科手術(shù)過(guò)程，可W縫合到傷口內(nèi)，人體組織可 W吸收。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[001引圖1A和圖1B是本發(fā)明提供的無(wú)規(guī)共聚P皿V和高規(guī)整規(guī)整共聚P皿V微結(jié)構(gòu)分析 圖；
[0019] 圖2A是本發(fā)明提供的無(wú)規(guī)整共聚P皿V的微結(jié)構(gòu)示意圖；
[0020] 圖2B是本發(fā)明提供的高規(guī)整共聚P皿V的微結(jié)構(gòu)示意圖；
[0021] 圖2C是本發(fā)明提供的嵌段共聚P皿V的微結(jié)構(gòu)示意圖；
[0022] 圖3A是對(duì)照樣品無(wú)規(guī)共聚P皿V的表面形態(tài)（放大倍數(shù)500倍）圖；
[0023] 圖3B是樣品高規(guī)整共聚P皿V的表面形態(tài)（放大倍數(shù)500倍）圖；
[0024] 圖3C是樣品高規(guī)整共聚P皿V的表面形態(tài)（放大倍數(shù)3000倍）圖；
[0025] 圖4是無(wú)規(guī)共聚P皿V和高規(guī)整共聚P皿V膜表面血小板貼附數(shù)目。

【具體實(shí)施方式】
[0026] 為使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā) 明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述。
[0027] 本實(shí)施例所使用菌株為基因工程菌H. mediterranei ESI菌株（其構(gòu)建方法見(jiàn)申 請(qǐng)?zhí)枮?01210181052. 4的發(fā)明專利）。raBV由單體3皿和3HV的高規(guī)整聚合而成，該聚合 物主鏈包括3HV嵌段的片段、3皿嵌段的片段及P皿V無(wú)規(guī)則片段。
[00測(cè)實(shí)施例1
[0029] 本實(shí)施例提供了一種P皿V聚合物，所述聚合物是3-哲基了酸3皿和3-哲基戊酸 3HV的共聚物，所述聚合物的主鏈上包括至少五十個(gè)聚3-哲基了酸的嵌段和至少五十個(gè)聚 3-哲基戊酸的嵌段。
[0030] 上述聚合物的主鏈上還包括3-哲基了酸與3-哲基戊酸的無(wú)規(guī)共聚鏈段；
[003U 聚合物中共聚單體3皿和3HV的摩爾比為20?50 ;80?50,優(yōu)選為33?50 ;67? 50 ；
[0032] 所述聚合物的重均分子量為1?3xl06,分子量多分散系數(shù)為1. 3?2. 2,優(yōu)選為 1. 5 ?1. 8。
[0033] 上述P皿V聚合物的熱力學(xué)參數(shù)如下；玻璃化轉(zhuǎn)變溫度-15?5°C，優(yōu)選為-10? 3°C;冷結(jié)晶溫度55?72°C，優(yōu)選為-62?70°C;烙融溫度132-145°C，優(yōu)選為135?145°C; 分解溫度260-275 °C，優(yōu)選為265?272 °C。
[0034] 上述P皿V聚合物成膜后呈現(xiàn)的空隙直徑為1-3 y m，優(yōu)選為1-2 y m。
[0035] 本實(shí)施例還提供了一種P皿V聚合物的制備方法，該方法包括W下步驟：
[0036] (1)將H. mediterranei ESI菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵溫度為37°C，攬拌 轉(zhuǎn)速為300-5(K)r/min，通氣量為1. 25: Ivvm，通過(guò)2M鹽酸溶液或2M氨氧化鋼溶液自動(dòng)流加 調(diào)節(jié)抑穩(wěn)定在6. 9-7. 1范圍內(nèi)；通氣量為1. 25:lvvm，罐體內(nèi)壓為1個(gè)大氣壓的條件下發(fā) 酵36?4她；
[0037] (2)從發(fā)酵液中提取所述P皿V聚合物。
[003引上述步驟（1)中在將H. mediterranei ESI菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中之前先在種 子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-3化，進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)；接種種子液體積為加入種子后總體積的5%，培養(yǎng) 條件搖瓶轉(zhuǎn)速180-22化/min、培養(yǎng)溫度37°C。然后，將種子液接種至裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā) 酵罐中發(fā)酵，發(fā)酵至36?4她停止發(fā)酵；其中種子液體積為加入后總體積的5%。
