4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚在制藥中的應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種吡唑啉衍生物的藥物用途，尤其涉及4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚在制備抑制脂肪肝或穩(wěn)定動(dòng)脈硬化斑塊藥物中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚的結(jié)構(gòu)式為：分子式：C20H16ClN3O分子量：349.81，性狀：淺黃色固體，熔點(diǎn)：172-173℃。吡唑啉化合物具有廣泛的生物活性，可用作抗菌消炎、止痛、抗癌和抗驚厥等藥物。目前，部分該類化合物已作為臨床藥物使用。其中，最具代表性的為1-(3-三氟甲基苯基)-3-氨基吡唑啉，它具有很好的抗炎療效。因此，近年來(lái)，關(guān)于吡唑啉類衍生物的藥物活性的研究倍受關(guān)注。至今，已設(shè)計(jì)合成具有單胺氧化酶選擇抑制活性的該類化合物，對(duì)由單胺氧化酶比例失調(diào)引起的疾病的治療研究具有重要意義。已報(bào)道的某些具有抗高血壓和抗抑郁活性的藥物分子具有吡唑啉結(jié)構(gòu)單元。另外，已報(bào)道該類化合物具有顯著的抑制低濃度脂蛋白氧化等作用。此外，一些多取代的吡唑啉衍生物具有良好的熒光性質(zhì)，可作為分子探針和熒光開關(guān)等。臨床常用的調(diào)節(jié)血脂異常的化合物可分為5類：(1)他汀類(2)貝特類(3)煙酸類(4)樹脂類(5)膽固醇吸收抑制劑。其中，近二十年來(lái)臨床研究顯示他汀類是當(dāng)前防治高膽固醇血癥和動(dòng)脈粥樣硬化性疾病非常重要的藥物。雖然大多數(shù)人對(duì)他汀類藥物耐受性良好，但是它也會(huì)造成許多副作用，包括痛疼、失眠、抑郁、以及消化不良、腹瀉、腹痛、惡心等消化道癥狀。他汀類藥物還可引起肌病，包括肌痛、肌炎和橫紋肌溶解。因此，發(fā)展新的調(diào)節(jié)血脂和防治動(dòng)脈粥樣硬化性的藥物具有重要意義。而有關(guān)吡唑啉化合物的生物活性，在調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝和穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的研究，國(guó)內(nèi)外鮮見報(bào)道?；谶吝蜻衔锏亩喾N生物活性，設(shè)計(jì)開發(fā)能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝進(jìn)而防止動(dòng)脈粥樣硬化的新型藥物具有重大意義。然而經(jīng)檢索有關(guān)利用4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚的熒光特性直接觀察其定位情況，示蹤小分子的分布。同時(shí)，利用4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚的生物活性以及自發(fā)熒光的特性，研究其在脂肪肝和動(dòng)脈硬化中的作用機(jī)制以及制備抑制脂肪肝和穩(wěn)定動(dòng)脈硬化斑塊藥物中的應(yīng)用，目前尚未見報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明要解決的問題是提供一種4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚在制備抑制脂肪肝或穩(wěn)定動(dòng)脈硬化斑塊藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明所述4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚在制備抑制脂肪肝或穩(wěn)定動(dòng)脈硬化斑塊藥物中的應(yīng)用。其中：有效抑制脂肪肝或穩(wěn)定小鼠動(dòng)脈硬化斑塊的4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚劑量為5～20μg/kg/day；優(yōu)選劑量為20μg/kg/day。