靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因RNAi免疫脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因RNAi免疫脂質(zhì)體及其制備方法和應(yīng)用，該脂質(zhì)體是由包封有NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體表面連接OX-42單克隆抗體而得，其制備方法簡單，獲得的免疫脂質(zhì)體可以主動靶向小膠質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞中釋放出并表達(dá)NLRP3基因的RNAi序列，抑制NLRP3的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎癥的作用，具有高效、低毒、制備方法簡單等優(yōu)點(diǎn)，可用于制備抗炎癥的藥物，在抑制腦出血繼發(fā)炎癥反應(yīng)方面具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂質(zhì)體及其制備方 法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂質(zhì) 體，還涉及該脂質(zhì)體得其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 腦出血是指非外傷性腦實(shí)質(zhì)出血，多由于高血壓導(dǎo)致血管破裂引起，是一種常見 的神經(jīng)系統(tǒng)危重癥，因其高發(fā)病率，高致殘率，高死亡率而受到廣泛關(guān)注。隨著人民生活水 平的提高及老齡化的到來，腦出血發(fā)病率也呈上升趨勢。根據(jù)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，每年腦出 血死亡患者人數(shù)約為全部疾病死亡患者人數(shù)的20%。目前腦出血的內(nèi)科治療以脫水降顱 壓，清除自由基，營養(yǎng)神經(jīng)及對癥支持治療為主，近年尚無突破性的治療方法。大量研究表 明，腦出血后存在明顯的炎癥反應(yīng)，炎癥反應(yīng)參與了腦出血后繼發(fā)性腦水腫和腦損害等病 理過程。腦出血后血腫周圍小膠質(zhì)細(xì)胞等炎性細(xì)胞激活，釋放TNF-α、IL_1等致炎因子，力口 之血腦屏障破壞，外周血單核巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞向血腫周邊區(qū)聚集，由此誘發(fā)炎癥級聯(lián) 放大反應(yīng)，最終導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷和神經(jīng)功能缺損加劇。目前針對下游細(xì)胞因子等抗炎治 療的臨床試驗(yàn)結(jié)果并未顯示出顯著的神經(jīng)保護(hù)效應(yīng)。
[0003] 固有免疫又稱為非特異性免疫，它被認(rèn)為是機(jī)體防御的第一道防線，參與固有 免疫的細(xì)胞包括吞噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞和上皮細(xì)胞等。其中吞噬細(xì)胞通過模式識別受體 (Pattern recognition receptor, PRR)識別和吞噬病原體或分泌多種炎性細(xì)胞因子促 進(jìn)炎癥反應(yīng)。PRR主要表達(dá)于固有免疫細(xì)胞表面，可識別一種或多種病原相關(guān)分子模式 (PAMP)的識別分子，包括膜結(jié)合受體Toll樣受體和C型外源凝集物。近來研究更多的PRR 為胞內(nèi)PRR即NOD樣受體（NLR)，它可以識別PAMP以及危險(xiǎn)相關(guān)分子模式（DAMP)。其被激活 后形成可以活化胱天蛋白酶-1的"炎癥體"，進(jìn)而誘導(dǎo)白介素 IL-Ιβ和IL-18的成熟與分 泌并引起炎癥反應(yīng)。NLRP3炎癥體是一個(gè)明確的炎癥體，它由NLRP3支架、ASC和caspase-1 三部分組成。但是，目前未見利用NLRP3炎癥體進(jìn)行抗炎治療的報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂 質(zhì)體；本發(fā)明的目的之二在于提供靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂質(zhì)體的制備方 法；本發(fā)明的目的之三在于提供靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂質(zhì)體的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 1、靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂質(zhì)體，所述免疫脂質(zhì)體是由包封有 NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體表面連接0X-42單克隆抗體而得，所述NLRP3基因的 RNAi重組真核表達(dá)載體含有SEQ ID No. 1與SEQ ID No. 2退火形成的序列。
