輻抗肽蛋白的新用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了輻抗肽蛋白的新用途。本發(fā)明提供了輻抗肽蛋白在制備抑制肝損傷疾病產(chǎn)品中的應用；所述輻抗肽蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明輻抗肽蛋白抑制肝損傷，可以用來制備抑制肝損傷藥物。
【專利說明】輻抗肽蛋白的新用途

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，尤其涉及輻抗肽蛋白的新用途。

【背景技術】
[0002] Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR)是 Lemaitre 等人在 1996 年研究果妮過 程中發(fā)現(xiàn)，目前研究表明，在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了 11個TLRs家族成員，主要表達于免疫細胞等。 Toll-like receptors (TLRs)家族是一類在機體固有免疫和獲得性免疫應答中發(fā)揮重要作 用的模式識別受體，它們通過特異性識別細菌、病毒等病原體相關分子模式活化NF- κ B信 號通路介導炎癥反應、抗病毒反應和免疫效應細胞的分化成熟，并以此抵御病原微生物的 入侵。
[0003] 研究顯示，多種TLR受體在肝臟細胞中表達，并參與肝臟損傷保護過程，其中如 TLR3激活對酒精性肝損傷具有抑制作用；TLR4抑制對包括酒精性肝損傷在內(nèi)的多種肝損 傷具有抑制作用。目前已經(jīng)有多種TLR的配體被用來研發(fā)肝損傷保護藥物，如TLR4拮抗劑、 TLR7和TLR9激動劑等在包括丙型肝炎等肝臟疾病治療藥物。
[0004] TLR5作為TLRs家族中一員，其唯一配體為細菌的鞭毛蛋白。近期研究表明，細菌 鞭毛蛋白或者其保留TLR5結(jié)合活性的衍生物（如輻抗肽）對γ射線照射后導致的輻射損 傷具有保護作用，其抗輻射作用機制是通過結(jié)合細胞表面TLR5,激活細胞內(nèi)的NF-kB信號 通路，抑制輻射照射引起的細胞凋亡，進而達到降低輻射損傷的效果。作為TLR5唯一的配 體，鞭毛蛋白或其衍生物輻抗肽蛋白在肝損傷保護中的作用目前尚無人報道。
[0005] 刀豆蛋白A(Con A)誘發(fā)的小鼠急性肝損傷是T淋巴細胞介導的肝損害模型之一， 很好地模擬了人類病毒性肝炎、自身免疫性肝病等疾病。
[0006] 輻抗肽蛋白來源于沙門氏菌鞭毛蛋白，編碼296個氨基酸，分子量約為31KD。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的一個目的是提供輻抗肽蛋白新用途。
[0008] 本發(fā)明提供的輻抗肽蛋白在制備治療和/或抑制肝損傷疾病產(chǎn)品中的應用；
[0009] 所述輻抗肽蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0010] 上述應用中，所述抑制肝損傷疾病通過1)-5)中至少一種體現(xiàn)：
[0011] 1)降低肝損傷動物的死亡率；
[0012] 2)抑制肝損傷動物肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和/或谷草轉(zhuǎn)氨酶AST表達量；
[0013] 3)減輕肝損傷動物肝臟組織損傷；
[0014] 4)抑制肝損傷動物肝實質(zhì)細胞凋亡；上述抑制肝損傷動物肝實質(zhì)細胞凋亡具體 體現(xiàn)在降低Casepase3、8、9活性；
[0015] 5)抑制肝實質(zhì)細胞中的粒細胞浸潤；上述抑制肝實質(zhì)細胞中的粒細胞浸潤具體 體現(xiàn)在降低單核細胞、中性粒細胞的數(shù)量。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的是提供輻抗肽蛋白另一個用途。
[0017] 本發(fā)明提供的輻抗肽蛋白在制備具有如下1)-5)中至少一種功能產(chǎn)品中的應用：
[0018] 1)降低肝損傷動物的死亡率；
[0019] 2)抑制肝損傷動物肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和/或谷草轉(zhuǎn)氨酶AST表達量；
[0020] 3)減輕肝損傷動物肝臟組織損傷；
[0021] 4)抑制肝損傷動物肝實質(zhì)細胞凋亡；
[0022] 5)抑制肝實質(zhì)細胞中的粒細胞浸潤；
[0023] 所述輻抗肽蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
