促血管化小腸粘膜下層溫敏材料及其制備方法【專利摘要】本發(fā)明提供了基于小腸粘膜下層的促進血管化的溫敏材料，它是將小腸粘膜下層基質、溶解液分別包裝后制備得到，其中，小腸粘膜下層基質由如下方法得到：取小腸粘膜下層，經過酶解、酸溶，冷凍干燥后粉碎，滅菌，得到無菌粉狀或絮狀的小腸粘膜下層基質材料；溶解液由含NaOH的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水組成。本發(fā)明制備的生物材料，兩種基材均可長期保存，使用前將二者按適當比例混合，具有良好的可注射性，37℃可形成穩(wěn)定凝膠，不需交聯(lián)聚合，該溫敏材料體內外實驗均證實具有促進血管化作用。【專利說明】【
技術領域：
】[0001]本發(fā)明涉及基于小腸粘膜下層的促進血管化的溫敏材料及其制備方法。促血管化小腸粘膜下層溫敏材料及其制備方法【
背景技術：
】[0002]水凝膠（Hydrogel)是以水為分散介質的凝膠，具有接近正常組織的含水量及良好的生物相容性，理化性質可控，具有多孔結構，其立體多孔結構與細胞外基質很相似，有利于細胞生長增殖分化，也有利于生物活性因子活性的保持，可微創(chuàng)植入，在組織工程中具有廣泛應用前景。溫敏性水凝膠可在一定溫度范圍內從液態(tài)轉變?yōu)槟z態(tài)，不需其他催化劑及劇烈的反應條件，能良好地填充各種不規(guī)則形狀的組織缺損，能將細胞或者活性物質均勻的分布在缺損部位，促進細胞生長、胞外基質的分泌和組織的自我修復，在組織工程及再生醫(yī)學應用中具有突出的優(yōu)勢。水凝膠可由合成材料（如PCL、PEG、PVA和PNIPAAm等）及天然材料（如殼聚糖、膠原蛋白、透明質酸和脫細胞胞外基質等）制備。與人工合成的凝膠材料相比，天然材料制備的水凝膠具有更好的生物相容性和生物可降解性。[0003]豬小腸黏膜下層（smallintestinalsubmucosa,SIS)，是天然細胞外基質，厚約O.Smm，包含有復雜排列的膠原、蛋白聚糖、葡糖胺和糖蛋白等，可有效地傳遞分子和細胞信息。SIS具有以下特點：（1)SIS無免疫原性，用于移植不引起免疫排斥反應，SIS在超過1000種的跨種交叉移植實驗中均表現(xiàn)為無免疫原性；（2)SIS具有抗微生物活性，可減少感染；(3)SIS有良好的生物力學性質，凍干的SIS抗拉強度減弱，將其復水5分鐘，即可達到穩(wěn)定力學狀態(tài)，為肌腱強度的1/7?1/14;(4)SIS具有良好的生物相容性，可促進多種細胞在材料上的黏附、生長和分化，可在動物體內快速降解；(5)SIS主要由I、III型纖維膠原蛋白構成，含有多種生長因子如堿性成纖維細胞生長因子（bFGF)、轉移生長因子-β(TGF-β)、血管內皮細胞生長因子（VEGF)及硫酸蛋白多糖、纖維連接蛋白（fibr〇nectin，F(xiàn)N)等，即使經過制備過程處理的SIS仍然含有這些生長因子，具有促進血管再生、組織生長的能力；(6)SIS具有部位特異性的組織再生的能力，能迅速誘導細胞浸潤，刺激血管生成和宿主細胞的長入和分化，產生的再生組織在結構和功能上均與原有組織相似；(7)SIS來源方便，易于制備，因此，SIS已用于組織修復研究，重建腹膜、尿道膀胱、肌腱、血管和硬腦膜，用于體表修復等，并已有臨床應用。為進一步拓展SIS材料的臨床應用，可將SIS制備為溫敏凝膠。Kang等將SIS在體外酸溶、中和、凍干后，臨用前與PBS混合成懸液，注入體內后可形成凝膠【Invivoreleaseofbovineserumalbuminfromaninjectablesmallintestinalsubmucosagel.Kang,K.N.