載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化硅納米粒的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化硅納米粒的制備方法，所述方法包括：稱取氨基修飾介孔二氧化硅納米粒，分散到白藜蘆醇飽和乙醇溶液中，常溫下避光攪拌，每隔20～30min超聲處理3～5min，攪拌2～3h使H2N-MSN充分吸附RES飽和乙醇溶液，然后15000～20000r·min-1離心20～30min，將離心得到的白色固體35～45℃減壓干燥，得到載藥粉末；重復(fù)上述分散、吸附、離心、干燥操作7～8次，即得所述載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化硅納米粒。本發(fā)明改良的經(jīng)典Stober法成功合成了NH2-MSN，通過反復(fù)飽和溶液吸附法能夠有效提高載藥量，制備得到NH2-MSN-RES提高了RES的生物利用度，具有較好市場前景。
【專利說明】載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化硅納米粒的制備方法 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化硅納米粒的制備方法。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 白藜蘆醇（Resveratrol，RES)為蓼科植物虎杖 Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.干燥根莖及根中提取出來的一種含有芪類結(jié)構(gòu)的非黃酮類多酚化合物[1]。研究證明， RES不僅有抗炎、抗血栓等功效[2]，而且RES通過抗氧化、抗突變、抑制環(huán)加氧酶和氫過氧化 物酶的活性，抑制癌細(xì)胞的生長和增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞的分化和凋亡，被喻為繼"紫杉醇"之后 又一新的綠色抗癌物質(zhì)。但是，由于其理化性質(zhì)不穩(wěn)定、極難溶于水、半衰期短等特性，致口 服制劑的生物利用度較低、血藥濃度不穩(wěn)定，嚴(yán)重限制其臨床應(yīng)用。
[0003] 納米粒載體作為一種新型藥物傳遞系統(tǒng)，將藥物包載于納米粒中，一方面可以提 高藥物穩(wěn)定性，具有緩控釋特性，另一方面可以增加生物膜透過性、改變藥物體內(nèi)分布、提 高生物利用度等。其中，介孔二氧化娃（Mesoporous Silica Nanoparticles，MSN)作為一 種新型的介孔材料，其巨大的比表面積和比孔容可有效的提高載藥量，介孔結(jié)構(gòu)和孔徑調(diào) 節(jié)藥物釋放特性，豐富的表面硅羥基極易修飾或改性，并且MSN具有良好的生物相容性，使 其在藥物載體領(lǐng)域具有優(yōu)良的研究前景。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種氨基改性的介孔二氧化娃（Amino-modified Mesoporous Silica Particles，NH2-MSN)為載體材料，制備新型口服氨基改性介孔二氧化硅載白藜蘆醇納米粒 (NH 2-MSN-RES)的方法，為RES納米制劑的研究提供參考。
[0005] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0006] 載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化硅納米粒的制備方法，所述方法包括：（1)稱 取氨基修飾介孔二氧化硅納米粒（H 2N-MSN),分散到白藜蘆醇（RES)的飽和乙醇溶液中，氨 基修飾介孔二氧化硅納米粒與白藜蘆醇飽和乙醇溶液用量之比為IOOmg :20?25mL，常溫 下避光攪拌，每隔20?30min超聲處理3?5min，攪拌2?3h使H2N-MSN充分吸附RES飽 和乙醇溶液，然后15000?20000r · mirf1離心20?30min，將離心得到的白色固體35? 45°C減壓干燥，得到載藥粉末；（2)重復(fù)步驟（1)操作8?9次，即得所述載白藜蘆醇的氨基 修飾介孔二氧化硅納米粒。本發(fā)明采用反復(fù)飽和溶液吸附法來制備H 2N-MSN-RES,經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā) 現(xiàn)，隨著吸附次數(shù)的增加，H2N-MSN載入RES的量不斷增加，吸附8次之后，載入藥量基本不 變，因此，本發(fā)明確定了反復(fù)飽和溶液吸附法來制備H 2N-MSN-RES的吸附次數(shù)為8?9次。
[0007] 優(yōu)選的，所述氨基修飾介孔二氧化硅納米粒按如下方法制備得到：將CTAB (十六 烷基三甲基溴化銨）溶解于超純水中，加入適量2M NaOH溶液，80?85 °C恒溫?cái)嚢?? 3h，然后快速加入適量TEOS (正硅酸乙酯），30min后緩慢恒速滴入適量APTES (3-氨丙 基三乙氧基硅烷），控制5min內(nèi)滴畢，恒溫繼續(xù)反應(yīng)2?3h，反應(yīng)結(jié)束后靜置熟化24h， 15000?20000r · mirf1離心20?30min得到白色固體，將離心得到的白色固體分散于濃 度為IOmg .mr1的NH4NO3乙醇溶液中80°C回流4?5h，經(jīng)過6次反復(fù)操作去除CTAB后，再 經(jīng)離心、真空干燥，得到白色粉末，即為所述氨基修飾介孔二氧化硅納米粒。本發(fā)明在經(jīng)典 Stober法制備MSN基礎(chǔ)上，改良了經(jīng)典Stober法，進(jìn)行一步合成H2N-MSN,制得H2N-MSN氨 基成功修飾，呈圓整球形，分布均一，粒徑為98. 4±2. 8nm，Zeta電位13. 2±L 8mv，在0? 20ug · ml/1范圍內(nèi)，對(duì)Cac〇-2細(xì)胞無明顯的毒性。