[0024] 上述應用中，所述肝損傷疾病為由刀豆蛋白A誘導產(chǎn)生的肝損傷疾病。
[0025] 上述應用中，所述動物為人或鼠。
[0026] 上述應用中，所述動物為小鼠。
[0027] 上述應用中，所述產(chǎn)品為藥物。
[0028] 本發(fā)明第三個目的是提供一種具有如下1)_6)中至少一種功能產(chǎn)品。
[0029] 本發(fā)明提供的產(chǎn)品，其活性成分為輻抗肽蛋白；
[0030] 所述輻抗肽蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2 ;
[0031] 1)降低肝損傷動物的死亡率；
[0032] 2)抑制肝損傷動物肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和/或谷草轉(zhuǎn)氨酶AST表達量；
[0033] 3)減輕肝損傷動物肝臟組織損傷；
[0034] 4)抑制肝損傷動物肝實質(zhì)細胞凋亡；
[0035] 5)抑制肝實質(zhì)細胞中的粒細胞浸潤；
[0036] 6)治療和/或抑制肝損傷疾病。
[0037] 上述產(chǎn)品中，所述動物為人或鼠；所述鼠具體為小鼠；所述肝損傷疾病為由刀豆 蛋白A誘導產(chǎn)生的肝損傷疾病，并不限于ConA誘導產(chǎn)生的肝損傷。
[0038] 上述產(chǎn)品為藥物。
[0039] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)輻抗肽蛋白可以明顯抑制人類病毒性肝炎、自身 免疫性肝病血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和谷草轉(zhuǎn)氨酶AST的水平，明顯減輕肝組織的損傷程度， 明顯抑制ConA引起的肝實質(zhì)細胞的細胞凋亡水平，可以明顯抑制肝實質(zhì)的粒細胞浸潤。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0040] 圖1為輻抗肽蛋白誘導表達產(chǎn)物SDS-PAGE鑒定
[0041] 圖2為輻抗肽預防給藥降低ConA致小鼠死亡率
[0042] 圖3為輻抗肽給藥后小鼠肝臟ALT和AST的變化
[0043] 圖4為輻抗肽不同劑量給藥對ConA致肝損傷后ALT和AST的影響
[0044] 圖5為?？闺牟煌瑫r間給藥對ConA致肝損傷后ALT和AST的影響
[0045] 圖6為輻抗肽給藥后ConA引起的肝組織損傷影響
[0046] 圖7為輻抗肽給藥對ConA引起的AST/ALT動態(tài)變化
[0047] 圖8為輻抗肽對ConA導致的肝實質(zhì)細胞凋亡的影響
[0048] 圖9為輻抗肽抑制肝實質(zhì)細胞中的粒細胞浸潤

【具體實施方式】
[0049] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0050] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0051] 實施例1、輻抗肽蛋白（FKT)的制備
[0052] 人工合成輻抗肽蛋白（FKT)編碼基因序列1，其編碼的蛋白輻抗肽（FKT)的氨基酸 序列為序列表中序列2。
[0053] 將序列1所示的FKT編碼基因插入pBV220原核表達載體的Small和Sail位點間 得到重組載體，命名為PBV220-FKT。
[0054] 將輻抗肽表達質(zhì)粒PBV220-FKT轉(zhuǎn)化到BL21大腸桿菌中建立表達工程菌，在30°C 條件下培養(yǎng)至菌體密度OD6tltl = 0. 6左右，升高溫度到42°C誘導輻抗肽基因的表達，誘導表 達4小時后，離心收集菌體，經(jīng)超聲破碎，高速離心保留沉淀部分即為粗制包涵體。
[0055] 用各種不同的緩沖液充分洗滌粗制包涵體后，將包涵體在含4M尿素的 20mMTris-HCl(pH 6.8)于4°C攪拌過夜，然后離心回收上清并用20mM Tris-HCl(pH6.8) 稀釋至尿素終濃度為2M。隨后將該溶液上樣于用2M尿素20mM Tris-HCl(pH6.8)平衡 后的DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換層析柱，上樣完畢后，分別用2M尿素20mM Tris-HCl (pH6. 8)和 20mM Tris-HCl (pH6. 8)平衡至基線平穩(wěn)。以 0 ?20% IM NaCl (20mM Tris-HCl，pH6. 8)梯度洗脫60min，流速10ml/min，收集低鹽洗脫組分。隨后，將初純化 所得目標峰洗脫液用注射用水稀釋5倍（用IM Tris-HCI pH6. 8調(diào)節(jié)其電導與平衡液相 同）后上樣于另一個用 20mM Tris-HCl (ρΗ6· 8)平衡的 DEAE-Sepharose Fast Flow 層析 柱，上樣結(jié)束后用20mM Tris-HCl(pH6. 8)平衡至基線平穩(wěn)，以0?10% IM NaCl/20mM Tris-HCl(pH6. 8)洗脫30min，流速為5ml/min,收集各洗脫峰，目的蛋白主要出現(xiàn)在低鹽洗 脫組分，即為純化產(chǎn)物FKT。