；Kim,D.Y.；Yoon,S.M.,etal.IntJPharm,2011，32(16):3969-3976】，但在體外未能形成溫敏凝膠。Hurst等制備SIS凝膠，其方法主要包括：酶解、酸溶、lOraMHC1透析等，滅菌采用氯仿透析滅菌，再用無菌NaOH中和，而獲得凝股【Hurst，R_E.;Hauser，P.J.;Kyker，K_D_，etal·SuppressionandActivationoftheMalignantPhenotypebyExtracellularMatrixinXenograftModelsofBladderCancer:AModelforTumorCell〃Dormancy〃.PLoSOne，2013,8(5):e6418】，該方法十分繁瑣，使用前需無菌操作加入無菌NaOH以中合HCl;并且，其透析的目的在于使溶液中HC1達到lOmM，耗時較長；另外該方法制備的凝膠不適于長期保存。[0004]綜上，目前方法制備的SIS凝膠，在體內可成膠，但難于在體外穩(wěn)定形成凝膠，若將其直接用于體表創(chuàng)面，將不能使SIS在創(chuàng)面有效停留，不利于對體表創(chuàng)面的修復；并且，常用滅菌方法采用的是75%乙醇、氯仿等浸泡，產品形式為液體，不適合于大量生產【UniltedStatesPatent(10)PatentNO·:US8,361，503B2】；如中合后保存，產品即使在常溫下隨時間延長也會形成膠態(tài)，失去其流動性，不適于長期保存；如保存未中合的溶液，雖可延長保存時間，但需無菌操作加入無菌NaOH，并測定其pH值，操作繁瑣，不利于應用?！?br/>發(fā)明內容】[0005]本發(fā)明的目的在于提供可以在體外形成凝膠、且具有促血管生成的基于小腸粘膜下層的溫敏材料及其制備方法。[0006]試驗研究表明，將SIS消化液直接中和凍干后，再加入PBS溶液溶解，均不能在體外有效形成凝膠，然而，將SIS基質材料和堿液分開包裝，使用時再混合確能夠在體外成膠，由此推論，中和反應的順序可能是影響其體外成膠的重要因素。[0007]基于上述推論，本發(fā)明提供了基于小腸粘膜下層的溫敏材料，它是將小腸粘膜下層凝膠基質材料、溶解液分別包裝后制備得到，其中，小腸粘膜下層凝膠基質材料由如下方法得到：[0008]取小腸粘膜下層，經過酶解、酸溶，冷凍干燥，千燥后打粉或剪碎成絮狀，滅菌，得到無菌粉狀或絮狀的小腸粘膜下層凝膠基質材料；[0009]溶解液：由含有NaOH的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水構成。[0010]在預實驗過程中發(fā)現(xiàn)，采用分開包裝的方式的確可以促進產品體外成膠，但是，并非是任意條件均能達到這樣的效果：凝膠濃度低于2%，不能有效形成凝膠，高于4%，未成膠時即非常粘稠，無可注射性。因此，本發(fā)明將小腸粘膜下層凝膠基質材料與溶解液的質量體積比限定為2?4:100(g/ml)。[0011]其中，所述溶解液中NaOH的含量以調節(jié)小腸粘膜下層凝膠基質材料pH=7為準。[0012]進一步地，制備小腸粘膜下層凝膠基質材料的具體操作如下：[0013](1)取干燥的小腸粘膜下層，粉碎，所得SIS粉備用；[0014](2)向HC1溶液中加入胃蛋白酶，待胃蛋白酶完全溶解，即得消化液；[0015](3)取SIS粉與消化液，混勻后，置于搖床上搖晃，待消化液變澄清后，取出進行冷凍千燥，干燥后打粉或剪碎成絮狀，滅菌，得到無菌粉狀或絮狀的小腸粘膜下層凝膠基質材料。