美洲大蠊提取在制備抗aqp3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了美洲大蠊提取物在制備抗AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。本發(fā)明還公開了美洲大蠊提取物在制備治療皮膚損傷或抗皮膚老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。本發(fā)明美洲大蠊提取物可以用于修復(fù)皮膚的輻射損傷，具有抗老化的作用，質(zhì)量安全，具有較好的應(yīng)用前景。
【專利說明】美洲大蠊提取在制備抗AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及美洲大蠊提取物在制備抗AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。

【背景技術(shù)】
[0002]美洲大蠊(Periplaneta americana)為昆蟲綱有翅亞綱蜚蠊目蜚蠊科大蠊屬昆蟲，俗稱“蟑螂”，其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，其中把它列為中品，謂“味:咸、寒；治:血瘀證堅(jiān)寒熱、破積聚、喉咽閉、內(nèi)寒無子”。近些年來隨著我國對傳統(tǒng)中醫(yī)藥資源研究開發(fā)的重視，有些學(xué)者其進(jìn)一步研究并取得了可喜的成就，以美洲大蠊醇提物純化制成的產(chǎn)品“康復(fù)新液”，在燒傷、燙傷等外傷創(chuàng)面的治療上取得的良好療效。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明提供了美洲大蠊提取物的新用途。
[0004]本發(fā)明提供了美洲大蠊提取物在制備抗AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。
[0005]AQP3，即Aquaporin 3，表達(dá)于正常皮膚的基底細(xì)胞的細(xì)胞膜，是水和甘油的轉(zhuǎn)運(yùn)通道。
[0006]其中，所述抗AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品為抗皮膚AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品。其中，所述抗皮膚AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品為抗UVB照射后引起的皮膚AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。
[0007]其中，所述藥物、護(hù)膚品、或日化用品為治療皮膚損傷或抗皮膚老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品。其中，所述治療皮膚損傷的藥物、護(hù)膚品或日化用品為治療輻射引起的皮膚損傷的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。其中，所述抗皮膚老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品為抗皮膚光老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。
[0008]本發(fā)明還提供了美洲大蠊提取物在制備治療皮膚損傷或抗皮膚老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。
[0009]其中，所述治療皮膚損傷的藥物、護(hù)膚品或日化用品為治療輻射引起的皮膚損傷的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。其中，所述抗皮膚老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品為抗皮膚光老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。
[0010]本發(fā)明還提供了一種抗AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品，它是以美洲大蠊提取物為活性成分，加上藥物、護(hù)膚品或日化用品中可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。
[0011]本發(fā)明還提供了一種治療皮膚損傷或抗皮膚老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品，它是以美洲大蠊提取物為活性成分，加上藥物、護(hù)膚品或日化用品中可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。
[0012]本發(fā)明美洲大蠊提取物可以上調(diào)UVB照射后引起的皮膚的AQP3下降，修復(fù)皮膚損傷，起到抗光老化的作用，應(yīng)用前景良好。
[0013]本發(fā)明美洲大蠊提取物可以通過購買市售產(chǎn)品獲得(如康復(fù)新)，也可通過現(xiàn)有方法制備得到，如專利申請?zhí)?01310030233.1,201010182489.0,03117804.9、200610021993.6等，但不限于上述提取方法，此處不再贅述。該提取物均符合WS3 — B —3674 - 98 (衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十九冊)中關(guān)于“康復(fù)新”的要求。
[0014]本發(fā)明采用醇提水沉法制備美洲大蠊提取物，具體操作如下:
