豬支原體肺炎滅活疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了豬支原體肺炎滅活疫苗及其制備方法，屬于豬支原體肺炎滅活疫苗領(lǐng)域。本發(fā)明首先公開了一種由水相和油相按照1：1-3的體積比組成的豬支原體肺炎滅活疫苗，所述水相由吐溫-80和豬肺炎支原體菌液按照2-5：95-98的比例組成，所述油相由聚氧乙烯40氫化蓖麻油、司本-80和白油按照1-2：5-8：90-94的比例組成。本發(fā)明進(jìn)一步公開了制備所述豬支原體肺炎滅活疫苗的方法。本發(fā)明滅活疫苗的乳化佐劑中加入了具有親水和疏水基的聚氧乙烯40氫化蓖麻油，顯著增強(qiáng)了疫苗的乳化效果，顯著降低了白油用量和疫苗的粘稠度，減低了注射的難度和動物的應(yīng)激反應(yīng)，抗體在較長的時(shí)間內(nèi)能保持在較高的水平，對仔豬免疫效果顯著。
【專利說明】豬支原體肺炎滅活疫苗及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及滅活疫苗，尤其涉及豬支原體肺炎滅活疫苗，本發(fā)明進(jìn)一步涉及制備 該豬支原體肺炎滅活疫苗的方法，屬于豬支原體肺炎滅活疫苗的制備領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬支原體性肺炎是由豬肺炎支原體引發(fā)的一種慢性肺炎，又稱豬地方流行性肺 炎，其病原最早由Mare、Switzer(1965)和Goodwin等（1965)從患肺炎豬的肺組織中分離 出，并在實(shí)驗(yàn)室復(fù)制出本病，報(bào)導(dǎo)后該病原被命名為M. hyopneumoniae。長期以來，本病被 認(rèn)為是對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失、最常發(fā)生、流行最廣、最難凈化的重要疫病之一。本病 雖為老病，但近年來由于經(jīng)常和豬藍(lán)耳病病毒、豬圓環(huán)病毒等其它病原混合感染，造成重大 的經(jīng)濟(jì)損失而突顯出了其重要性。中國地方豬種對本病明顯較引入品種易感。帶菌豬是本 病的主要傳染源，病原體是經(jīng)氣霧或與病豬的呼吸道分泌物直接接觸傳播，其經(jīng)母豬傳給 仔豬使本病在豬群中持久存在。其嚴(yán)重程度常因管理水平、季節(jié)、通風(fēng)條件、豬的密度以及 其它環(huán)境因素改變而有很大差異，最早可能發(fā)生于2?3周齡（地方品種有9日齡的）的 仔豬，但一般傳播緩慢，在6?10周齡感染較普遍，許多豬直到3?6月齡時(shí)才出現(xiàn)明顯癥 狀。易感豬與帶菌豬接觸后，發(fā)病的潛伏期大的為十天或更長時(shí)間，并且所有自然發(fā)生的病 例均為混合感染，包括支原體、細(xì)菌、病毒及寄生蟲等。
[0003]目前，預(yù)防豬支原體性肺炎的弱毒活疫苗存在操作復(fù)雜、不易推廣的問題，亟待開 發(fā)一種操作簡單，免疫動物后能夠提高體液免疫反應(yīng)和增強(qiáng)免疫效果的豬支原體肺炎滅活 疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種豬支原體肺炎滅活疫苗及其制備方法，該 方法制備工藝簡單，所制備的滅活疫苗免疫動物后能夠提高體液免疫反應(yīng)并增強(qiáng)免疫效 果。
[0005]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：
[0006] 本發(fā)明首先提供了一種豬支原體肺炎滅活疫苗，所述滅活疫苗由水相和油相按照 1 :1-3的體積比組成；其中，所述的水相由吐溫-80和豬肺炎支原體菌液按照2-5 :95-98的 體積比組成；所述的油相由聚氧乙烯40氫化蓖麻油（KolliphorRH40)、司本-80和白油按 照1-2 :5-8 :90-94的體積比組成。
[0007]為了達(dá)到更好的技術(shù)效果，所述滅活疫苗由水相和油相按照1 :1的體積比組成。
[0008] 優(yōu)選的，所述的水相由吐溫-80和豬肺炎支原體菌液按照4 :96的體積比組成；所 述的油相由聚氧乙烯40氫化蓖麻油、司本-80和白油按照1 :6 :93的體積比組成。
