銅綠假單胞菌疫苗及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種銅綠假單胞菌疫苗及其制備方法。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是現(xiàn)有的處于研發(fā)及臨床試驗(yàn)階段銅綠假單胞菌疫苗保護(hù)效力低，對(duì)機(jī)體的毒性大，難以治愈感染而不能滿足臨床免疫需求的問題。本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是提供一種新型疫苗的制備方法。該方法包括以下步驟：首先獲取銅綠假單胞菌菌體，然后射線輻照細(xì)菌得到銅綠假單胞菌疫苗。本發(fā)明提供的疫苗不僅用來預(yù)防疾病，也可以應(yīng)用與治療疾病，具有好的應(yīng)用前景。
【專利說明】銅綠假單胞菌疫苗及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明是涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種細(xì)菌疫苗及其制備方法。 技術(shù)背景
[0002] 銅綠假單胞菌（P. aeruginosa)，又稱綠膿桿菌，是一種常見的條件致病菌，其對(duì)外 界各種環(huán)境及滅活措施抵抗力較強(qiáng)，尤其在潮濕的環(huán)境中可長(zhǎng)期生存。土壤、水、空氣、人 和動(dòng)物的皮膚、粘膜、腸道及上呼吸道等多處都有該菌存在。其致病特點(diǎn)是引起繼發(fā)感染， 多發(fā)生在機(jī)體抵抗力降低下的病人，如大面積燒傷，長(zhǎng)期使用免疫抑制劑、腫瘤、低蛋白血 癥患者等。銅綠假單胞菌引起的感染可發(fā)生在人體任何部位，臨床上常見的有皮膚和皮下 組織感染，中耳炎、腦膜炎、呼吸道感染、尿道感染、敗血癥等。據(jù)近年的調(diào)查報(bào)告，院內(nèi)感 染中30%以上都是由銅綠假單胞菌引起的。對(duì)于銅綠假單胞菌引起的感染主要靠藥物治 療，而近些年抗生素的廣泛應(yīng)用產(chǎn)生了大量的耐藥菌株進(jìn)一步加劇了銅綠假單胞菌對(duì)患者 的威脅。目前已經(jīng)研究成熟的銅綠假單胞菌對(duì)抗生素的耐藥機(jī)制包括以下幾方面：①細(xì)菌 外膜通透性降低，阻礙抗生素進(jìn)入細(xì)菌內(nèi)膜靶位；②銅綠假單胞菌細(xì)胞通過主動(dòng)外排過程， 可將范圍極其廣泛的結(jié)構(gòu)不相關(guān)的抗生素或其他有毒物質(zhì)排出細(xì)胞外；③改變抗生素的作 用靶點(diǎn)青霉素結(jié)合蛋白（PBPs)的數(shù)量或結(jié)構(gòu)，以降低藥物與PBPs的親和力，從而產(chǎn)生固有 耐藥；④質(zhì)粒或染色體介導(dǎo)的beta-內(nèi)酰胺酶使抗生素失活。所以目前銅綠假單胞菌的感 染已經(jīng)到了無(wú)抗生素可用的階段，通過免疫方式預(yù)防及控制銅綠假單胞菌感染已是大勢(shì)所 趨。
[0003] 疫苗是一種能刺激機(jī)體免疫系統(tǒng)，活化T和B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生特異性針對(duì)靶抗原 (病毒、細(xì)菌等）的抗體或者免疫細(xì)胞的物質(zhì)。經(jīng)典的疫苗起源于抗感染免疫，即采用處 理過的病原微生物，特別是細(xì)菌及其衍生物作為抗原，促使機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)以預(yù)防 感染性疾病。目前全世界研究的銅綠假單胞菌疫苗制備方式已經(jīng)涉及多個(gè)技術(shù)層面，如熱 或者甲醛處理的死菌疫苗，減毒疫苗，亞單位疫苗，單一組分（菌毛、鞭毛、外膜蛋白OprI/ OprF等）疫苗等。在基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中，單一組分疫苗得了較好的預(yù)防效果，但由于抗原成分單 一，只能針對(duì)單一的疾?。ㄈ绶窝椎龋┑母腥?。滅活（熱、甲醛等）或者減毒（基因突變） 的全菌體疫苗抗病譜相對(duì)擴(kuò)大，但由于制備過程某些未知抗原成分的滅活，細(xì)菌代謝活性 降低，造成免疫原性及預(yù)防效果較差，且由于滅活不徹底，造成疫苗殘留毒性較大。關(guān)于全 菌體疫苗的研發(fā)已經(jīng)在眾多種屬細(xì)菌（志賀菌，淋球菌，腦膜炎雙球菌等）中實(shí)施，但這些 疫苗均已失敗而告終，可想而知制成有效的全菌體疫苗是非常困難的，而目前研制的銅綠 假單胞菌疫苗也依舊存在較大的局限性。理想的銅綠假單胞菌疫苗是盡可能的包括所有潛 在致病抗原成分，對(duì)機(jī)體無(wú)潛在威脅毒性，能夠針對(duì)不同血清型品種均有較好預(yù)防效果的 低毒性全菌體疫苗。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有的全菌體疫苗保護(hù)效力低，對(duì)機(jī)體的毒性大，難以 治愈感染而不能滿足臨床免疫需求的問題，提供的一種新的銅綠假單胞菌全菌體疫苗及其 制備方法。