[0056] 以SDS-PAGE電泳鑒定純化產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示，M為分子量標準、1為輻抗肽陽 性對照（序列2)、2為純化產(chǎn)物輻抗肽蛋白FKT，可以看出，純化產(chǎn)物分子量為31KD，與預期 大小一致。
[0057] 實施例2、輻抗肽在抑制肝損傷中的應用
[0058] 1、輻抗肽降低Con A導致的肝損傷小鼠死亡率
[0059] 急性肝損傷小鼠模型建立：8周齡C57BL/6雄性小鼠（體質(zhì)量18?22g)，屏障環(huán) 境下飼養(yǎng)，光照交替時間為12小時；采用刀豆蛋白A(以下簡稱Con A，C7275, Sigma公司） 誘導急性肝損傷模型，該模型中Con A致死劑量為25mg/kg體重，將Con A用無菌注射用濃 度為0. 9 %的NaCl水溶液（生理鹽水）稀釋至25mg/kg得到Con A溶液，經(jīng)小鼠尾靜脈快 速推注，注射體積為200 μ 1。
[0060] 具體實驗如下：
[0061] 將C57BL/6雄性小鼠分為兩組，每組12只小鼠：
[0062] 實驗組（注射輻抗肽蛋白）：在小鼠建模注射Con A前24小時、12小時、6小時以 及注射后0. 5小時，分別經(jīng)小鼠腹腔注射由實施例1制備的純化產(chǎn)物輻抗肽蛋白FKT，輻抗 肽蛋白給藥劑量為0. 2mg/kg體重，給藥體積為200 μ 1 (溶劑為生理鹽水）；再注射200 μ 1 濃度為25mg/kg的Con A溶液。
[0063] 對照組（注射生理鹽水溶液）：在小鼠注射Con A前24小時、12小時、6小時以及 注射后0. 5小時，分別經(jīng)小鼠腹腔注射生理鹽水，體積為200 μ 1 ;再注射200 μ 1濃度為 25mg/kg 的 Con A 溶液。
[0064] Con A溶液注射后不同時統(tǒng)計各組小鼠的死亡數(shù)目，注射后120小時停止統(tǒng)計。 GraphPad Prism5.0軟件繪制小鼠生存曲線，Long-Rank Test法進行實驗組和對照組間的 差異分析。
[0065] 結(jié)果如圖2所示，可以看出，在ConA給藥前24h?給藥后0. 5h內(nèi)注射輻抗肽蛋 白，小鼠的存活率由對照組的20?30%提商到80?100%，說明?？鼓w蛋白可以有效提商 ConA注射小鼠的存活率。
[0066] 2、輻抗肽抑制肝損傷小鼠肝臟谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和谷草轉(zhuǎn)氨酶AST表達量
[0067] 由實施例1制備的純化產(chǎn)物輻抗肽蛋白FKT于造模前12小時給藥，給藥方式為腹 腔注射，給藥劑量為〇. 2mg/kg，給藥體積為200 μ 1。給藥后12小時采血檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶 (ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)，具體如下：
[0068] 實驗組，分為3個小組：
[0069] 1)輻抗肽于造模前12小時給藥，給藥方式為腹腔注射，給藥劑量為0. 2mg/kg，給 藥體積為200 μ 1，溶劑為生理鹽水；然后在給藥Con A，溶劑為生理鹽水，給藥劑量為15mg/ kg，尾靜脈注射給藥，給藥體積為200 μ 1。
[0070] 2)輻抗肽分別于造模前12小時給藥，給藥方式為腹腔注射，給藥劑量為0. 05、 0. 1、0. 2mg/kg，給藥體積為200 μ 1，溶劑為生理鹽水；然后在給藥Con Α，溶劑為生理鹽水， 給藥劑量為15mg/kg，尾靜脈注射給藥，給藥體積為200 μ 1。
[0071] 3)輻抗肽分別于造模前24、12、1小時給藥，給藥方式為腹腔注射，給藥劑量為 0. 2mg/kg，給藥體積為200μ 1，溶劑為生理鹽水；然后在給藥Con Α，給藥劑量為15mg/kg， 溶劑為生理鹽水，尾靜脈注射給藥，給藥體積為200 μ 1。