[0007] 優(yōu)選的，所述NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體由SEQ ID No. 1與SEQ ID No. 2 退火后連人pGenesil-Ι載體的多克隆酶切位點(diǎn)處。
[0008] 優(yōu)選的，所述多克隆酶切位點(diǎn)為Not I和Xba I。
[0009] 2、所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂質(zhì)體的制備方法，包括如下步 驟：將SEQ ID No. 1與SEQ ID No. 2退火后連入pGenesil-Ι載體的多克隆酶切位點(diǎn)處，得 NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體；然后采用逆向蒸發(fā)法包封所得NLRP3基因的RNAi重 組真核表達(dá)載體，再與經(jīng)巰基化修飾的0X-42單克隆抗體連接，得靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3 基因 RNAi免疫脂質(zhì)體。
[0010] 優(yōu)選的，逆向蒸發(fā)法具體為：將卵磷脂和甘油三脂溶解于乙醚中，減壓蒸餾除去有 機(jī)溶劑，水浴超聲，再加入NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體，在42°C水浴和干冰中反復(fù) 凍融，并通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器，接著用核糖核酸酶I和核酸外切酶III降解，再 用瓊脂凝膠柱分離除去降解的核酸，即可。
[0011] 更優(yōu)選的，所述卵磷脂和甘油三脂的重量比為5:1。
[0012] 3、所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂質(zhì)體在制備治療腦出血后小膠 質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷的藥物中應(yīng)用。
[0013] 優(yōu)選的，所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂質(zhì)體在制備抑制小膠質(zhì)細(xì) 胞炎癥因子的藥物中的應(yīng)用。
[0014] 優(yōu)選的，所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂質(zhì)體在制備減輕腦出血腦 水腫的藥物中的應(yīng)用。
[0015] 優(yōu)選的，所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂質(zhì)體在制備提高腦出血神 經(jīng)功能的藥物中的應(yīng)用。
[0016] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因 RNAi免疫脂 質(zhì)體，通過將NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體包封在脂質(zhì)體中形成納米級顆粒，并且 與0X-42單克隆抗體相連接，制成免疫脂質(zhì)體，然后利用0X-42主要表達(dá)于活化的小膠質(zhì)細(xì) 胞，使免疫脂質(zhì)體可以主動靶向小膠質(zhì)細(xì)胞，在細(xì)胞中釋放出NLRP3基因的RNAi重組真核 表達(dá)載體并表達(dá)NLRP3基因的RNAi，抑制NLRP3的表達(dá)，從而發(fā)揮抗炎癥的作用，該方法具 有高效、低毒等優(yōu)點(diǎn)，可以用于制備抗炎癥的藥物，在腦出血炎癥治療方面具有良好的應(yīng)用 前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0018] 圖1為瓊脂糖凝膠電泳檢測pGeneSil-l-NLRP3 RNAi的雙酶切產(chǎn)物。
[0019] 圖2為透射電子顯微鏡觀察基于NLRP3基因的RNAi免疫脂質(zhì)體。
[0020] 圖3為脂質(zhì)體瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0021] 圖4為免疫脂質(zhì)體瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0022] 圖5為ELISA檢測脂質(zhì)體連接抗體圖。
[0023] 圖6為Western blot檢測NLRP3的表達(dá)（其中1為對照組；2為免疫脂質(zhì)體）。