[0008] 具體的，所述CTAB :水：2M NaOH溶液：TEOS :APTES用量之比為L Og :400? 500mL :3 ?5mL :2 ?4mL :1 ?3mL〇
[0009] 本發(fā)明的有益效果主要體現(xiàn)在：本發(fā)明改良的經(jīng)典Stober法成功合成了 NH2-MSN,通過反復(fù)飽和溶液吸附法能夠有效提高載藥量，制備得到的NH2-MSN-RES提高了 RES的生物利用度，具有較好市場前景。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1為H2N-MSN的TEM圖；A為除模板劑之前，B為除模板劑之后；正常觀察為放大 12k倍，觀察介孔結(jié)構(gòu)為放大40k倍；
[0011] 圖 2 為粒徑分布圖；A :MSN，B :H2N-MSN ;
[0012] 圖 3 為 Zeta 電位分布圖；A :MSN，B :H2N-MSN ;
[0013] 圖4為紅外光譜圖；
[0014] 圖5為反復(fù)飽和吸附次數(shù)-重量變化曲線；(H2N-MSN-RES) i為載體吸附藥物飽和 溶液的吸附次數(shù)-載體重量變化曲線，（H2N-MSN) i為載體吸附空白溶液的吸附次數(shù)-載體 重量變化曲線，（H2N-MSN-RES) ^ (H2N-MSN) i為載入載體的藥物吸附次數(shù)-重量變化曲線， (H2N-MSN) ^ (H2N-MSN) η為載體吸附次數(shù)-重量損失變化曲線（i = 1，2, 3, 4, 5···);
[0015] 圖6為MSN和H2N-MSN對(duì)Caco-2細(xì)胞的毒性；
[0016] 圖7為體外釋藥曲線；
[0017] 圖8為跨Caco-2單層細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)的藥物濃度-時(shí)間曲線；A為AP - BL，B為 BL - AP);
[0018] 圖9為大鼠灌胃后的血藥濃度-時(shí)間曲線（η = 6)。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0019] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0020] 實(shí)施例1 :
[0021] 1儀器與材料
[0022] I. 1 儀器
[0023] Waters高效液相色譜儀（Waters e2695四兀泵，2998 PDA檢測器，美國Waters公 司）；
[0024] Nano-ZS 90激光粒度分析儀（英國Malvern儀器有限公司）；
[0025] Optima MAX超速低溫離心機(jī)（美國Beckman Coulter有限公司）；
[0026] Mill-Q超純水儀（美國Millpore公司）；
[0027] PH 酸度計(jì)（瑞士 Mettler-Toledo 公司）；
[0028] JEM-1200EX透射電子顯微鏡（日本JEOL公司）；
[0029] Vector 22傅立葉紅外光譜儀（德國BRUKER公司）；
[0030] TRISTAR II3020全自動(dòng)比表面和孔隙分析儀（美國Micromeritics儀器公司）；
[0031] Rigaku D/max 2550PC全自動(dòng)多晶X射線衍射儀（日本理學(xué)電機(jī)株式會(huì)社）；
[0032] Thermo Forma 超低溫冰箱（美國 Thermo Fisher Scientific 公司）；
[0033] TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；
[0034] KQ5200DE型數(shù)控超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；
[0035] CP22?電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；
[0036] SCIENTZ- II D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；
[0037] DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鄭州科創(chuàng)儀器有限公司）；
[0038] HZ-9212S恒溫振蕩器（太倉市科教器材廠）；
[0039] V0RTEX-5型渦旋混合器（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）；等。
[0040] 1.2藥品與試劑
[0041] 白藜蘆醇（南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司，純度>98% );
[0042] 白藜蘆醇對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，11535-200502);
[0043] 十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)、正硅酸四乙酯（TEOS)、3_氨丙基三乙氧基硅烷 (APTES)(阿拉丁試劑@上海晶純生化科技股份有限公司）；