[0015]A、粉碎:將干燥的美洲大蠊蟲體粉碎，過24目篩，制得美洲大蠊粗粉；
[0016]B、浸泡:將步驟A所得美洲大蠊粗粉用濃度50%?95%的乙醇浸泡，使乙醇液面高出粗粉液面5?1cm密閉保存，制得粗粉混合液；
[0017]C、提取:將步驟B所得粗粉混合液在70?85°C的溫度下進(jìn)行3?5次回流提取，對粗粉混合液進(jìn)行第一次提取時，加粗粉重量5?8倍量濃度90%?95%的乙醇，提取時間為4?6小時；第二次以后每次提取加粗粉重量3?6倍量濃度90%?95%的乙醇，提取時間為3?5小時；合并提取液，過濾得乙醇提取液；
[0018]D、一級濃縮:將步驟C所得乙醇提取液在真空度-0.05?-0.06MPa、溫度50?60°C的條件下減壓濃縮，至比重為1.05?1.15時，得乙醇濃縮液；
[0019]:將步驟D所得乙醇濃縮液加入乙醇濃縮液重量5?7倍量的水，攪拌，然后保溫靜置I?9小時使油水分層；
[0020]F、二級濃縮:將步驟E所得下層水液放出，經(jīng)濾紙過濾后，濾液減壓濃縮，最后干燥的成品。經(jīng)檢測，本品按干燥品計(jì)算，總氨基酸含量在7.0 %以上，且性狀鑒別均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。
[0021]本發(fā)明采用水提醇沉法制備美洲大蠊提取物，具體操作如下:
[0022]取美洲大蠊藥材，加水煮沸提取三次，減壓濃縮至相對密度為1.1，冷藏，去除上層油脂；下層液加乙醇至含醇量達(dá)80% v/v，靜置，過濾、濾液濃縮至無醇味，即得。經(jīng)檢測，本品按干燥品計(jì)算，總氨基酸含量在7.0%以上，且性狀鑒別均符合標(biāo)準(zhǔn)要求。
[0023]說明書附圖
[0024]圖1UVB照射后用美洲大蠊提取物處理6h、12h后的HaCaT細(xì)胞樣品RT-PCR反應(yīng)的溶解曲線；
[0025]圖2UVB照射后用康復(fù)新液處理24h后的HaCaT細(xì)胞樣品RT-PCR反應(yīng)的溶解曲線.-^4 ，
[0026]圖3UVB照射后6h，不同組別HaCaT細(xì)胞的AQP3mRNA表達(dá)水平變化。
[0027]實(shí)施例1康復(fù)新液對UVB照射的人角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCaT)的損傷修復(fù)作用
[0028]一、材料
[0029]1、細(xì)胞株
[0030]人角質(zhì)形成細(xì)胞株(HaCaT)由德國柏林自由大學(xué)本杰明.富蘭克林醫(yī)學(xué)中心惠贈。
[0031]2、主要試劑
[0032]康復(fù)新為美洲大蠊乙醇提取物
[0033]細(xì)胞培養(yǎng)液和胎牛血清購自Hyclone公司。二甲基亞砜(DMSO)、四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自Sigma公司?？俁NA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、RealMasterMix新型熒光定量PCR試劑盒購自北京天根生化科技有限公司。引物由北京賽百盛公司合成。
[0034]3、引物序列
[0035]GAPDH,擴(kuò)增產(chǎn)物 313bp。
[0036]上游引物，5，-TCCTGTGGCATCCACGAAACT-3，；
[0037]下游引物，5’-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3’。
[0038]AQP3，擴(kuò)增產(chǎn)物 133bp。
[0039]上游引物，5，-GCTGTCACTCTGGGCATCCTC-3，；
[0040]下游引物，5’-GCGTCTGTGCCAGGGTGTAG-3’。
[0041]4、主要儀器設(shè)備
[0042]細(xì)胞培養(yǎng)超凈臺(蛘埠凈化設(shè)備廠)、C02培養(yǎng)箱(Queue SystemsTM 2711美國)、倒置相差顯微鏡(OLYMPUS, I X 70日本)、全能型高性能臺式冷凍離心機(jī)(Heaeus，B1fugeStratos德國)、深低溫冰箱(SANYO, Altra Low日本)、蒸汽高壓消毒箱(Tuttnauer, 2540MK美國)、550型酶標(biāo)儀(B1-Rad Laboratories Inc, Hercules加拿大)、實(shí)時定量突光PCR儀(Rotor-gene 3000,澳大利亞)、Waldmann UVB 治療儀(Waldmann, UV801KL 德國)。
[0043]二、實(shí)驗(yàn)方法
[0044]1、細(xì)胞培養(yǎng)
[0045]HaCaT細(xì)胞生長于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液中，置于5% C02、37°C孵箱中傳代培養(yǎng)。
[0046]2、MTT法檢測康復(fù)新對HaCaT細(xì)胞的增殖抑制作用
[0047]將濃度為4X 1Vcm3HaCaT細(xì)胞接種在96孔板上，于對數(shù)生長期向細(xì)胞中加入不同濃度康復(fù)新 αΧ1(Γ6、1Χ1(Γ5、5Χ1(Γ4、1Χ1(Γ3、1Χ1(Γ2?νυ 的 DMEM 180μ1，每組各設(shè) 6個對照復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)24h后，加入MTT 20μ 1，37°C孵育4h，棄上清液，每孔加入10y IDMS0，震蕩lOmin，酶標(biāo)儀測490nm吸光度A值。細(xì)胞存活率=(加藥組A值/對照組A值)X100%。
[0048]3、UVB 照射
[0049]光源:Waldmann(UV801KL, Germany) UVB 波長 285_350nm，峰值 310_315nm.