[0024] 圖7為酶聯(lián)免疫（ELISA)法檢測紅細(xì)胞裂解液刺激小膠質(zhì)細(xì)胞分泌IL-8和 TNF-α的能力。
[0025] 圖8為免疫脂質(zhì)體對腦出血小鼠腦水腫影響的檢測。
[0026] 圖9為免疫脂質(zhì)體對腦出血小鼠神經(jīng)功能影響的檢測。

【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0028] 實(shí)施例1、基于NLRP3基因的RNAi的免疫脂質(zhì)體的制備
[0029] 1、構(gòu)建NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體
[0030] 設(shè)計(jì)出2條反向重復(fù)序列，具體如下：
[0031] 5' _gatcggaagcagtttgaagaattattcaagacgtaattcttcaaactgcttctttttta_3' (SEQ ID NO. 1) #口 3'_ccttcgtcaaacttcttaataagttctgcattaagaagtttgacgaagaaaaaattcga_5' ( SEQ ID NO. 2)。上述DNA鏈退火后通過T4連接酶連接于pGenesil-1載體的NotI和XbaI 酶切位點(diǎn)之間，得NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體，簡稱為pGenesil-l-NLRP3 RNAi。 然后將pGeneSil-l-NLRP3 RNAi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，然后用含有氨 芐青霉素的LB平板篩選陽性克隆，陽性克隆接種于含有氨芐青霉素的LB液體培養(yǎng)基中進(jìn) 行增菌培養(yǎng)，大量抽提質(zhì)粒，所得質(zhì)粒用Not I和Xba I在37°C條件下雙酶切120分鐘，酶 切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，圖1中M泳道為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，1泳道為 PCR產(chǎn)物。由圖1可知，酶切產(chǎn)物有2條帶，且與目的片段大小相符。
[0032] 2、包封pGenesil-l-NLRP3 RNAi重組真核表達(dá)載體的脂質(zhì)體
[0033] 采用逆向蒸發(fā)法制備：將卵磷脂2g和甘油三脂0. 4g溶解于乙醚60mL中，減壓蒸 餾除去有機(jī)溶劑，水浴超聲5分鐘，再加入濃度為0. 5mg/mL的pGeneSil-l-NLRP3 RNAi溶 液20mL，在42°C水浴和干冰中反復(fù)凍融，并連續(xù)數(shù)次通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器（上 海光健公司），得NLRP3基因的RNAi免疫脂質(zhì)體，簡稱為Lip-NLRP3 RNAi。未包封入脂質(zhì) 體的pGenesil-l_NLRP3 RNAi用核酸酶Dnase I和exonuclease III (上海亞培公司）于 37°C作用1小時(shí)后用乙二胺四乙酸終止反應(yīng)，用瓊脂糖凝膠CL-4B柱（北方偉業(yè)公司）分離 包封入脂質(zhì)體的pGenesil-l-NLRP3 RNAi和被核酸酶降解的pGenesil-l-NLRP3 RNAi (由 于脂質(zhì)體比pGenesil-l-NLRP3 RNAi大，因此可通過瓊脂凝膠過濾色譜將二者分離）。
[0034] 將制備的Lip-NLRP3 RNAi透射電鏡觀察，具體為：將Lip-NLRP3 RNAi用濃度為 3g/L的磷鎢酸溶液負(fù)染后，滴至專用銅網(wǎng)上，自然風(fēng)干，置透射電子顯微鏡下觀察脂質(zhì)體的 形態(tài)結(jié)構(gòu)和粒徑分布，結(jié)果如圖2所示。結(jié)果顯示，所得Lip-NLRP3 RNAi為球形或近球形 小囊泡，粒徑分布范圍為50?80nm，平均粒徑低于100nm。
[0035] 將制備的Lip-NLRP3 RNAi進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測：將相同質(zhì)量的 pGenesil-l-NLRP3 RNAi經(jīng)反復(fù)凍融的脂質(zhì)體、通過IOOnm薄膜擠出器的脂質(zhì)體以及經(jīng)核 酸酶Dnase I和exonuclease III消化的脂質(zhì)體同時(shí)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察， 結(jié)果如圖3所示。結(jié)果顯示，經(jīng)核酸酶Dnase I和exonuclease III處理后，未包封入脂質(zhì) 體的pGenesil-l-NLRP3 RNAi已經(jīng)被降解，而脂質(zhì)體能夠抵抗核酸酶的降解。同時(shí)通過Gel pro analyzer 4.0 software軟件比較凝膠圖中DNA的條帶亮度，計(jì)算總DNA量和未包封入 脂質(zhì)體的DNA量，再根據(jù)公式：包封率=[(總DNA量一未包封入脂質(zhì)體的DNA量）/總DNA 量]X 100%，計(jì)算得到pGenesil-l-NLRP3 RNAi的包封率約為85. 6%。