[0016]更進一步地，步驟（1)中，粉碎后取過80目篩的粉末，即為SIS粉。該粒徑下有利于后續(xù)的溶解及消化。[0017]更進一步地，步驟（2)中，HC1溶液pH=2?4;消化液中，胃蛋白酶濃度為1呢/ml〇[0018]更進一步地，步驟（3)中，SIS粉與消化液的質量體積比為1:100?2:100。（g/ml)〇[0019]本發(fā)明中，小腸粘膜下層凝膠基質材料采用輻照或環(huán)氧乙烷進行滅菌，溶解液采用過濾滅菌。[0020]本發(fā)明還提供了小腸黏膜下層凝膠的制備方法，它包括如下操作步驟：[0021](1)制備小腸粘膜下層凝膠基質材料：[0022]A、取干燥的小腸粘膜下層，粉碎，所得SIS粉備用；[0023]B、向HC1溶液中加入胃蛋白酶，待胃蛋白酶完全溶解，即得消化液；[0024]C、取SIS粉與消化液，混勻后，置于搖床上搖晃，待消化液變澄清后，取出進行冷凍干燥，干燥后打粉或剪碎成絮狀，滅菌，得到無菌粉狀或絮狀的小腸粘膜下層凝膠基質材料；[0025](2)取小腸粘膜下層凝膠基質材料、溶解液分別包裝后，即得小腸黏膜下層溫敏材料。[0026]本發(fā)明制備的溫敏材料，兩種基材均可長期保存，使用前將二者按適當比例混合后，具有良好的可注射性，37°C可形成穩(wěn)定凝膠，不需交聯(lián)聚合，該溫敏材料體內外實驗均證實具有促進血管化作用。[0027]與現(xiàn)有技術的溫敏材料相比：[0028](1)現(xiàn)有技術不能在體外穩(wěn)定構建凝膠，且現(xiàn)有技術未能證實保留了生長因子活性；而本發(fā)明材料能夠在體外混合后成膠，并且可以緩釋生長因子，體內外均能有效促進血管化，特別是可延長SIS在體表創(chuàng)面的有效作用時間，有利于對體表創(chuàng)面的修復；同時，在某些前期試驗中，可以直接采用體外模型進行驗證，避免了體內試驗帶來的不便。[0029]⑵現(xiàn)有技術中需要進行透析，才能使溶液中HC1達到10mM，從而保證成膠穩(wěn)定性，其耗時較長。本方法中不使用透析技術，同樣可以形成穩(wěn)定的凝膠，操作更為便捷。[0030](3)現(xiàn)有技術滅菌方法采用的是75%乙醇、氯仿等浸泡，制備過程需無菌環(huán)境，不適合于大量生產；本發(fā)明中，采用輻照或環(huán)氧乙烷對凝膠基質材料進行滅菌，緩沖液采用過濾滅菌，更適合大量生產。[0031](4)現(xiàn)有技術制備的產品為液態(tài)溶液或懸浮液，產品即使在常溫下隨時間延長亦可形成膠態(tài)，失去其流動性，不能長期保存；而本發(fā)明滅菌后分開包裝，可長期保存，使用時再混合成膠，保證了產品的穩(wěn)定性和后期使用的便利性?！緦＠綀D】【附圖說明】[0032]圖1SIS溫敏凝膠成膠圖，其中A、B分別為濃度2%、3%SIS溫敏凝膠[0033]圖2SIS溫敏凝膠的掃描電鏡觀察圖[0034]圖3溫敏凝膠水解率檢測結果[0035]圖4SIS凝膠生長因子緩釋結果[0036]圖5SIS溫敏凝膠促進細胞增殖實驗結果[0037]圖6LIVE/DEAD細胞熒光染色結果[0038]圖7皮下注射凝膠后的染色結果[0039]圖8炎性細胞數(shù)目檢測結果[0040]圖9凝膠表面接種HUVEC后的顯微鏡觀察結果[0041]圖10sis溫敏凝膠促進大鼠主動脈環(huán)萌芽結果[0042]圖11微血管檢測結果[0043]圖12SIS溫敏凝膠體內注射后促微血管生成的顯微鏡觀察結果[0044]圖13SIS溫敏凝膠體內注射后促微血管生成的影響【具體實施方式】[0045]實施例1SIS溫敏材料制備[0046]凍干的SIS膜剪碎，經球磨儀在25Hz下球磨5min成粉末，過80目篩。