[0044] 0· 25%胰蛋白酶，D-Hanks緩沖液（美國Gibco公司）；
[0045] DMEM(含有4. 5g · Γ1葡萄糖、3. 7g · Γ1碳酸氫鈉、10%胎牛血清、1 %非必需氨基 酸、1 %谷氨酰胺、100U · mr1青霉素和100 μ g · mr1鏈霉素）（杭州吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限 公司）；
[0046] 甲醇（美國Honeywell Burdick&Jackson公司），其他試劑均為分析純。
[0047] 1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞
[0048] 清潔級(jí)SD大鼠18只，雌雄兼用，體重（280±20)g(浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心 提供，SCXK滬2012-0002) ;Cac〇-2細(xì)胞（浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心凍存，原購于中國 科學(xué)院上海細(xì)胞研究所）；
[0049] 2 方法
[0050] 2. I H2N-MSN 的制備
[0051] 依據(jù)經(jīng)典Stober法制備MSN,在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)改良了經(jīng)典Stober法，并一步 合成4^]\^^1.(^〇^8溶解于4801^超純水中，加入3.51^21恥0!1溶液，801：恒溫?cái)嚢?2h，然后快速加入3mL TE0S，30min后緩慢恒速滴入2mL APTES，控制5min滴畢，恒溫繼續(xù)反 應(yīng)2h，反應(yīng)結(jié)束后靜置熟化24h，15000r MirT1離心30min得到的白色固體。將離心得到的 白色固體分散于200mL NH4N03(10mg · ml/1)的乙醇溶液中80°C回流4h，經(jīng)過6次反復(fù)操作 去除模板劑CTAB，最后一次離心后真空干燥，得到白色粉采用透射電鏡（TEM) 分別對(duì)MSN、H 2N-MSN進(jìn)行觀察，粒徑儀測定粒徑及Zeta電位，傅立葉紅外光譜儀（FTIR)表 征H2N-MSN上的修飾氨基。
[0052] 2. 2 H2N-MSN-RES 的制備
[0053] 本發(fā)明采用反復(fù)飽和溶液吸附法來制備H2N-MSN-RES :稱取IOOmgH2N-MSN(記為 Wltl)分散到RES飽和乙醇溶液20mL中，常溫25°C避光攪拌，每隔30min短時(shí)超聲3min，攪 拌2h使H2N-MSN充分吸附RES飽和乙醇溶液，然后15000r · miiT1離心30min，將離心得到 的白色固體35°C減壓干燥后稱重（記為W11)，然后重復(fù)分散、吸附、離心、干燥、稱重，每重復(fù) 一次的稱重分別記為W 12、W13、W14……。同樣，稱取IOOmg H2N-MSN分散到乙醇溶液20mL中， 除了不加入RES外，其他同法操作，每次稱重分別記為W tll Jtl2 Wtl4……，按照相同的方法 制備對(duì)照組MSN-RES。
[0054]

【權(quán)利要求】
1. 載白藜蘆醇的氨基修飾介孔二氧化硅納米粒的制備方法，所述方法包括：（1)稱 取氨基修飾介孔二氧化硅納米粒，分散到白藜蘆醇飽和乙醇溶液中，氨基修飾介孔二氧化 硅納米粒與白藜蘆醇飽和乙醇溶液用量之比為lOOmg :20?25mL，常溫下避光攪拌，每隔 20?30min超聲處理3?5min，攪拌2?3h使氨基修飾介孔二氧化娃納米粒充分吸附白 藜蘆醇飽和乙醇溶液，然后15000?20000r 離心20?30min，將離心得到的白色固 體35?45°C減壓干燥，得到載藥粉末；（2)重復(fù)步驟（1)操作7?8次，即得所述載白藜蘆 醇的氨基修飾介孔二氧化硅納米粒。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述氨基修飾介孔二氧化硅納米粒按如下方 法制備得到：將CTAB溶解于超純水中，加入適量2M NaOH溶液，80?85°C恒溫?cái)嚢??3h， 然后快速加入適量TEOS，30min后緩慢恒速滴入適量APTES，控制5min內(nèi)滴畢，恒溫繼續(xù)反 應(yīng)2?3h，反應(yīng)結(jié)束后靜置熟化24h，15000?20000r ? mirT1離心20?30min得到白色固 體，將離心得到的白色固體分散于濃度為l〇mg 的NH4N03乙醇溶液中80°C回流4?5h， 經(jīng)過6次反復(fù)操作去除CTAB后，再經(jīng)離心、真空干燥，得到白色粉末，即為所述氨基修飾介 孔二氧化硅納米粒。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述CTAB :水：2M NaOH溶液：TEOS :APTES用 量之比為 1. 〇g :400 ?500mL :3 ?5mL :2 ?4mL :1 ?3mL。
【文檔編號(hào)】A61P29/00GK104367552SQ201410617866
【公開日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月5日
【發(fā)明者】李范珠, 王國偉, 張蓉蓉, 阮葉萍, 郭曼曼, 徐駿軍, 費(fèi)偉東, 韓順平, 劉洋洋 申請(qǐng)人:浙江中醫(yī)藥大學(xué)