[0036] 3、羊抗小鼠0X-42單克隆抗體連接Lip-NLRP3 RNAi
[0037] 將羊抗小鼠0X-42單克隆抗體（SantaCruz公司）經(jīng)巰基化修飾后，與Lip-NLRP3 RNAi在室溫下輕搖連接過夜，得連接羊抗小鼠0X-42單克隆抗體的Lip-NLRP3 RNAi (簡稱 為 Anti-0X-42-Lip-NLRP3 RNAi)。然后用瓊脂糖凝膠 CL-4B 柱分離 Anti-0X-42-Lip-NLRP3 RNAi和未連接的羊抗小鼠0X-42單克隆抗體（由于免疫脂質(zhì)體比抗體大，因此可通過凝膠 過濾色譜將二者分離）。
[0038] 瓊脂糖凝膠電泳檢測：分別向收集到的Anti-0X-42-Lip-NLRP3 RNAi和未連接的 抗0X-42單克隆抗體，加入濃度為5g/L的十二烷基硫酸鈉（SDS)溶液（SDS能破壞脂質(zhì)體 的膜表面結(jié)構(gòu)，從而使脂質(zhì)體釋放內(nèi)部的包裹物），同時(shí)設(shè)置不加入SDS的空白對照，混勻 靜置，取上清液在濃度為5g/L的瓊脂糖凝膠下電泳，紫外燈下觀察，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果 顯示，加入SDS的Anti-0X-42-Lip-NLRP3 RNAi有一明亮的DNA條帶，而不加入SDS的羊抗 小鼠 0X-42單克隆抗體無相應(yīng)條帶出現(xiàn)。
[0039] ELISA檢測：將收集到的Anti-0X-42-Lip-NLRP3 RNAi和未連接的羊抗小鼠 0X-42 單克隆抗體分別包被96孔板，以HRP標(biāo)記的兔抗羊IgG為一抗做直接ELISA實(shí)驗(yàn)，以確定 脂質(zhì)體表面是否已連接上抗體，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，Anti-0X-42-Lip-NLRP3 RNAi 和羊抗小鼠 0X-42單克隆抗體都呈陽性反應(yīng)，說明脂質(zhì)體表面已連接上抗體。
[0040] 實(shí)施例2、免疫脂質(zhì)體的抗炎效應(yīng)研究
[0041] 1、紅細(xì)胞裂解物處理免疫脂質(zhì)體后小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3的檢測
[0042] 將10 μ L紅細(xì)胞裂解液加入0· Img的Anti-0X-42-Lip-NLRP3 RNAi孵育的 小膠質(zhì)細(xì)胞或未孵育的對照小膠質(zhì)細(xì)胞，然后在37 °C條件下處理24小時(shí)，用Western blotting (WB)法檢測紅細(xì)胞裂解液刺激免疫脂質(zhì)體小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3表達(dá)情況，結(jié)果如 圖6所示。結(jié)果顯示，免疫脂質(zhì)體孵育的小膠質(zhì)細(xì)胞NLRP3的表達(dá)少于對照小膠質(zhì)細(xì)胞。
[0043] 2、紅細(xì)胞裂解物處理免疫脂質(zhì)體后小膠質(zhì)細(xì)胞的炎癥因子的檢測
[0044] 將10 μ L紅細(xì)胞裂解液加入0. Img的免疫脂質(zhì)體孵育的小膠質(zhì)細(xì)胞或?qū)φ招∧z質(zhì) 細(xì)胞，然后在37°C條件下處理24小時(shí)，用ELISA法檢測紅細(xì)胞裂解液刺激小膠質(zhì)細(xì)胞分泌 IL-8和TNF-α的能力，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，免疫脂質(zhì)體孵育的小膠質(zhì)細(xì)胞所分泌 的IL-8和TNF-α均少于對照小膠質(zhì)細(xì)胞。
[0045] 3、腦出血小鼠的腦水腫的檢測
[0046] 取25 μ L自體全血注射到小鼠基底節(jié)，10分鐘后于相同部位注射Img的免疫脂質(zhì) 體或注射等量的PBS (對照組）。3天后，處死小鼠，取得腦組織，并用干濕重法檢測小鼠的 腦水腫情況，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示，與對照小膠質(zhì)細(xì)胞相比，免疫脂質(zhì)體能明顯減輕 腦出血小鼠的腦水腫。
[0047] 4、腦出血小鼠的神經(jīng)功能的檢測