[0039] 上述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：酵母提取物2?5g/L、鋼離子1. 5?2. 6M、儀離子90? 120mM、巧離子5?15mM、鐘離子55?75mM、碳酸根1. 5?3. 5mM、鑲離子0. 1?4. 9mM、錠 離子30?45mM、磯酸根0. 2?0. 4mM、微量元素溶液化-61ml/L和戊酸5?15mM ;且發(fā)酵 培養(yǎng)基的抑是6. 8-7. 2。所述發(fā)酵培養(yǎng)基的微量元素溶液化-6的各種組分及其含量為： 鋒離子3. 5mM，鋪離子1. 6mM，棚酸根48. 6mM，鉆離子8. 4mM，銅離子0. 6mM，鑲離子1. 6mM，銷 酸根1. 3mM ;所述微量元素溶液的抑用鹽酸溶液調(diào)節(jié)至3-4。
[0040] 上述發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為；酵母提取物3g/L、鋼離子1. 88M、儀離子106mM、巧離子 9mM、鐘離子67mM、碳酸根2. 5mM、漠離子4mM、錠離子37. 5mM、磯酸根0. 3mM、微量元素溶液 Sk61ml/L和戊酸6. 5?llmM ;且發(fā)酵培養(yǎng)基的抑是6. 9-7. 1。
[0041] 上述種子培養(yǎng)基為；酵母提取物2?5g/L、鋼離子1. 5?2. 6M、儀離子90? 120mM、巧離子5?15mM、鐘離子55?75mM、碳酸根1. 5?3. 5mM、鑲離子0. 1?4. 9mM、錠 離子30?45mM、磯酸根0. 2?0. 4mM、微量元素溶液化-61ml/L和PI陽(yáng)S 20?50mM ;且培 養(yǎng)基的抑是7. 0-7. 2。
[0042] 上述種子培養(yǎng)基的優(yōu)選組成為；酵母提取物3g/L、酵母提取物3g/L、鋼離子 1. 88M、儀離子106mM、巧離子9mM、鐘離子67mM、碳酸根2. 5mM、漠離子4mM、錠離子37. 5mM、 磯酸根0. 3mM、微量元素溶液化-61ml/L和PI陽(yáng)S 30mM ;其中培養(yǎng)基抑值為7. 0。
[0043] P皿V的提取步驟包括；
[0044] 步驟1、500化/min離屯、20min收集菌體，棄上清；用10 %化C1溶液洗漆沉淀， 5000r/min離屯、20min，棄上清；細(xì)胞沉淀中加入0. 1 % SDS溶液攬拌30min，5000r/min離 屯、20min，棄上清；白色沉淀中加入蒸饋水?dāng)埌?0min，5000r/min離屯、20min，棄上清，得到 白色實(shí)屯、沉淀，將其冰凍干燥過(guò)夜至恒重。
[0045] 步驟2、用氯仿對(duì)步驟1得到的P皿V進(jìn)行提取，使用量為Ig干細(xì)胞加入15ml氯 仿。于專用的抽提瓶中，在80?100°C下密封加熱化W上。
[0046] 步驟3、冷卻后，用布氏漏斗真空抽濾，得到澄清的溶解PHA的氯仿溶液。
[0047] 步驟4、在步驟3得到的氯仿溶液中，加入5倍體積的冰冷己醇和1倍體積的正己 燒，得到raBV沉淀，500化/min離屯、20min離心棄上清，收集沉淀。如果raBV沉淀不完全， 可W在4°C低溫下延長(zhǎng)沉淀時(shí)間W提高P皿V得率。
[0048] 步驟5、待步驟4得到的P皿V沉淀物中的溶劑揮發(fā)后，即可得到純化的P皿V。
[0049] 上述raBv的定量分析
[0化日]發(fā)酵結(jié)束后，500化/min離屯、20min離屯、收集菌體，菌體冰凍干燥至恒重，計(jì)算細(xì) 胞干重（CDW)。取80mg左右干細(xì)胞于醋化管中，加入2ml醋化液（Ig/L苯甲酸作內(nèi)標(biāo)，溶 解于97%體積的甲醇和3%體積的濃硫酸中）、2ml氯仿，加蓋密閉。100°C烘箱中醋化化。 冷卻至室溫后，加入1ml蒸饋水，充分振蕩混勻，靜置分層。待氯仿相與水相完全分離后，取 氯仿相進(jìn)行氣相色譜（Agilent GC 6820,美國(guó)）分析。