配制〇·01NHCl(pH=2)溶液，向其中加入胃蛋白酶，該胃蛋白酶消化液中胃蛋白酶濃度為lmg/ml，搖床上放置，搖晃至胃蛋白酶完全溶解。向消化液中加入SIS粉末，濃度為1%(g/ml)，攪拌均勻后放置搖床室溫搖晃，觀察SIS消化液變澄清粘稠后，將其倒入培養(yǎng)皿，放置到-40°C冰箱預凍2h以上。將預凍好的SIS消化液放入凍干機，冷凍干燥24h呈海綿狀。將海綿狀SIS消化物剪碎成細小絮狀小腸粘膜下層（SIS)凝膠基質材料。[0047]本發(fā)明中，采用輻照或環(huán)氧乙烷對凝膠基質材料進行滅菌，溶解液采用過濾滅菌。將SIS凝膠基質材料與含有NaOH的磷酸鹽緩沖液（即溶解液）分開包裝，即得本發(fā)明溫敏材料。[0048]配制不同濃度的SIS凝膠配方如下（以1ml凝膠為例，每批次SIS消化物以每次試驗所得配方為準，以下提供參考數(shù)據(jù)）：[0049]表1[0050]【權利要求】1.基于小腸粘膜下層的促進血管化的溫敏材料，其特征在于：它是將小腸粘膜下層凝膠基質材料、溶解液分別包裝后制備得到，其中，小腸粘膜下層凝膠基質材料由如下方法得到：取小腸粘膜下層，經過酶解、酸溶，冷凍干燥，干燥后打粉或剪碎成絮狀，滅菌，得到無菌粉狀或絮狀的小腸粘膜下層凝膠基質材料；溶解液為含有NaOH的磷酸鹽緩沖液或生理鹽水。2.根據(jù)權利要求1所述的溫敏材料，其特征在于：小腸粘膜下層凝膠基質材料與溶解液的質量體積比為2?4:100。3.根據(jù)權利要求1或2所述的溫敏材料，其特征在于：所述溶解液中NaOH的含量以調節(jié)小腸粘膜下層凝膠基質材料PH=6.5?7.2為準。4.根據(jù)權利要求1所述的溫敏材料，其特征在于：制備小腸粘膜下層凝膠基質材料的具體操作如下：(1)取干燥的小腸粘膜下層，粉碎，所得SIS粉備用；(2)向HC1溶液中加入胃蛋白酶，待胃蛋白酶完全溶解，即得消化液；(3)取SIS粉與消化液，混勻后，置于搖床上搖晃，待消化液變澄清后，取出進行冷凍干燥，干燥后打粉或剪碎成絮狀，滅菌，得到無菌粉狀或絮狀的小腸粘膜下層凝膠基質材料。5.根據(jù)權利要求4所述的溫敏材料，其特征在于：步驟（1)中，低溫粉碎后取過80目篩的粉末，即為SIS粉。6.根據(jù)權利要求4所述的溫敏凝膠，其特征在于：步驟⑵中，HC1溶液pH=2?4;消化液中，胃蛋白酶濃度為1mg/m1。7.根據(jù)權利要求4所述的溫敏材料，其特征在于：步驟（3)中，SIS粉與消化液的質量體積比為1:1〇〇?2:1〇〇。8.根據(jù)權利要求1或4所述的溫敏材料，其特征在于：小腸粘膜下層凝膠基質材料采用輻照或環(huán)氧乙烷進行滅菌，溶解液采用過濾滅菌。9.權利要求1所述基于小腸粘膜下層的促進血管化的溫敏材料的制備方法，其特征在于：它包括如下操作步驟：(1)制備小腸粘膜下層凝膠基質材料：A、取千燥的小腸粘膜下層，粉碎，所得SIS粉備用；B、向HC1溶液中加入胃蛋白酶，待胃蛋白酶完全溶解，即得消化液；C、取SIS粉與消化液，混勻后，置于搖床上搖晃，待消化液變澄清后，取出進行冷凍干燥，千燥后打粉或剪碎成絮狀，滅菌，得到無菌粉狀或絮狀的小腸粘膜下層凝膠基質材料；(2)取小腸粘膜下層凝膠基質材料、溶解液分別包裝后，即得溫敏材料。【文檔編號】A61K35/38GK104189009SQ201410440422【公開日】2014年12月10日申請日期:2014年9月1日優(yōu)先權日:2014年9月1日【發(fā)明者】羅靜聰,王瑋申請人:四川大學華西醫(yī)院