Mdc1在抑制前列腺癌方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了MDC1在抑制前列腺癌方面的應(yīng)用，本發(fā)明通過體外功能實驗，發(fā)現(xiàn)MDC1能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的生長和遷移功能，并且在前列腺癌臨床樣本進(jìn)行了MDC1表達(dá)水平檢測，發(fā)現(xiàn)MDC1在惡性程度較高的臨床前列腺癌組織中表達(dá)減少。
【專利說明】MDC1在抑制前列腺癌方面的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物基因領(lǐng)域，具體涉及MDCl在抑制前列腺癌方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]雄激素受體(Androgen receptor,AR)是核受體蛋白家族成員之一,在男性性發(fā)育中發(fā)揮重要作用，并在前列腺細(xì)胞的生長、分化及惡性轉(zhuǎn)化信號網(wǎng)絡(luò)中處于中心環(huán)節(jié)并起關(guān)鍵作用。AR是核受體超家族成員之一，由四個結(jié)構(gòu)域組成:N端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)(NTD)、DNA結(jié)合區(qū)(DBD)、鉸鏈區(qū)和配體結(jié)合區(qū)(LBD)。它以配體依賴性方式，通過直接與靶基因的特定DNA位點結(jié)合，調(diào)節(jié)靶基因mRNA的表達(dá)，從而發(fā)揮其生物學(xué)功能。
[0003]前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，在美國及西方一些國家居癌癥引起的男性死亡率的第二位。我國的前列腺癌發(fā)病率雖然遠(yuǎn)低于歐美國家，但近年來有明顯的上升趨勢。在前列腺癌細(xì)胞中，常存在AR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控異常，并通過對其下游靶基因的調(diào)節(jié)，影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程。
[0004]AR是促進(jìn)前列腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因子，但是AR被雄激素激活后，也可以激活抑制細(xì)胞生長增殖及促進(jìn)細(xì)胞分化等抑癌靶基因的轉(zhuǎn)錄，從而對前列腺癌細(xì)胞起到抑制生長和促進(jìn)分化的作用。如雄激素刺激可通過AR調(diào)控細(xì)胞周期抑制因子p21等促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞的凋亡，AR也能通過介導(dǎo)Vinculin等細(xì)胞骨架蛋白的表達(dá)促進(jìn)前列腺上皮細(xì)胞分化并抑制細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力，抑制細(xì)胞生長增殖的NKX3.1及與分化相關(guān)的角蛋白KRT18等也是AR的靶基因。AR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控功能受一系列轉(zhuǎn)錄輔調(diào)節(jié)因子的嚴(yán)密調(diào)控，在雄激素刺激信號存在下，AR與輔調(diào)節(jié)因子復(fù)合物結(jié)合，共同完成基因轉(zhuǎn)錄功能。AR對前列腺癌促進(jìn)或抑制作用的功能轉(zhuǎn)換也取決于轉(zhuǎn)錄輔調(diào)節(jié)因子的調(diào)控作用。
[0005]輔調(diào)節(jié)因子以復(fù)合物形式調(diào)控AR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，這些復(fù)合物主要包括組蛋白修飾酶(如組蛋白乙?；?、組蛋白去乙酰化酶、組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、絲蘇氨酸蛋白激酶、組蛋白泛素化酶和去泛素化酶等)和染色質(zhì)重塑因子(如SNF2H/ISWI家族和SWI/SNF家族)。轉(zhuǎn)錄活化狀態(tài)常伴隨有高水平的H3K9/K14/K79Ac、H4K16Ac、H3S10ph和H3K4Met等組蛋白修飾；轉(zhuǎn)錄抑制狀態(tài)常伴有H3K9Met、H3K27Met和H4K20Met等組蛋白修飾。這些輔調(diào)節(jié)因子復(fù)合物的作用具有嚴(yán)格的時空特異性，通過修飾組蛋白或重塑染色質(zhì)，誘導(dǎo)染色質(zhì)和核小體構(gòu)象改變，從而使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)維持在活化狀態(tài)或者抑制狀態(tài)來嚴(yán)密調(diào)控AR介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。