[0009] 本發(fā)明還公開了一種制備所述豬支原體肺炎滅活疫苗的方法，包括以下步驟：
[0010] ⑴培養(yǎng)豬肺炎支原體菌液，收獲菌液；⑵加入滅活劑將菌液滅活；⑶制備油相 和水相，將油相和水相混合，乳化；（4)將乳化好的疫苗定量分裝，密封，即得。 toon] 其中，步驟（1)中采用發(fā)酵罐培養(yǎng)的方式培養(yǎng)豬肺炎支原體菌液；所述的培養(yǎng)方 式如下：按發(fā)酵罐容積5% -20%的量將豬肺炎支原體接種到培養(yǎng)基中，優(yōu)選為PPLO肉湯培 養(yǎng)基；在以下培養(yǎng)條件下進(jìn)行培養(yǎng)：溫度37°C、pH值7. 0、攪拌轉(zhuǎn)速40-60r/min，通氣培養(yǎng) 15-96小時(shí)；采用逐步擴(kuò)大培養(yǎng)方式，一直到所需的量；收獲菌液。對收獲的菌液進(jìn)行抗原 濃度測定，要求5XIO8變色單位<抗原水平/頭份< 2XIOltl變色單位。
[0012] 步驟（2)中所述的滅活劑為二乙烯亞胺（BEI)，其終濃度達(dá)到2mmol/L，其中BEI 用2-溴乙胺氫溴酸鹽（BEA)與0. 2mol/L的NaOH溶液在37°C下水浴Ih(每隔15、20min搖 勻一次）配制成所需濃度的BEI滅活液，以0. 22μm濾膜濾器過濾除菌，2?8°C存放備用；
[0013] 加入滅活劑后在37°C下攪拌培養(yǎng)至少24小時(shí)；然后加入硫代硫酸鹽滅菌水溶液 中和過剩的二乙烯亞胺，在37°C下再連續(xù)攪拌培養(yǎng)至少24小時(shí)。
[0014] 步驟（3)中，所述油相的制備方法包括以下步驟：按體積比計(jì)，將白油90-94份 加熱到100°C，加入聚氧乙烯40氫化蓖麻油1-2份，混勻，將油溫降到50°C以后加入司 本-805-8份攪拌均勻，125°C滅菌30分鐘，冷卻后即得；優(yōu)選的，所述油相的制備方法包括 以下步驟：按體積比計(jì)，將白油93份加熱到100°C，加入聚氧乙烯40氫化蓖麻油1份，混勻， 將油溫降到50°C以后加入司本-806份攪拌均勻，125°C滅菌30分鐘，冷卻后即得；
[0015] 步驟（3)中所述水相的制備方法包括以下步驟：按體積比計(jì)，取滅菌的吐 溫-802-5份、檢驗(yàn)合格的豬肺炎支原體菌液95-98份，混合，攪拌至吐溫-80完全溶解，即 得；優(yōu)選的，所述水相的制備方法包括以下步驟：按體積比計(jì)，取滅菌的吐溫-804份、檢驗(yàn) 合格的豬肺炎支原體菌液96份，混合，攪拌至吐溫-80完全溶解，即得。
[0016] 步驟（3)中將油相和水相按照體積比油相：水相=1-3 :1混合；優(yōu)選的，將油相和 水相按照體積比1 :1的比例混合均勻。
[0017] 步驟⑷中所述的乳化是以4, 000r/min乳化30min。乳化后，取樣10ml，以 3,OOOr/min離心15min，不分層，即可將乳化好的疫苗定量分裝，密封。
[0018] 本發(fā)明方法制備得到的豬支原體肺炎滅活疫苗對非靶動物、靶動物安全，單劑量 重復(fù)接種及超大劑量接種安全，免疫后豬精神良好，采食正常，接種后的注射部位均未出現(xiàn) 紅腫現(xiàn)象；對仔豬免疫效果顯著，免疫組肺部病變計(jì)分與對照組差異顯著；免疫期持續(xù)6個(gè) 月仍有很強(qiáng)的免疫效果。
[0019] 本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果：
[0020] 本發(fā)明乳化佐劑中使用具有親水和疏水基的聚氧乙烯40氫化蓖麻油，增強(qiáng)了乳 化效果，減少了白油用量，簡化了生產(chǎn)工藝；通過減少白油的用量，使疫苗的粘稠度降低，減 少了注射的難度同時(shí)顯著減輕了動物的應(yīng)激反應(yīng)；動物實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明制備的豬支原體 肺炎滅活疫苗對非靶動物、靶動物安全，對仔豬免疫效果顯著，使抗體在較長的時(shí)間內(nèi)保持 在一個(gè)較高的水平，免疫期持續(xù)6個(gè)月仍有很強(qiáng)的免疫效果。