[0048] 取25 μ L自體全血注射到小鼠基底節(jié)，10分鐘后于相同部位注射Img的免疫脂質(zhì) 體或注射等量的PBS (對照組）。3天后，用神經(jīng)功能評分法，觀察小鼠的神經(jīng)功能，結(jié)果如 圖9所示。結(jié)果顯示，與對照小膠質(zhì)細(xì)胞相比，免疫脂質(zhì)體能明顯提高小鼠的神經(jīng)功能。 [0049] 最后說明的是，以上優(yōu)選實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管通 過上述優(yōu)選實(shí)施例已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的描述，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以在 形式上和細(xì)節(jié)上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發(fā)明權(quán)利要求書所限定的范圍。
【權(quán)利要求】
1. 靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因RNAi免疫脂質(zhì)體，其特征在于：所述免疫脂質(zhì)體是由 包封有NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體表面連接0X-42單克隆抗體而得，所述NLRP3 基因的RNAi重組真核表達(dá)載體含有SEQ ID No. 1與SEQ ID No. 2退火形成的序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因RNAi免疫脂質(zhì)體，其特征在于： 所述NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體由SEQ ID No. 1與SEQ ID No. 2退火后連人 pGenesil-1載體的多克隆酶切位點(diǎn)處。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因RNAi免疫脂質(zhì)體，其特征在于： 所述多克隆酶切位點(diǎn)為Not I和Xba I。
4. 權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因RNAi免疫脂質(zhì)體的制備 方法，其特征在于，包括如下步驟：將SEQ ID No. 1與SEQ ID No. 2退火后連入pGenesil-1 載體的多克隆酶切位點(diǎn)處，得NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體；然后采用逆向蒸發(fā)法 包封所得NLRP3基因的RNAi重組真核表達(dá)載體，再與經(jīng)巰基化修飾的0X-42單克隆抗體連 接，得靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因RNAi免疫脂質(zhì)體。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的制備方法，其特征在于，逆向蒸發(fā)法具體為：將卵磷脂和甘油 三脂溶解于乙醚中，減壓蒸餾除去有機(jī)溶劑，水浴超聲，再加入NLRP3基因的RNAi重組真核 表達(dá)載體，在42°C水浴和干冰中反復(fù)凍融，并通過孔徑為IOOnm的薄膜擠出器，接著用核糖 核酸酶I和核酸外切酶III降解，再用瓊脂凝膠柱分離除去降解的核酸，即可。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于：所述卵磷脂和甘油三脂的重量比為 5:1。
7. 權(quán)利要求1?3任一項(xiàng)所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因RNAi免疫脂質(zhì)體在制備 治療腦出血后小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥損傷的藥物中應(yīng)用。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因RNAi 免疫脂質(zhì)體在制備抑制小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子的藥物中的應(yīng)用。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因RNAi 免疫脂質(zhì)體在制備減輕腦出血腦水腫的藥物中的應(yīng)用。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于：所述靶向小膠質(zhì)細(xì)胞的NLRP3基因RNAi 免疫脂質(zhì)體在制備提高腦出血神經(jīng)功能的藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P7/00GK104306996SQ201410604704
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日
【發(fā)明者】楊曌 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬永川醫(yī)院