[0005] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案是提供一種銅綠假單胞菌疫苗的制備方法。 該方法包括以下步驟；首先獲取銅綠假單胞菌菌體；然后射線輻照細(xì)菌得到銅綠假單胞菌 細(xì)菌疫苗。
[0006] 其中，上述方法中所獲取的細(xì)菌菌體是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌菌體。
[0007] 進(jìn)一步的，上述方法包括以下步驟：
[0008] (1).獲取用于制備疫苗的銅綠假單胞菌細(xì)菌株；
[0009] (2).增殖細(xì)菌：將步驟（1)獲取的細(xì)菌株接種在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)菌處于 對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期；
[0010] (3).收集菌體：收集步驟（2)得到的含有菌體及基質(zhì)成分的培養(yǎng)基，離心并收集 離心沉淀物；
[0011] (4).射線處理：將上述凈化處理的離心沉淀物重懸成細(xì)菌懸液，移至非金屬容器 中，用射線輻照細(xì)菌懸液；
[0012] (5).調(diào)節(jié)菌體濃度：將步驟（4)得到的射線輻照后的細(xì)菌懸液再次重懸，調(diào)節(jié)為 最終使用目標(biāo)細(xì)菌濃度，即得到銅綠假單胞菌疫苗
[0013] 優(yōu)選的，上述方法在第（4)步射線處理前或者后，還進(jìn)行純化菌體的步驟。純化菌 體是為了去除有培養(yǎng)基及相應(yīng)細(xì)菌胞外分泌物。純化步驟可以使用各種不引起機(jī)體過敏反 應(yīng)的溶劑進(jìn)行洗滌。優(yōu)選方案為無(wú)菌生理鹽水或者PBS洗滌。集菌純化步驟也以使用如濃 縮、過柱收集法等本領(lǐng)域常用方法。
[0014] 其中，上述方法中所述的射線輻照為使細(xì)菌失去增殖活性且代謝活性保留。
[0015] 其中，上述方法中所述的所述細(xì)菌失去增殖活性是指在適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-48 小時(shí)，無(wú)菌落產(chǎn)生；所述代謝活性保留是指用細(xì)胞活性檢測(cè)試劑檢測(cè)其代謝活性與未接受 過輻照的對(duì)照組細(xì)菌相比不低于正常活性的50%。一般使用輻照后代謝活性為與未接受過 輻照的對(duì)照組細(xì)菌相比的50% -70%的銅綠假單胞菌。
[0016] 其中，上述方法中所述的射線輻照所使用的射線為X射線、gamma射線或同位素放 射源Co 6°產(chǎn)生的射線。
[0017] 其中，上述方法中所述的射線輻照的總劑量為：3300-3500Gy。優(yōu)選的劑量為 3400Gy〇
[0018] 其中，上述方法中射線輻照的方式為低劑量，長(zhǎng)時(shí)間，間斷照射。
[0019] 其中，上述方法中射線輻照的方式為每照射20-25分鐘，停止4-5分鐘，進(jìn)行循環(huán) 照射：劑量為8-9Gy/min，照射6. 2-7. 3小時(shí)。
[0020] 本發(fā)明還提供了 一種由上述方法制備的細(xì)菌疫苗。
[0021] 進(jìn)一步的，上述細(xì)菌疫苗，還含有免疫佐劑。
[0022] 其中，上述細(xì)菌疫苗的劑型為皮下注射制劑、肌注注射制劑、口服或鼻腔吸入制劑 等常用的劑型。
[0023] 同時(shí)，本發(fā)明還提供了上述的細(xì)菌疫苗在制備治療銅綠假單胞菌引起的感染性疾 病的藥物中的用途。
[0024] 其中，上述銅綠假單胞菌引起的感染性疾病包括肺炎、敗血癥、角膜炎、皮膚軟組 織感染等中的至少一種。