[0006]迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種AR的輔調(diào)節(jié)因子在前列腺癌中表達(dá)或功能異常，從而影響前列腺癌的發(fā)生發(fā)展。一些AR的輔助激活因子，如LSD1、p68、RNF6、JARID1B、ARDl和FLH2，在前列腺癌中高表達(dá)，促進(jìn)腫瘤增殖;AR的輔助抑制因子，如H0XB13和DACH1，抑制前列腺癌的增殖。而有些AR的輔助抑制因子，如EZH2和betaArrestin2，可以通過抑制AR下游抑癌靶基因的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展;AR的輔助激活因子，如BRCA1、ART-27、ARA70、p44、EZH2及TBRLl等，能夠通過促進(jìn)AR下游抑癌靶基因的轉(zhuǎn)錄，抑制腫瘤的生長增殖及促進(jìn)分化。目前，參與調(diào)控AR功能的輔調(diào)節(jié)因子作為腫瘤治療中有潛能的藥物靶點越來越受到關(guān)注。因此，發(fā)現(xiàn)新的AR輔調(diào)節(jié)因子并研究它們的作用機(jī)制，尤其是表觀遺傳學(xué)機(jī)制，對于進(jìn)一步研究AR轉(zhuǎn)錄調(diào)控的調(diào)節(jié)機(jī)制以及深入了解前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，都具有重要的科學(xué)意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了 MDCl在抑制前列腺癌方面的應(yīng)用，即MDCl可以抑制前列腺癌細(xì)胞的生長和遷移，并在惡性程度較高的前列腺癌中表達(dá)降低，在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中起抑制作用。
[0008]本發(fā)明通過體外功能實驗，發(fā)現(xiàn)MDCl能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的生長和遷移功能，并且在前列腺癌臨床樣本進(jìn)行了 MDCl表達(dá)水平檢測，發(fā)現(xiàn)MDCl在惡性程度較高的臨床前列腺癌組織中表達(dá)減少。

【具體實施方式】
[0009]為了使本發(fā)明的目的及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合實施例對本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0010]實施例
[0011]S1、通過Realtime-PCR檢測MDCl對AR的靶基因轉(zhuǎn)錄的影響，結(jié)果顯示MDCl選擇性的調(diào)控AR的一部分靶基因。其中，對p21及Vinculin的影響較明顯。進(jìn)一步，利用western blotting實驗檢測了 MDCl對p21及Vinlculin蛋白表達(dá)的影響。
[0012]S2、利用針對MDCl的shRNA慢病毒載體感染AR陽性表達(dá)的前列腺癌細(xì)胞系CWR22Rvl，建立穩(wěn)定沉默MDCl的前列腺癌細(xì)胞系及對照細(xì)胞系。
[0013]S3、生長曲線和克隆形成實驗的結(jié)果表明沉默MDCl增強(qiáng)了細(xì)胞的生長增殖能力。
[0014]S4, Transwe 11小室實驗表明，沉默MDCl增強(qiáng)了前列腺癌細(xì)胞CWR22Rvl的遷移能力。
[0015]S5、通過檢測不同Gleason Score的前列腺癌組織及前列腺增生組織樣本切片中MDCl的表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)，MDCl在低度惡性的前列腺癌(Gleason Score2，3，4，5，6)中表達(dá)升高，在高度惡性的前列腺癌(Gleason Score7，8，9，10)中表達(dá)降低。