所述小鼠是apoE-/-小鼠。本發(fā)明提供的4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚為研制開發(fā)治療脂肪肝以及動(dòng)脈硬化的藥物奠定了基礎(chǔ)。本發(fā)明提供的4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚還可作為一種有效的工具，用于脂質(zhì)代謝異常和動(dòng)脈硬化斑塊不穩(wěn)定的分子機(jī)制的研究。為了更好地理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，下面用4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚的藥理實(shí)驗(yàn)及結(jié)果來(lái)闡明其在制備抑制脂肪肝和穩(wěn)定動(dòng)脈硬化斑塊藥物中的用途。本發(fā)明所述4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚的制備：向查耳酮(1.0mmol)的乙醇溶液(15mL)中加入2-肼基吡啶(1.2mmol)和氫氧化鈉(3.0mmol)。反應(yīng)混合物繼續(xù)回流4小時(shí)。利用薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，并用冷水稀釋，鹽酸中和。過(guò)濾，所得粗品用水和乙醇洗滌，用乙醇重結(jié)晶。產(chǎn)率為36.0％，mp:172-173℃。IR(KBr,cm-1):3066.0,3031.5,1588.9,1476.0,1443.9,1255.9,1145.2,760.4,692.9；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ3.28(dd,1H,J＝5.6,17.4Hz,4-Htrans),3.89(dd,1H,J＝12.4,17.4Hz,4-Hcis),5.81(dd,1H,J＝5.6,12.4Hz,5-Hofpyrazoline),6.70(dd,1H,J＝5.3,6.7Hz,pyridine-H),6.99(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.12(d,1H,J＝2.5Hz,Ar-H),7.22(dd,1H,J＝2.5,8.8Hz,Ar-H),7.25-7.32(m,6H,Ar-H+pyridine-H),7.56(m,1H,pyridine-H),8.07(d,1H,J＝4.2Hz,pyridine-H),10.61(s,1H,OH).HRMS:calcdfor[M+H]+C20H17ClN3O:350.1060；found:350.1052.采用細(xì)胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的方法，以如下實(shí)驗(yàn)研究和觀察本發(fā)明所述4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚(以下試驗(yàn)中簡(jiǎn)稱FPD5)在抑制脂肪肝或穩(wěn)定動(dòng)脈硬化斑塊中的作用。1.FPD5對(duì)apoE-/-小鼠脂肪肝的影響基于申請(qǐng)人前期實(shí)驗(yàn)表明FPD5可以與酯酶D(簡(jiǎn)稱ESD)相互作用，促進(jìn)ESD的活性，同時(shí)，有效地抑制肝細(xì)胞中由氧化型低密度脂蛋白膽固醇(ox-LDL)引起的ESD活性的下調(diào)(見圖1)。取apoE-/-小鼠作為實(shí)驗(yàn)材料，分別檢測(cè)四組不同處理(基準(zhǔn)組:無(wú)注射；對(duì)照組：二甲基亞砜溶劑/PBS：v/v＝1:4，100μL；FPD5高劑量組：20μg/kg/day；FPD5低劑量組：5μg/kg/day)的小鼠血清中血脂的變化，肝組織中ESD的活性，取肝臟組織冷凍切片進(jìn)行HE染色，取血清進(jìn)行ELISA檢測(cè)，提取肝臟RNA進(jìn)行熒光定量PCR。