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合具體實(shí)施例來進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會隨著描述而 更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng) 域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié) 和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0022] 1、菌株
[0023] 豬肺炎支原體P-5722-3株購自美國輝動保公司，商品名稱為：MHPPstockp-3， NL1042, 4/14/88,由哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司保存。
[0024] 實(shí)施例1豬支原體肺炎滅活疫苗的制備
[0025] 1、菌株特點(diǎn)
[0026]I. 1形態(tài)和生化特性
[0027] 豬肺炎支原體P-5722-3株，菌體形態(tài)為環(huán)狀、球狀、絲狀、桿狀或點(diǎn)狀多形態(tài)微生 物，無細(xì)胞壁，革蘭氏染色陰性。
[0028] L 2培養(yǎng)特性
[0029] 在Lps液體培養(yǎng)基中，置37°C培養(yǎng)5-10日，培養(yǎng)基pH值下降0. 5以下，呈現(xiàn)輕度 混濁；在固體培養(yǎng)基上，置37°C、含5%CO2的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)7?10日，低倍顯微鏡下可見 灰白色支原體菌落。大多數(shù)菌落邊緣整齊，有少數(shù)菌落邊緣不整齊，多數(shù)菌落中間沒有"臍" 狀特征。
[0030] 1. 3血清學(xué)特性
[0031] 用代謝抑制試驗(yàn)鑒定，即將豬肺炎支原體菌液用Lps培養(yǎng)基稀釋至IO4?IO5CXU/ ml后，與含有20%的兔抗豬肺炎支原體陽性血清（瓊擴(kuò)效價(jià)不低于1 :16)的Lps培養(yǎng)基等 量混合，同時(shí)設(shè)不加陽性血清的豬肺炎支原體培養(yǎng)物對照管，置37°C培養(yǎng)15日，觀察培養(yǎng) 基顏色變化。對照管PH值下降0.5以上，含陽性血清的試管培養(yǎng)基顏色不發(fā)生變化或pH 值下降低于〇. 5。豬肺炎支原體陽性血清能特異性地抑制豬肺炎支原體對培養(yǎng)基中葡萄糖 的代謝。
[0032] 1. 4安全性
[0033] 用30?50日齡健康易感豬3頭，經(jīng)胸腔接種10頭份/頭或經(jīng)鼻腔接種20頭份 /頭，觀察20日，不出現(xiàn)由注射引起的不良反應(yīng)或死亡。
[0034] 1. 5免疫原性
[0035] 用30?50日齡健康易感豬5頭，用PBS(0.01mol/L，pH值7. 2)將菌液稀釋成 5X106(XU/ml，經(jīng)胸腔內(nèi)接種Iml/頭（或經(jīng)鼻腔內(nèi)接種2ml/頭），同時(shí)設(shè)對照豬5頭，免疫 45日后，連同對照豬用1 :50稀釋的濟(jì)南株豬肺組織強(qiáng)毒（購自中國獸醫(yī)微生物菌種保藏 中心，CVCC354)氣管內(nèi)注射5ml，觀察25日撲殺，檢查肺臟病變并按肺臟病變計(jì)分計(jì)算免疫 原性保護(hù)率。經(jīng)胸腔接種的免疫豬肺臟病變保護(hù)率大于70%，經(jīng)鼻腔接種免疫豬的肺臟病 變保護(hù)率大于60%。
[0036] 2、豬支原體肺炎滅活疫苗的制備
[0037] (1)采用發(fā)酵罐培養(yǎng)豬肺炎支原體菌液。將豬肺炎支原體按發(fā)酵罐容積5% -20% 的量接種到PPLO肉湯培養(yǎng)基中，將溫度調(diào)節(jié)37°C、pH值控制在7. 0、攪拌轉(zhuǎn)速40-60r/min， 通氣培養(yǎng)15-96小時(shí)，采用逐步擴(kuò)大培養(yǎng)方式，一直到所需的量，收獲菌液。