[0025] 本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌疫苗由經(jīng)射線輻照處理的銅綠假單胞菌全菌體組成。 且射線輻照處理使細(xì)菌喪失增殖能力，但仍保留代謝活性，因此保留了絕大部分免疫原性， 機(jī)體可針對(duì)免疫原刺激產(chǎn)生強(qiáng)有效的免疫反應(yīng)，即足夠的體液及細(xì)胞免疫預(yù)防及治療由銅 綠假單胞菌引起的感染，同時(shí)也有足夠的安全性。
[0026] 本發(fā)明提供的疫苗制備方法不僅用來預(yù)防疾病，也可以應(yīng)用與治療疾病。具體而 言，針對(duì)正常的動(dòng)物或者人體，使用本專利制備的疫苗可以增強(qiáng)機(jī)體的預(yù)防和抗病能力，達(dá) 到預(yù)防疾病的目的；對(duì)于患有相應(yīng)疾病或者感染的動(dòng)物和人體，本疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生 特定的針對(duì)致病因素的反應(yīng)，快速有效的消滅病原體，達(dá)到治療疾病和病患的目的。
[0027] 本發(fā)明的有益效果在于：該疫苗是一種全菌體滅毒疫苗，但是保留了分泌細(xì)胞外 基質(zhì)及毒性分子的能力，最大程度的保留并發(fā)揮了銅綠假單胞菌的抗原特性，可以激發(fā)機(jī) 體的固有免疫及適應(yīng)性免疫應(yīng)答機(jī)制，增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)，產(chǎn)生足夠的抗體及細(xì)胞免疫 分子對(duì)抗?jié)撛诘母腥静【?。同時(shí)也具有足夠的安全性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1、疫苗制備流程示意圖。
[0029] 圖2、射線處理后細(xì)菌增殖能力變化圖（1拉德=0· 01戈瑞Gy)。
[0030] 圖3、射線處理后細(xì)菌代謝活性變化圖。
[0031] 圖4、小鼠免疫后生存保護(hù)效果圖（5 X 107激發(fā)）。
[0032] 圖5、小鼠免疫后生存保護(hù)效果圖（108激發(fā)）。
[0033] 圖6、小鼠免疫后中性粒細(xì)胞募集比例圖。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌疫苗由經(jīng)射線輻照處理的銅綠假單胞菌全菌體組成。 且射線輻照處理使細(xì)菌喪失增殖能力，但仍保留代謝活性，因此保留了絕大部分免疫原性， 機(jī)體可針對(duì)免疫原刺激產(chǎn)生強(qiáng)有效的免疫反應(yīng)，即足夠的體液及細(xì)胞免疫預(yù)防及治療由銅 綠假單胞菌引起的感染。同時(shí)也具有足夠的安全性。
[0035] 具體而言，要首先培養(yǎng)獲取的銅綠假單胞菌樣品，反復(fù)離心純化后重懸調(diào)節(jié)菌體 濃度至KT/ml，此疫苗懸液接受低劑量長(zhǎng)時(shí)間射線輻射后進(jìn)一步驗(yàn)證細(xì)菌在保留代謝活性 的情況下喪失增殖能力，從而得到疫苗制品。
[0036] 實(shí)驗(yàn)證明，該方法制備的疫苗0. 1ml皮下接種免疫小鼠，分別在7、14天追加等量 接種。在第28天，小鼠腹腔感染活菌（10倍半數(shù)致死量LD50)，結(jié)果顯示接種了本疫苗的小 鼠與對(duì)照組相比，生存率明顯提高，生存保護(hù)試驗(yàn)及結(jié)果見下述具體實(shí)施例。
[0037] 更具體而言，參見圖1所示，本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌疫苗的一個(gè)典型的具體 的制備方法為：
[0038] (1).獲取細(xì)菌樣品。此細(xì)菌樣品包括但不限于臨床樣品菌株、商品化菌株、實(shí)驗(yàn)室 改造的菌株。
[0039] (2).增殖細(xì)菌：將步驟（1)獲取的細(xì)菌接種在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)菌處于對(duì) 數(shù)增長(zhǎng)期。
[0040] (3).收集菌體：收集步驟（2)得到的含有菌體及基質(zhì)成分的培養(yǎng)基，離心并收集 離心沉淀物。
[0041] (4).純化菌體：將離心沉淀物重懸，混勻后再次離心收集離心沉淀物。重復(fù)此步 驟至少3次，保證離心沉淀物中全為菌體，而不含有培養(yǎng)基及相應(yīng)細(xì)菌分泌物等，減少疫苗 受體的過敏反應(yīng)。