結(jié)果表明：(1)FPD5處理對(duì)小鼠體重沒有顯著影響，但與基準(zhǔn)組相比，對(duì)照組血清中總膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白膽固醇水平上調(diào)；與對(duì)照組相比，F(xiàn)PD5高低劑量組血清中總膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白膽固醇三者水平均下調(diào)(見圖2)。(2)與基準(zhǔn)組相比，對(duì)照組ESD活性顯著下調(diào)，肝臟脂質(zhì)變性加劇，炎性水平與纖維化程度加重；與對(duì)照組相比，F(xiàn)PD5高低劑量組均顯著上調(diào)ESD活性，肝臟的脂質(zhì)變性，炎性水平以及纖維化程度明顯減輕(見圖3)。2.FPD5對(duì)apoE-/-小鼠動(dòng)脈硬化斑塊大小的影響用apoE-/-小鼠作為實(shí)驗(yàn)材料，取其主動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色，主動(dòng)脈根的冷凍切片進(jìn)行HE染色。結(jié)果表明：(1)與基準(zhǔn)組相比，對(duì)照組斑塊顯著增大；與對(duì)照組相比，F(xiàn)PD5高低劑量組均顯著降低斑塊的大小。(2)與基準(zhǔn)組相比，對(duì)照組主動(dòng)脈根處斑塊壞死核心面積顯著增大；與對(duì)照組相比，F(xiàn)PD5高低劑量組均顯著降低斑塊壞死核心的面積(見圖4)。3.FPD5對(duì)動(dòng)脈硬化斑塊組成成分的影響用apoE-/-小鼠作為實(shí)驗(yàn)材料，取其主動(dòng)脈根冷凍切片進(jìn)行油紅O染色，Masson染色分別檢測(cè)斑塊中脂質(zhì)的積累以及膠原的含量；利用免疫熒光法檢測(cè)斑塊中平滑肌細(xì)胞的含量以及巨噬細(xì)胞類型。結(jié)果表明：(1)與基準(zhǔn)組相比，對(duì)照組斑塊中脂質(zhì)的含量顯著提高，膠原的含量顯著降低，斑塊趨于不穩(wěn)定；與對(duì)照組相比，F(xiàn)PD5高低劑量組均可顯著降低斑塊中脂質(zhì)的含量，提高膠原的含量以及抗炎性巨噬細(xì)胞的含量，高劑量組降低斑塊中促炎性巨噬細(xì)胞的含量，進(jìn)而提高斑塊的穩(wěn)定性。綜上，F(xiàn)PD5處理可以顯著改善斑塊的結(jié)構(gòu)(見圖5、6)。由上述實(shí)驗(yàn)及其結(jié)果，可以得出如下結(jié)論：在高脂喂養(yǎng)條件下，劑量為5-20μg/kg/day的FPD5腹腔注射處理apoE-/-小鼠可以有效地改善血脂異常的現(xiàn)象，抑制肝臟的脂質(zhì)變性和纖維化，同時(shí)降低斑塊大小，改善斑塊結(jié)構(gòu)，提高斑塊的穩(wěn)定性。其中劑量為20μg/kg/day的FPD5作用效果比較明顯。肝臟功能的損傷會(huì)造成脂質(zhì)代謝異常引發(fā)血脂異常，進(jìn)而影響動(dòng)脈硬化斑塊的發(fā)生與發(fā)展。而動(dòng)脈硬化斑塊的穩(wěn)定性在很大程度上取決于斑塊的大小和斑塊的組成成分。提高斑塊的穩(wěn)定性將大大降低臨床急性事件的發(fā)生，具有重大臨床意義?；诖耍景l(fā)明提供了一種4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚及其在制備抑制脂肪肝或穩(wěn)定動(dòng)脈硬化斑塊藥物中的應(yīng)用。實(shí)驗(yàn)證實(shí)本發(fā)明涉及的FPD5可以作為一種有效的工具，用于脂肪肝以及動(dòng)脈硬化斑塊不穩(wěn)定的分子機(jī)制研究，同時(shí)本發(fā)明為研制開發(fā)有關(guān)脂質(zhì)代謝異常以及動(dòng)脈硬化治療藥物奠定了基礎(chǔ)。附圖說(shuō)明圖1，4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚(FPD5)與酯酶D(ESD)共定位，有效地促進(jìn)ESD的活性，抑制由氧化型低密度脂蛋白膽固醇(ox-LDL)引起的ESD活性的下調(diào)。其中：A：免疫熒光法檢測(cè)FPD5與ESD共定位情況。B：免疫沉淀法檢測(cè)FPD5阻斷ESD特異性抗體與ESD結(jié)合的能力。C：檢測(cè)FPD5對(duì)人肝臟細(xì)胞中ESD活性的影響。D：檢測(cè)FPD5對(duì)ox-LDL(50μg/mL)處理?xiàng)l件下(24h)人肝臟細(xì)胞中ESD活性的影響。