[0化1 ] 設(shè)定柱溫為200°C，進(jìn)樣器溫度為200°C，檢測(cè)器溫度為220°C，柱頭壓力為 0. 25Mpa。程序升溫條件為；80°C 1. 5min，W 30°C /min 的速度升溫至 140°C，W 40°C /min 的速度升溫至220°C并在此溫度保持0. 5min。柱子長(zhǎng)30m，固定相厚度為0. 25 y m，初始柱 壓為lOpsi,停留1. 5min，W 2. 5psi的速度升壓至20psi，停留0. 5min。樣品的進(jìn)樣量為 1 y 1。
[0化2] 根據(jù)氣相色譜的積分面積，進(jìn)行定量計(jì)算，最后得到具有特殊微結(jié)構(gòu)的樣品P皿V 中的3HV的摩爾含量為33. 3%，P皿V占細(xì)胞干重的45%，P皿V的產(chǎn)量為5g/L。
[0化3] 實(shí)施例2
[0054] 本實(shí)施例提供了對(duì)實(shí)施例1PHBV微結(jié)構(gòu)分析
[0化5] 提純的P皿V樣品溶于気代氯仿，溶解濃度為20mg/mU甲基娃燒做為內(nèi)標(biāo)。利用核 磁共振儀炬ruker AVANCE III 500,德國(guó)）于室溫下對(duì)樣品進(jìn)行"C NMR的數(shù)據(jù)采集。樣 品在譜儀上記錄了 10000化的譜寬，3化數(shù)據(jù)點(diǎn)積累30000次的"C NMR。
[0056] 圖1A和1B是本實(shí)施例提供的raBV微結(jié)構(gòu)分析圖，圖中為"C NMR譜圖中3HV核 磁共振自旋分裂峰。其中無(wú)規(guī)共聚P皿V樣品中3HV摩爾含量為30. 1%，高規(guī)整共聚P皿V 樣品中3HV摩爾含量為33. 3%，即本實(shí)施例得到的具有特殊微結(jié)構(gòu)的樣品；二者的3HV單 體含量基本一致。如圖1A所示，在無(wú)規(guī)則聚合物-P皿V中，HV單體大部分處于V地的微環(huán) 境中，其核磁共振自旋分裂峰值均大于V*V的分裂峰。如圖1B所示，在高規(guī)整聚合物P皿V 中，3HV單體和自己同種單體的相互作用V*V都大于V地。通過(guò)對(duì)各自的峰面積進(jìn)行積分計(jì) 算分析，得到表1，W碳原子HV (1)為例，在無(wú)規(guī)則聚合物P皿V中，HV單體大部分處于V地的 微環(huán)境中，其核磁共振自旋分裂峰值均大于V*中V (1) *V的比例為37. 32 %，而在高規(guī)整聚 合物P皿V中上升至49. 62%，增加了 33% (如表1所示）。該說(shuō)明了在高規(guī)整聚合物P皿V 中，大部分3HV都是與3HV單體連接在一起，存在著大量嵌段式的3HV片段。同時(shí)，也分析 了 3皿單體在兩種聚合物中的分布情況，如圖1B所示，與無(wú)規(guī)則聚合物P皿V相比，在高規(guī) 整聚合物P皿V中，大部分3皿都是與3皿單體連接在一起，存在著大量嵌段式的3皿片段。
[0057] 上述兩個(gè)樣品中3HV的每個(gè)碳原子與3皿單體的相互作用分析，采用碳譜中的相 應(yīng)積分面積之比表示，如下表1所示：
[005引

【權(quán)利要求】
1. 一種PHBV聚合物，其特征在于，所述聚合物是3-羥基丁酸3HB和3-羥基戊酸3HV的 共聚物，所述聚合物的主鏈上包括至少五十個(gè)聚3-羥基丁酸的嵌段和至少五十個(gè)聚3-羥 基戊酸的嵌段。
2. 如權(quán)利要求1所述的PHBV聚合物，其特征在于， 所述聚合物的主鏈上還包括3-羥基丁酸與3-羥基戊酸的無(wú)規(guī)共聚鏈段； 聚合物中共聚單體3HB和3HV的摩爾比為20?50 :80?50,優(yōu)選為33?50 :67? 50 ； 所述聚合物的重均分子量為1?3xl06,分子量多分散系數(shù)為1. 3?2. 2,優(yōu)選為1. 5? 1. 8〇
3. 如權(quán)利要求1所述的PHBV聚合物，其特征在于，所述PHBV聚合物的熱力學(xué)參數(shù)如 下：玻璃化轉(zhuǎn)變溫度-15?5°C，優(yōu)選為-10?3°C ;冷結(jié)晶溫度55?72°C，優(yōu)選為-62? 70°C;熔融溫度132-145°C，優(yōu)選為135?145°C;分解溫度260-275°C，優(yōu)選為265?272°C。
4. 如權(quán)利要求1所述的PHBV聚合物，其特征在于，所述PHBV聚合物成膜后呈現(xiàn)的孔隙 直徑為1-3 u m，優(yōu)選為1-2 y m。