[0038] (2)對收獲的菌液進(jìn)行抗原濃度測定。取35支無菌試管，每一管裝I. 8mlPPLO肉 湯。在第一支試管里加入0. 2ml待測抗原（滅活前原菌液），充分混勻即-1，從中吸取0. 2ml加入第二支試管，依次類推，10倍梯度稀釋，一直到第11支試管即-11，其中從-4到-11每 個(gè)梯度加4支試管。在37°C培養(yǎng)，觀察培養(yǎng)基顏色改變的情況，以顏色發(fā)生變化為依據(jù)，顏 色發(fā)生變化判定為抗原在培養(yǎng)基中具有代謝活力；顏色沒有發(fā)生變化，判定為抗原在培養(yǎng) 基中沒有代謝活力，計(jì)算CCU/ml。參照《中國獸藥典》附錄進(jìn)行病毒半數(shù)致死量、感染量測 定法進(jìn)行計(jì)算。要求，5XIO8變色單位<抗原水平/頭份< 2X101°變色單位。
[0039] (3)將合格的菌液進(jìn)行滅活，在菌液培養(yǎng)的最后階段，培養(yǎng)物pH值達(dá)到7. 8,在該 值至少保持在1小時(shí)內(nèi)無大變化。此時(shí)加入過濾滅菌的二乙烯亞胺（BEI)，其中BEI用2-溴 乙胺氫溴酸鹽（BEA)與0· 2mol/L的NaOH溶液在37°C下水浴Ih(每隔15、20min搖勻一次） 配制成所需濃度的BEI滅活液，以0. 22μm濾膜濾器過濾除菌，2?8°C存放備用。加入后 使其濃度達(dá)到2mmol/L，在溫度37°C下攪拌培養(yǎng)至少24小時(shí)。然后加入硫代硫酸鹽滅菌水 溶液來中和過剩的BEI。在溫度37°C下再連續(xù)攪拌培養(yǎng)至少24小時(shí)。滅活后，用硫代硫酸 鹽中和前，取樣本，用適合的培養(yǎng)基檢測其滅活程度。用適合的培養(yǎng)基進(jìn)行批量樣品的無菌 測試。滅活培養(yǎng)物可被轉(zhuǎn)到滅菌的器皿中置2-7°C保存直至裝瓶。
[0040] (4)將滅活好的菌液進(jìn)行無菌檢驗(yàn)和滅活檢驗(yàn)。無菌檢驗(yàn)根據(jù)現(xiàn)行《中國獸藥典》 附錄進(jìn)行檢驗(yàn)，全部無菌。滅活檢驗(yàn)將經(jīng)過滅活將滅活的菌液用PPLO肉湯稀釋成含5%、 10%、20%，并設(shè)陰性對照，在371：下，8〇17/111，培養(yǎng)16-17日，觀察有無顏色變化，均無顏色 變化判定滅活徹底。
[0041] (5)制備疫苗，通過制備油相和水相，等比例乳化而成。按體積比計(jì)，油相按配方 要求分別量取聚氧乙烯40氫化蓖麻油1份、司本-806份、白油93份，將白油加熱到KKTC 按照體積加入聚氧乙烯40氫化蓖麻油，混勻；將油溫降到50°C以后加入司本-80攪拌均 勻，125°C滅菌30分鐘，冷卻后即得到所述疫苗的油相。水相制備：按體積比計(jì)，取滅菌的吐 溫-804份、檢驗(yàn)合格的菌液96份，導(dǎo)入配苗罐中，勻速攪拌至吐溫-80完全溶解。按體積 比計(jì)，取油相1份置于乳化罐內(nèi)，開動電機(jī)低速攪拌，同時(shí)緩緩加入水相1份，再以4,OOOr/ min乳化30min。乳化后，取樣10ml，以3, 000r/min離心15min，不分層。
[0042] (6)將乳化好的疫苗定量分裝，加蓋密封，即得。
[0043] 實(shí)施例2豬支原體肺炎滅活疫苗的安全性試驗(yàn)
[0044] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例1的制備方法，試制3批豬支原體肺炎滅活疫苗，分別對試制的 3批豬支原體肺炎滅活疫苗進(jìn)行非靶動物、單劑量、超劑量和單劑量重復(fù)注射劑量安全試 驗(yàn)。
[0045] 1、豬支原體肺炎滅活疫苗對非祀動物的安全性試驗(yàn)
[0046] 小白鼠的安全試驗(yàn)，試制的3批疫苗分別皮下注射體重14?24g小白鼠8只，每 只0. 5ml，同時(shí)設(shè)立生理鹽水免疫對照組，觀察14日，觀察有無疫苗所致的不良反應(yīng)。
[0047] 結(jié)果見表1，接種疫苗的小白鼠未出現(xiàn)任何不良反應(yīng)，全部健活，證明本發(fā)明制備 的豬支原體肺炎滅活疫苗對非靶動物使用安全。
[0048] 表1疫苗注射非靶動物安全性試驗(yàn)
[0049]

【權(quán)利要求】