圖2，F(xiàn)PD5處理對(duì)apoE-/-小鼠血脂的影響。圖3，F(xiàn)PD5處理對(duì)apoE-/-小鼠肝臟的影響。其中：A：檢測(cè)肝臟中ESD的活性。B：HE染色檢測(cè)肝臟組織脂質(zhì)變性情況。C：熒光定量PCR檢測(cè)肝臟組織中腫瘤壞死因子α的mRNA水平。D：ELISA檢測(cè)血清中腫瘤壞死因子α的水平。E:熒光定量PCR檢測(cè)肝臟組織中轉(zhuǎn)化因子β1和膠原蛋白α1的mRNA水平。圖4，F(xiàn)PD5處理對(duì)apoE-/-小鼠斑塊大小的影響。其中：A：油紅O染色檢測(cè)整條主動(dòng)脈斑塊的大小。B：HE染色檢測(cè)主動(dòng)脈根處斑塊中壞死核心的大小。圖5，F(xiàn)PD5處理對(duì)apoE-/-小鼠斑塊組成成分的影響。其中：A：油紅O染色檢測(cè)主動(dòng)脈根處斑塊中脂質(zhì)的含量。B：Masson染色檢測(cè)主動(dòng)脈根處斑塊中膠原的含量。C：免疫熒光法檢測(cè)主動(dòng)脈處斑塊中平滑肌細(xì)胞的含量。圖6，F(xiàn)PD5處理對(duì)apoE-/-小鼠斑塊中巨噬細(xì)胞類型的影響。其中：A：免疫熒光法檢測(cè)主動(dòng)脈處斑塊中促炎性巨噬細(xì)胞的含量。B：免疫熒光法檢測(cè)主動(dòng)脈處斑塊中抗炎性巨噬細(xì)胞的含量。C：定量統(tǒng)計(jì)促炎性巨噬細(xì)胞的含量。D：定量統(tǒng)計(jì)抗炎性巨噬細(xì)胞的含量。圖7，實(shí)驗(yàn)線路圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1：4-氯-2-(5-苯基-1-(吡啶-2-基)-4,5-二氫-1H-吡唑-3-基)苯酚(FPD5)的制備向查耳酮(1.0mmol)的乙醇溶液(15mL)中加入2-肼基吡啶(1.2mmol)和氫氧化鈉(3.0mmol)。反應(yīng)混合物繼續(xù)回流4小時(shí)。利用薄層色譜法監(jiān)測(cè)反應(yīng)過(guò)程。反應(yīng)完成后，冷卻至室溫，并用冷水稀釋，鹽酸中和。過(guò)濾，所得粗品用水和乙醇洗滌，用乙醇重結(jié)晶。產(chǎn)率為36.0％，mp:172-173℃。IR(KBr,cm-1):3066.0,3031.5,1588.9,1476.0,1443.9,1255.9,1145.2,760.4,692.9；1HNMR(400MHz,CDCl3):δ3.28(dd,1H,J＝5.6,17.4Hz,4-Htrans),3.89(dd,1H,J＝12.4,17.4Hz,4-Hcis),5.81(dd,1H,J＝5.6,12.4Hz,5-Hofpyrazoline),6.70(dd,1H,J＝5.3,6.7Hz,pyridine-H),6.99(d,1H,J＝8.8Hz,Ar-H),7.12(d,1H,J＝2.5Hz,Ar-H),7.22(dd,1H,J＝2.5,8.8Hz,Ar-H),7.25-7.32(m,6H,Ar-H+pyridine-H),7.56(m,1H,pyridine-H),8.07(d,1H,J＝4.2Hz,pyridine-H),10.61(s,1H,OH).HRMS:calcdfor[M+H]+C20H17ClN3O:350.1060；found:350.1052.實(shí)施例2：FPD5對(duì)apoE-/-小鼠脂肪肝的影響基于前期實(shí)驗(yàn)表明FPD5(0.01μM-0.5μM)可以與酯酶D(ESD)相互作用，促進(jìn)ESD的活性，同時(shí)，有效地抑制肝細(xì)胞中由氧化型低密度脂蛋白膽固醇(ox-LDL)引起的ESD活性的下調(diào)(見圖1)，申請(qǐng)人選擇5μg/kg/day和20μg/kg/day的劑量探索FPD5對(duì)脂肪肝以及動(dòng)脈硬化斑塊穩(wěn)定性的影響。取八周齡的apoE-/-小鼠(北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司購(gòu)買)進(jìn)行高脂飼料喂養(yǎng)(配方：0.25％膽固醇+15％豬油+85％普通飼料)，至取材截止。實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分成四組：基準(zhǔn)組(無(wú)注射)，對(duì)照組(二甲基亞砜溶劑/PBS：v/v＝1:4，100μL)，F(xiàn)PD5高劑量組(20μg/kg/day)，F(xiàn)PD5低劑量組(5μg/kg/day)。