[0072] 對照組：給予等體積的生理鹽水；然后在給藥Con Α，給藥劑量為15mg/kg，尾靜脈 注射給藥，給藥體積為200 μ 1。
[0073] 給藥后12小時采血，應用血生化分析儀檢測谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶 (AST)。
[0074] 實驗組1)結(jié)果如圖3所示，可以看出，小鼠注射輻抗肽后，ALT和AST的水平下降 至對照組水平，說明輻抗肽具有降低ConA引起的ALT和AST的能力。
[0075] 實驗組2)結(jié)果如圖4所示，可以看出，小鼠注射不同劑量（0.25?4ug/只）的輻 抗肽蛋白對ConA引起的ALT和AST均具有降低能力，說明當（至少）輻抗肽蛋白劑量大于 0· 25ug/只時，具有降低ALT和AST的能力；
[0076] 實驗組3)結(jié)果如圖5所示，可以看出，在小鼠注射ConA前24?1小時時間范圍 內(nèi)注射輻抗肽均可以降低ALT和AST水平。
[0077] 輻抗肽抑制肝損傷小鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT)和谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST)表達。
[0078] 3、輻抗肽減輕ConA導致的肝臟組織損傷
[0079] 實驗組（FKT):輻抗肽于造模前12小時給藥，給藥方式為腹腔注射，給藥劑量為 0. 2mg/kg，給藥體積為200μ 1，溶劑為生理鹽水；然后在給藥Con A，給藥劑量為15mg/kg， 尾靜脈注射給藥，給藥體積為200 μ 1。
[0080] 對照組（saline/生理鹽水）：給予等體積的生理鹽水；然后在給藥Con Α，給藥劑 量為15mg/kg，尾靜脈注射給藥，給藥體積為200μ 1。
[0081] 給藥后第0、3、6、12和24小時留取小鼠肝組織，每個實驗組6只小鼠。10%多聚 甲醛固定，石蠟包埋切片，伊紅-蘇木素染色，鏡下觀察肝臟組織病理學變化。結(jié)果如圖6 所示，可以看出，注射輻抗肽組小鼠肝臟組織損傷程度、肝臟壞死區(qū)域面積以及單核細胞數(shù) 量均明顯小于生理鹽水對照組小鼠的肝臟組織損傷程度、肝臟壞死區(qū)域面積和單核細胞數(shù) 量。說明注射輻抗肽可以明顯減輕ConA導致的肝臟組織損傷。
[0082] 4、輻抗肽給藥后對ConA引起的AST和ALT的動態(tài)變化
[0083] 上述3獲得的實驗組和對照組給藥后第0、3、6、12、24和48小時眼球取血。室溫放 置1小時，3000轉(zhuǎn)/分鐘，離心20分鐘，小心吸取上清，-80°C保存?zhèn)溆?。測定時，用無菌生 理鹽水稀釋一定倍數(shù)后測定。結(jié)果如圖7所示，對照組小鼠的ALT和AST水平在注射ConA 后6h開始升高，12h達到最高值后開始下降，到48h時仍沒有恢復到正常水平；而注射輻抗 肽組小鼠的ALT和AST水平在注射ConA后直至48h均未見明顯升高。
[0084] 5、輻抗肽對ConA導致的肝實質(zhì)細胞凋亡的影響
[0085] 上述3獲得的實驗組和對照組給藥后12小時，取小鼠肝組織，RIPA裂解肝組織， BCA法測定蛋白濃度。將各組樣本蛋白濃度稀釋至相同濃度，檢測CasepaSe3、8、9活性測 定，按照試劑盒說明書操作每個實驗組3只小鼠，結(jié)果如圖8所示，未注射輻抗肽的實驗組 小鼠的Cas印ase3、8、9活性與對照組小鼠相比均明顯升高，注射輻抗肽后的實驗組小鼠的 CasepaSe3、8、9活性與未注射輻抗肽實驗組小鼠相比均明顯下降，說明輻抗肽可以明顯抑 制ConA引起的肝實質(zhì)細胞的細胞凋亡水平。
[0086] 6、?？闺囊种聘螌嵸|(zhì)的粒細胞浸潤
[0087] 上述3獲得的實驗組和對照組給藥后12小時，分離肝臟單個核細胞。
[0088] 1)取出小鼠肝臟，于冰預冷的PBS中漂洗；
[0089] 2)將肝臟轉(zhuǎn)移至200目篩網(wǎng)中，用2. Oml注射器橡膠推柄輕輕研磨，加入少量2% FBS RPMI1640洗滌細胞，最后將細胞懸液稀釋至40ml ;
[0090] 3)50g，4°C離心5分鐘，留取上清，棄沉淀；
[0091] 4)將3)中所得上清液于800g，4°C離心10分鐘，棄上清；
[0092] 5)將 4)中沉淀用 4ml40% Percol 重懸；
[0093] 6)取5ml70% Percol于15ml離心管中，傾斜離心管，將5中細胞懸液輕輕注入；
[0094] 7)將離心機轉(zhuǎn)速升降速率設定為最小值，800g，4°C離心20分鐘；
[0095] 8)離心結(jié)束后，用毛細管小心吸取中間層淋巴細胞；