5. 如權(quán)利要求1-4中任何一項(xiàng)所述PHBV聚合物的制備方法，該方法包括如下步驟： (1) 將H. mediterranei ESI菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在發(fā)酵溫度為37°C，攪拌轉(zhuǎn)速 為300-500r/min，通氣量為1. 25: lvvm，通過(guò)2M鹽酸溶液或2M氫氧化鈉溶液自動(dòng)流加調(diào)節(jié) pH穩(wěn)定在6. 9-7. 1范圍內(nèi)；通氣量為1. 25: lvvm，罐體內(nèi)壓為1個(gè)大氣壓的條件下發(fā)酵36? 48h ； (2) 從發(fā)酵液中提取所述PHBV聚合物。
6. 如權(quán)利要求5所述的PHBV聚合物的制備方法，其特征在于，步驟（1)中在將 H. mediterranei ESI菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中之前先在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)24-36h，進(jìn)行擴(kuò) 大培養(yǎng)；接種種子液體積為加入種子后總體積的5%，培養(yǎng)條件搖瓶轉(zhuǎn)速180-220r/min、培 養(yǎng)溫度37°C ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括：酵母提取物2?5g/L、鈉離子1. 5?2. 6M、鎂離子90?120mM、 媽離子5?15mM、鉀離子55?75mM、碳酸根1. 5?3. 5mM、鎮(zhèn)離子0. 1?4. 9mM、按離子30? 45mM、磷酸根0. 2?0. 4mM、微量元素溶液SL-61ml/L和戊酸5?15mM ;且發(fā)酵培養(yǎng)基的pH 是 6. 8-7. 2 ; 所述發(fā)酵培養(yǎng)基的微量兀素溶液SL-6的各種組分及其含量為：鋅尚子3. 5mM，猛尚子 I. 6mM，硼酸根48. 6mM，鈷離子8. 4mM，銅離子0. 6mM，鎳離子1. 6mM，鉬酸根1. 3mM ;所述微量 元素溶液的pH用鹽酸溶液調(diào)節(jié)至3-4。
7. 如權(quán)利要求5所述的PHBV聚合物的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選為： 酵母提取物3g/L、鈉離子1. 88M、鎂離子106mM、鈣離子9mM、鉀離子67mM、碳酸根2. 5mM、溴 離子4mM、銨離子37. 5mM、磷酸根0. 3mM、微量元素溶液SL-61ml/L和戊酸6. 5?llmM ;且發(fā) 酵培養(yǎng)基的pH是6. 9-7. 1。
8. 如權(quán)利要求6所述的PHBV聚合物的制備方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基為：酵 母提取物2?5g/L、鈉離子1. 5?2. 6M、鎂離子90?120mM、鈣離子5?15mM、鉀離子55? 75mM、碳酸根1. 5?3. 5mM、鎮(zhèn)離子0. 1?4. 9mM、按離子30?45mM、憐酸根0. 2?0. 4mM、 微量元素溶液SL-61ml/L和PIPES20?50mM ;且培養(yǎng)基的pH是7. 0-7. 2。
9. 如權(quán)利要求6所述PHBV聚合物的制備方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基的優(yōu)選組 成為：酵母提取物3g/L、酵母提取物3g/L、鈉離子1. 88M、鎂離子106mM、鈣離子9mM、鉀離子 67mM、碳酸根2. 5mM、溴離子4mM、按離子37. 5mM、磷酸根0. 3mM、微量元素溶液SL_61ml/L和 PIPES 30mM;其中培養(yǎng)基pH值為7.0。
10. -種利用PHBV聚合物制作的止血材料，其特征在于，將PHBV材料制成厚度 為0. 2-0. 6mm的薄膜，以GB/13022方法進(jìn)行測(cè)定的力學(xué)性能如下：斷裂伸長(zhǎng)率100 %? 400%，拉伸強(qiáng)度10?201^^，楊氏模量1000?20001^&。
【文檔編號(hào)】A61L15/42GK104448258SQ201410658043
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】韓靜, 向華, 侯靖 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院微生物研究所