1. 一種豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于：按體積比計(jì)，由水相和油相按照1 :1-3的 比例組成；其中，所述水相由吐溫-80和豬肺炎支原體菌液按照2-5 :95-98的比例組成；所 述油相由聚氧乙烯40氫化蓖麻油、司本-80和白油按照1-2 :5-8 :90-94的比例組成。
2. 按照權(quán)利要求1所述的豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于：由水相和油相按照1 : 1的比例組成。
3. 按照權(quán)利要求1所述的豬支原體肺炎滅活疫苗，其特征在于：所述水相由吐溫-80 和豬肺炎支原體菌液按照4 :96的比例組成；所述油相由聚氧乙烯40氫化蓖麻油、司本-80 和白油按照1 :6 :93的比例組成。
4. 一種制備權(quán)利要求1-3任何一項(xiàng)所述的豬支原體肺炎滅活疫苗的方法，其特征在 于，包括以下步驟： (1)培養(yǎng)豬肺炎支原體菌液，收獲菌液；（2)加入滅活劑將豬肺炎支原體菌液滅活；(3) 制備油相和水相；將油相和水相混合，乳化；(4)將乳化好的疫苗定量分裝，密封，即得。
5. 按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟（1)中采用發(fā)酵罐培養(yǎng)豬肺炎 支原體菌液；所述的培養(yǎng)方式如下：按發(fā)酵罐容積5% -20%的容積量將豬肺炎支原體接種 到培養(yǎng)基中，在以下條件進(jìn)行培養(yǎng)：溫度37°C、pH值7. 0、攪拌轉(zhuǎn)速40-60r/min，通氣培養(yǎng) 15-96小時(shí)，逐步擴(kuò)大培養(yǎng)，收獲菌液。
6. 按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于：步驟（2)中所述滅活劑為二乙烯亞 胺，其終濃度達(dá)到2mmol/L ;加入滅活劑后在37°C下攪拌培養(yǎng)至少24小時(shí)；然后加入硫代 硫酸鹽滅菌水溶液中和過剩的二乙烯亞胺，在37°C下再連續(xù)攪拌培養(yǎng)至少24小時(shí)。
7. 按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中所述油相的制備方法包 括以下步驟：按體積比計(jì)，將白油90-94份加熱到100°C，加入聚氧乙烯40氫化蓖麻油1-2 份，混勻，將油溫降到50°C以后加入司本-805-8份攪拌均勻，125°C滅菌30分鐘，冷卻后即 得； 所述水相的制備方法包括以下步驟：按體積比計(jì)，取滅菌的吐溫-802-5份、豬肺炎支 原體菌液95-98份，混合，攪拌至吐溫-80完全溶解，即得。
8. 按照權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，步驟（3)中所述油相的制備方法包 括以下步驟：按體積比計(jì)，將白油93份加熱到KKTC，加入聚氧乙烯40氫化蓖麻油1份，混 勻，將油溫降到50°C以后加入司本-806份攪拌均勻，125°C滅菌30分鐘，冷卻后即得；所述 水相的制備方法包括以下步驟：按體積比計(jì)，取滅菌的吐溫-804份、檢驗(yàn)合格的豬肺炎支 原體菌液96份，混合，攪拌至吐溫-80完全溶解，即得。
9. 按照權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，步驟（4)中水相和油相按照1 :1-3的 體積比混合；優(yōu)選的，將水相和油相按照1 :1的體積比混合；所述的乳化是以4, OOOr/min 乳化30min。
10. 權(quán)利要求4-9任何一項(xiàng)所述制備方法制備得到的豬支原體肺炎滅活疫苗。
【文檔編號】A61P31/04GK104399070SQ201410605042
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】梁宛楠, 丁國杰, 劉洪斌, 張智明, 王全杰, 毛春玲, 孫凱, 張祎, 李莉莉, 馮聞迪 申請人:哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司