基準(zhǔn)組在高脂喂養(yǎng)30周之后解剖，其他組繼續(xù)高脂喂養(yǎng)并分別進(jìn)行腹腔注射8周，具體處理方式見圖7。將上述各組按實(shí)驗(yàn)要求處理完畢的小鼠進(jìn)行脫臼處死，取血清并剝離肝臟和主動(dòng)脈。消化法收集肝臟組織蛋白，4℃12000g離心10min，取上清，向提取的蛋白裂解物內(nèi)加入10μLESD一抗和25μLProteinA+Gagarose，4℃緩慢搖動(dòng)過(guò)夜；3000g，4℃離心5min，棄上清；裂解液洗珠子3次，裂解液用量每次為500μL；加入60μL反應(yīng)物(0.013g4-甲基傘形酮酰醋酸酯+596μLDMF，1:200稀釋)，反應(yīng)3min，加入90μL檸檬酸(0.387檸檬酸+30mL水)終止反應(yīng)，熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)ESD活性。檢測(cè)肝組織中ESD的活性。取部分肝臟組織進(jìn)行冷凍包埋并切片，進(jìn)行HE染色，冷丙酮固定切片10min；0.1MPBS(pH7.2～7.4)浸泡兩次，每次10min；梯度酒精脫脂。將切片依次放入100％、95％、80％乙醇中各3min，最后放入自來(lái)水中2min；蘇木精染色30s；蒸餾水洗片2min；0.5％鹽酸酒精分化3s；自來(lái)水洗片2min；80％乙醇中15s；伊紅染色1min，不可超時(shí)；蒸餾水速洗；脫水。將切片依次放入80％、95％、100％乙醇中各15s，最后放入二甲苯中10min；將切片放置通風(fēng)櫥中干燥，滴加中性樹脂封片；倒置顯微鏡下觀察拍照，分析肝組織脂質(zhì)變性情況。利用ELISA試劑盒檢測(cè)(R&D，MTA00B)血清中TNF-α水平，按說(shuō)明書準(zhǔn)備所有實(shí)際和標(biāo)準(zhǔn)品；從96孔板上取下計(jì)劃使用的孔條；每孔分別加入50μLRD-63，50μL標(biāo)準(zhǔn)品、標(biāo)準(zhǔn)品或是樣品液，封上封條，室溫孵育2h；棄反應(yīng)物，清洗各孔4次，最后一次清洗完畢后將孔甩干；每孔加入100μLTNF-αConjugate，室溫孵育2h；重復(fù)第五步；每孔加入100μL底物反應(yīng)液，室溫避光孵育30min；每孔加入100μL終止液，混合物顏色慢慢由藍(lán)色變?yōu)辄S色；450nm處測(cè)定OD值；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品TNF-α含量。Trizol提取肝組織RNA，每50-100mg組織加入1mLTrizol，利用勻漿器研磨，4℃條件下12000g離心10min，取上清置于一新管中，靜置5min，加0.2mL氯仿，劇烈振動(dòng)15s，靜置2-3min，4℃條件下12000g離心15min，取上層樣品置于一新管中，加0.5mL異丙醇，靜置10min，4℃條件下12000g離心10min，棄上清，加入1mL75％乙醇，吹打，4℃條件下7500g離心5min，棄上清，自然風(fēng)干，RNAase-free水溶解備用。進(jìn)行熒光定量PCR，分析肝組織的炎性水平以及纖維化水平。引物序列如下：基因名稱Sense(5’-3’)Antisense(5’-3’)TGF-β1GCTAATGGTGGACCGCAACAACCACTGCTTCCCGAATGTCTGACCollagen-α1TGGTCTCCAGGGTCCTCCTAGAACCAGCAGAGCCAGGGTNF-αGGGTGATCGGTCCCCAAAGGTTGAGAAGATGATCTGAGTGTGAGG結(jié)果：FPD5處理對(duì)小鼠體重沒有顯著影響，但與基準(zhǔn)組相比，對(duì)照組血清中總膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白膽固醇水平上調(diào)；與對(duì)照組相比，F(xiàn)PD5高低劑量組血清中總膽固醇、甘油三酯以及低密度脂蛋白膽固醇三者水平均下調(diào)(見圖2)。