[0016]本發(fā)明通過果蠅生物模型(AR-PEV模型)，在體內(nèi)對AR介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄輔助調(diào)控因子進(jìn)行篩選。通過此模型從數(shù)百種帶有基因突變型的果蠅系統(tǒng)中以果蠅眼睛顏色的表型變化和綠色熒光蛋白GFP表達(dá)的強(qiáng)弱為指標(biāo)，篩選出了 mu2能夠作為AR轉(zhuǎn)錄活性的新輔調(diào)節(jié)因子，激活A(yù)R介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)錄。mu2蛋白含有1350個氨基酸(AA)，擁有N末端的HLH(helix-loop-helix domain)結(jié)構(gòu)域，C 末端的 BRCT (BRCAlcarboxy-terminal motif)結(jié)構(gòu)域及位于中間的核定位信號(Nuclear localizat1n signal,NLS)。其中，HLH結(jié)構(gòu)域參與與DNA結(jié)合過程，BRCT是參與組蛋白修飾及調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄的重要結(jié)構(gòu)域。BRCT域是在乳腺癌抑制因子BRCAl中被發(fā)現(xiàn)的，后來又在抑癌因子p53結(jié)合蛋白53BP1、酵母細(xì)胞周期檢測修補(bǔ)蛋白RAD9和DNA修復(fù)蛋白中被發(fā)現(xiàn)。研究表明BRCT域在BRCAl蛋白抑制乳腺癌細(xì)胞生長中是必需因素，并且BRCT域在BRCAl的轉(zhuǎn)錄調(diào)控中具有顯著作用。此外，有報道在BRCAl中，BRCT域是BRCAl與GCN5/TRRAP組蛋白乙?；笍?fù)合物相結(jié)合的重要區(qū)域。另一個參與DNA修復(fù)并含有BRCT域的蛋白PTIP，能與Setl-1ike組蛋白甲基化酶復(fù)合物相結(jié)合，并特異的在組蛋白H3K4位點甲基化。mu2的人同源蛋白MDCl含有2089個AA，除擁有在C端的BRCT結(jié)構(gòu)域外，在N末端還含有參與蛋白-蛋白結(jié)合的重要結(jié)構(gòu)域FHA (forkheadassociated)結(jié)構(gòu)域。大量的研究表明，MDCl是哺乳動物細(xì)胞中DNA損傷修復(fù)(DNA DamageRepair, DDR)的重要因子，它通過其BRCT結(jié)構(gòu)域識別磷酸化的H2AX，從而定位在DNA損傷位點，并招募多個修復(fù)因子參與修復(fù)過程。在DDR過程中，組蛋白乙?；窶OF復(fù)合物及主要由其介導(dǎo)的活化性組蛋白標(biāo)志H4K16AC能夠招募MDCl在DNA損傷位點的定位[28]。同時，MDCl也參與S期檢測點和G2/M期檢測點的調(diào)控。而且，MDCl在乳腺癌和肺癌標(biāo)本中的表達(dá)缺失對腫瘤有促進(jìn)作用；在10(:1基因缺失的小鼠體內(nèi)自發(fā)性腫瘤的發(fā)生率顯著提高，提示MDCl具有抑癌作用。本發(fā)明通過體外功能實驗，發(fā)現(xiàn)MDCl能夠抑制前列腺癌細(xì)胞的生長和遷移功能，并且在前列腺癌臨床樣本進(jìn)行了 MDCl表達(dá)水平檢測，發(fā)現(xiàn)MDCl在惡性程度較高的臨床前列腺癌組織中表達(dá)減少
[0017]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本【技術(shù)領(lǐng)域】的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以作出若干改進(jìn)和潤飾，這些改進(jìn)和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明。
【權(quán)利要求】
1.MDCl在抑制前列腺癌方面的應(yīng)用。
2.如權(quán)利要求1所述的MDCl在在抑制前列腺癌方面的應(yīng)用，其特征在于，所述MDCl前列腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中起到抑癌作用。
【文檔編號】A61K38/17GK104288752SQ201410509623
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】趙越, 王春玉, 林琳, 孫洪邈, 王勝利, 鄒仁龍, 佟昌慈, 周婷婷, 吳怡, 羅昊, 高鵬 申請人:中國醫(yī)科大學(xué)