[0050]光源至細(xì)胞的照射距離:15cm。
[0051]照射過程:待HaCaT細(xì)胞生長至約80%融合，棄培養(yǎng)基，PBS沖洗，加入300 μ IPBS,形成細(xì)胞層上方保護(hù)液面，后UVB照射。
[0052]4、實(shí)驗(yàn)分組
[0053](I)陰性對照組
[0054]不照射、不加康復(fù)新。
[0055](2)陽性組
[0056]UVB 20mJ/cm2，光源距離細(xì)胞表面15cm，照射后加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)
6、12、24h，收集培養(yǎng)細(xì)胞。
[0057](3)實(shí)驗(yàn)組:
[0058]如上陽性組，每組加入康復(fù)新濃度為10_2L/L，同上培養(yǎng)6、12、24h后收集細(xì)胞。
[0059]收集的細(xì)胞保存于_80°C深低溫冰箱或直接進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。
[0060]5、實(shí)時熒光定量RT-PCR檢測AQP3mRNA表達(dá)[0061 ] 5.1總RNA提取試劑盒提取細(xì)胞總RNA
[0062](I)收集HaCaT細(xì)胞，向每管約5 X 16個細(xì)胞中加入0.5ml Trizol總RNA提取試齊U，輕輕吹打，將均漿樣本放于室溫5min，使核酸蛋白復(fù)合物完全分解。
[0063](2)加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15s，室溫放置lOmin。
[0064](3) 4°C, 12, OOOrpm 離心 15min。
[0065](4)小心將上層無色水相移至新的Eppendorf管中。
[0066](5)緩慢加入I倍體積70 %乙醇，混勻，得到的溶液和沉淀一起轉(zhuǎn)入試劑盒提供的吸附柱中。
[0067](6)4°C下以12，OOOXg的速度離心lOmin，離心后在管的底部及管壁可以看到凝膠狀RNA小滴。棄去收集管中的廢液，加入lml75%乙醇洗RNA小滴一次，渦旋混合樣本。
[0068](7)4°C下以7500Xg的速度離心5min，室溫下空氣干燥5-lOmin。
[0069](8)用 0.1ml DEPC 水溶解 RNA，55-60°C孵育 lOmin。
[0070](9)取10 μ I RNA溶液，加990 μ I DEPC水稀釋，在紫外分光光度計(jì)內(nèi)測定RNA溶液在260nm及280nm處的光密度(OD)值。OD 260/0D 280>1.7時標(biāo)本可用，否則重新提取。根據(jù)0D260值計(jì)算RNA濃度。
[0071]5.2逆轉(zhuǎn)錄
[0072](I)在冰浴的無核酸酶的離心管中加入2μ g總RNA，2y I Random，2 μ ldNTP，補(bǔ)RNase-free 水定容至 13.5 μ I。
[0073](2)70°C加熱5min后迅速在冰上冷卻2min，瞬時離心收集反應(yīng)液后加入4 μ I5X First-Strand Buffer, I μ I 0.1MDTT,0.5 μ I RNasin0
[0074](3)加 I μ I TIANScript M-MLV 混勻。25°C溫浴 lOmin，42°C溫浴 50min，95°C加熱5min終止反應(yīng)，RNase-free ddH20將體系稀釋至30 μ 1，_20°C凍存?zhèn)溆谩?br> [0075]5.3PCR 反應(yīng)
[0076](I) 20 X SYBR solut1n室溫平衡并徹底混勻。
[0077](2)將 125 μ I 20 X SYBR solut1n 加入至 Iml 2.5 X RealMasterMix 中。
[0078](3)在平頭 PCR 管中分別加入 2.5 X RealMasterMix/20 X SYRB solut1n 9μ 1，正向引物及負(fù)向引物各2 μ I,逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物2 μ I,超純水5 μ I。反應(yīng)體系為20 μ I。
[0079](4)在RG3000定量PCR儀上按照RealMasterMix新型熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng):95°C起始變性2min，94°C變性20s，58°C退火20s，72°C延伸30s。用雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法對AQP3基因進(jìn)行相對定量測定。
[0080]6、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理
[0081]相應(yīng)數(shù)據(jù)用SPSS 12.0統(tǒng)計(jì)包進(jìn)行分析，兩樣本均數(shù)比較用t檢驗(yàn)，多樣本均數(shù)比較用方差分析，以P < 0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0082]三、結(jié)果
[0083]1、康復(fù)新對HaCaT細(xì)胞增殖的影響
[0084]MTT比較結(jié)果如下表所示:
[0085]

【權(quán)利要求】
1.美洲大蠊提取物在制備抗AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用途，其特征在于:所述抗AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品為抗皮膚AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的用途，其特征在于:所述抗皮膚AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品為抗UVB照射后引起的皮膚AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任意一項(xiàng)所述的用途，其特征在于:所述藥物、護(hù)膚品、或日化用品為治療皮膚損傷或抗皮膚老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于:所述治療皮膚損傷的藥物、護(hù)膚品或日化用品為治療輻射引起的皮膚損傷的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用途，其特征在于:所述抗皮膚老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品為抗皮膚光老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。
7.美洲大蠊提取物在制備治療皮膚損傷或抗皮膚老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于:所述抗皮膚老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品為抗皮膚光老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品中的用途。
9.一種抗AQP3下降的藥物、護(hù)膚品或日化用品，其特征在于:它是以美洲大蠊提取物為活性成分，加上藥物、護(hù)膚品或日化用品中可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。
10.一種治療皮膚損傷或抗皮膚老化的藥物、護(hù)膚品或日化用品，其特征在于:它是以美洲大蠊提取物為活性成分，加上藥物、護(hù)膚品或日化用品中可接受的輔料或者輔助性成分制備而成的制劑。
【文檔編號】A61K8/98GK104173386SQ201410457833
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年9月10日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】陳光健 申請人:陳光健