與基準(zhǔn)組相比，對(duì)照組ESD活性顯著下調(diào)，肝臟脂質(zhì)變性加劇，炎性水平與纖維化程度加重；與對(duì)照組相比，F(xiàn)PD5高低劑量組均顯著上調(diào)ESD活性，肝臟的脂質(zhì)變性，炎性水平以及纖維化程度明顯減輕(見圖3)。實(shí)施例3FPD5對(duì)apoE-/-小鼠動(dòng)脈斑塊大小的影響取實(shí)施例2中分離的主動(dòng)脈根進(jìn)行冷凍包埋并切片備用，主動(dòng)脈縱剖，PBS沖洗后，置于10％的中性福爾馬林固定后備用?？v剖的主動(dòng)脈進(jìn)行油紅O染色，甲醛鈣固定切片10min；蒸餾水清洗三遍；將切片放入60％異丙醇中脫水1min；放入油紅O染液，60℃恒溫箱染色20-30min；將切片放入60％異丙醇中脫色1min；蒸餾水洗片1min；蘇木精染色30s；蒸餾水洗片1min；1％鹽酸酒精分化3s；自來(lái)水洗片2min；顯微鏡下觀察并拍照。使用ImagePro圖片分析軟件測(cè)量斑塊面積和血管壁面積，計(jì)算斑塊/血管壁面積比值。主動(dòng)脈根的冷凍切片進(jìn)行HE染色(方法如實(shí)施例2中所述)，使用ImagePro圖片分析軟件測(cè)量?jī)?nèi)膜面積、壞死核心面積，計(jì)算壞死核心面積/內(nèi)膜面積的比值；對(duì)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，總結(jié)出FPD5對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊大小的影響。結(jié)果：與基準(zhǔn)組相比，對(duì)照組斑塊顯著增大；與對(duì)照組相比，F(xiàn)PD5高低劑量組均顯著降低斑塊的大小。與基準(zhǔn)組相比，對(duì)照組主動(dòng)脈根處斑塊壞死核心面積顯著增大；與對(duì)照組相比，F(xiàn)PD5高低劑量組均顯著降低斑塊壞死核心的面積(見圖4)。實(shí)施例4FPD5對(duì)動(dòng)脈硬化斑塊組成成分的影響取實(shí)施例2中分離的主動(dòng)脈根的冷凍切片進(jìn)行油紅O染色(方法如實(shí)施例3中所述)，使用ImagePro圖片分析軟件測(cè)量油紅O著色的斑塊面積和血管壁面積，計(jì)算著色面積/血管壁的面積比值。主動(dòng)脈根的冷凍切片，利用試劑盒進(jìn)行Masson染色(Sigma，HT15)，用Bouin氏液室溫固定過(guò)夜，流水沖至無(wú)色，蘇木精染色1min，流水沖洗5min，BiebrichScarlet-AcidFucshin染5min，去離子水浸泡，WorkingPhosphotungstic/PhosphomolybdicAcidSolution染色5min，AnilineBlueSolution染色5min，1％乙酸浸泡2min，脫水，封片。倒置顯微鏡下觀察拍照，使用ImagePro圖片分析軟件測(cè)量斑塊中膠原的含量；主動(dòng)脈根的冷凍切片置于冷丙酮4℃固定10min，封閉液封閉1h,其次分別用平滑肌細(xì)胞標(biāo)志物(α-actin)、促炎性巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CD11c)、抗炎性巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CD206)、巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(CD68)的一抗4℃孵育過(guò)夜，PBST洗3次，每次5min,然后用相應(yīng)的熒光標(biāo)記二抗37℃孵育30min，PBST洗3次，每次5min,最后利用Leica激光共聚焦顯微鏡觀察，使用Leicaconfocalsoftware分析斑塊中平滑肌細(xì)胞和不同類型巨噬細(xì)胞的含量。結(jié)果：與基準(zhǔn)組相比，對(duì)照組斑塊中脂質(zhì)的含量顯著提高，膠原的含量顯著降低，斑塊趨于不穩(wěn)定；與對(duì)照組相比，F(xiàn)PD5高低劑量組均可顯著降低斑塊中脂質(zhì)的含量，提高膠原的含量以及抗炎性巨噬細(xì)胞的含量，F(xiàn)PD5高劑量組降低斑塊中促炎性巨噬細(xì)胞的含量，進(jìn)而提高斑塊的穩(wěn)定性。綜上，F(xiàn)PD5處理可以顯著改善斑塊的結(jié)構(gòu)(見圖5、6)。