[0096] 9)將8)中淋巴細胞轉(zhuǎn)移至另外一只新的15ml離心管中，補加2% FBS RPMI1640 培養(yǎng)基至15ml，于800g，4°C離心10分鐘；
[0097] 10)棄上清，用吸水紙吸干殘留水分后，每支離心管中加入300 μ I BD紅細胞裂解 液，室溫處理3分鐘后，加入2% FBS RPMI1640至Iml ;
[0098] 11)將10)中細胞懸液轉(zhuǎn)移至I. 5ml Ep管中，2000轉(zhuǎn)/分鐘，室溫離心5分鐘；
[0099] 12)用200 μ 12% FBS RPMI1640重懸細胞，計數(shù)后將其稀釋至合適濃度；
[0100] 標記相應的流式抗體，洗滌，1%多聚甲醛固定后上機檢測。
[0101] 結(jié)果如圖9所示，注射輻抗肽組小鼠的單核細胞、中性粒細胞的數(shù)量明顯低于生 理鹽水對照組小鼠的相應細胞數(shù)量，說明注射輻抗肽可以明顯抑制肝實質(zhì)的粒細胞浸潤。
【權(quán)利要求】
1. ?？鼓w蛋白在制備治療和/或抑制肝損傷疾病廣品中的應用； 所述輻抗肽蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應用，其特征在于： 所述抑制肝損傷疾病通過1)-5)中至少一種體現(xiàn)： 1) 降低肝損傷動物的死亡率； 2) 抑制肝損傷動物肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和/或谷草轉(zhuǎn)氨酶AST表達量； 3) 減輕肝損傷動物肝臟組織損傷； 4) 抑制肝損傷動物肝實質(zhì)細胞凋亡；體現(xiàn)在降低Cas印ase3、8、9活性； 5) 抑制肝實質(zhì)細胞中的粒細胞浸潤。體現(xiàn)在降低單核細胞、中性粒細胞的數(shù)量；所述 動物為小鼠。
3. 輻抗肽蛋白在制備具有如下1)_5)中至少一種功能產(chǎn)品中的應用： 1) 降低肝損傷動物的死亡率； 2) 抑制肝損傷動物肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和/或谷草轉(zhuǎn)氨酶AST表達量； 3) 減輕肝損傷動物肝臟組織損傷； 4) 抑制肝損傷動物肝實質(zhì)細胞凋亡； 5) 抑制肝實質(zhì)細胞中的粒細胞浸潤； 所述輻抗肽蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的應用，其特征在于： 所述肝損傷疾病為由刀豆蛋白A誘導產(chǎn)生的肝損傷疾病。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2-4中任一所述的應用，其特征在于：所述動物為人或鼠。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于：所述動物為小鼠。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的應用，其特征在于：所述產(chǎn)品為藥物。
8. -種具有如下1)_6)中至少一種功能產(chǎn)品，其活性成分為輻抗肽蛋白； 所述輻抗肽蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2 ; 1) 降低肝損傷動物的死亡率； 2) 抑制肝損傷動物肝臟中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT和/或谷草轉(zhuǎn)氨酶AST表達量； 3) 減輕肝損傷動物肝臟組織損傷； 4) 抑制肝損傷動物肝實質(zhì)細胞凋亡； 5) 抑制肝實質(zhì)細胞中的粒細胞浸潤； 6) 治療和/或抑制肝損傷疾病。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述動物為人或鼠；所述鼠具體為小鼠； 所述肝損傷疾病為由刀豆蛋白A誘導產(chǎn)生的肝損傷疾病。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的產(chǎn)品，其特征在于：所述產(chǎn)品為藥物。
【文檔編號】A61K38/16GK104258375SQ201410478078
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月18日
【發(fā)明者】楊曉明, 葛常輝, 詹逸群, 王磊 申請人:中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院放射與輻射醫(yī)學研究所