[0042] (5).射線處理：將上述凈化處理的離心沉淀物重懸后移置非金屬容器中，射線輻 照細(xì)菌懸液。
[0043] (6).調(diào)節(jié)菌體濃度：將步驟（5)得到的細(xì)菌懸液再次重懸，調(diào)節(jié)為最終使用目標(biāo) 細(xì)菌濃度，即得到目標(biāo)銅綠假單胞菌細(xì)菌疫苗。
[0044] (7).疫苗儲(chǔ)存：將上述步驟（6)得到的細(xì)菌疫苗保存?zhèn)溆?，?yōu)選方案為-20°C或 者-80。。。
[0045] 下面具體對(duì)本發(fā)明疫苗的制作工序及免疫方法進(jìn)行更加進(jìn)一步的具體說明。
[0046] 關(guān)于菌體擴(kuò)增培養(yǎng)條件，具體培養(yǎng)條件（培養(yǎng)基、時(shí)間、溫度、轉(zhuǎn)速）可根據(jù)具體情 況適當(dāng)調(diào)整，而不僅限于實(shí)施例的條件。
[0047] 培養(yǎng)基只要是適合菌體增殖的種類即可，而不限于本發(fā)明實(shí)施例中所涉及的培養(yǎng) 基種類。優(yōu)選培養(yǎng)基可使用實(shí)施例中的培養(yǎng)基。
[0048] 培養(yǎng)的溫度為細(xì)菌適宜生長(zhǎng)的溫度，一般是在35_37°C。優(yōu)選為37°C。
[0049] 對(duì)PH范圍沒有特殊限定，只要在菌體不會(huì)死亡的酸性或者堿性條件下均能夠培 養(yǎng)。培養(yǎng)細(xì)菌的搖床優(yōu)選轉(zhuǎn)速為220r/min，優(yōu)選培養(yǎng)時(shí)間為16-18h。
[0050] 本發(fā)明對(duì)菌體進(jìn)行增菌時(shí)，根據(jù)需要測(cè)定細(xì)菌數(shù)量，以確認(rèn)培養(yǎng)進(jìn)度。菌體數(shù)量可 以吸光度0D或者濁度進(jìn)行反應(yīng)，也可以使用PCR的DNA復(fù)制數(shù)確定，也可以使用其他的本 領(lǐng)域常用方法。
[0051] 本發(fā)明細(xì)菌培養(yǎng)后，要對(duì)收集得到的菌體進(jìn)行純化。純化步驟可以使用各種不引 起機(jī)體過敏反應(yīng)的溶劑進(jìn)行洗滌。優(yōu)選方案為無(wú)菌生理鹽水或者PBS洗滌。集菌純化步驟 也以使用如濃縮、過柱收集法等本領(lǐng)域常用方法。而純化步驟的實(shí)施，可以在輻照前，也可 以在福照后?；蛘咴诟Ｕ杖绾缶鶎?shí)施。
[0052] 本發(fā)明射線輻照所用的射線，可以使用如X射線，ga_a射線，同位素放射源射線 Co6°的射線等種類進(jìn)行，當(dāng)然也可以使用本領(lǐng)域常用的其它輻照源進(jìn)行。
[0053] 本發(fā)明射線輻照的優(yōu)選操作方案為低劑量長(zhǎng)時(shí)間照射，如8Gy/min，每照射20分 鐘停止5分鐘，間斷照射7. 08小時(shí)，總射線劑量為3400Gy。
[0054] 細(xì)菌接受的輻射總劑量以滿足以下要求為準(zhǔn)：
[0055] 使輻照處理后的細(xì)菌具有2個(gè)特點(diǎn)：①無(wú)增殖能力；②代謝活性保留。
[0056] 而檢測(cè)處理后的菌體是否有上述特點(diǎn)的檢測(cè)方法可以使用本領(lǐng)域的以后方法。同 時(shí)，本發(fā)明提供優(yōu)選的檢測(cè)方法：
[0057] ①無(wú)增殖能力的檢測(cè)
[0058] 取出輻照處理后的細(xì)菌用無(wú)菌生理鹽水或者PBS稀釋，然后用細(xì)菌推棒均勻涂布 在LB或者TSA瓊脂平板上，37°C孵箱培養(yǎng)24h，觀察沒有菌落產(chǎn)生，即確定細(xì)菌無(wú)增殖能力。
[0059] ②代謝活性保留的檢測(cè)
[0060] 取出輻照處理后的細(xì)菌制成懸液培養(yǎng)于于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入細(xì)胞活性檢 測(cè)劑（如阿爾馬蘭，MTT，CCK-8等），放入37°C孵箱，在檢測(cè)劑的說明書推薦時(shí)間點(diǎn)和測(cè)0D57(i 值，該值反應(yīng)細(xì)菌的代謝活性，如與未接受過輻照的對(duì)照組細(xì)菌相比無(wú)明顯降低，即細(xì)菌代 謝活性不低于原來的50%。一般使用輻照后代謝活性為與未接受過輻照的對(duì)照組細(xì)菌相比 的50% -70 %的銅綠假單胞菌。
[0061] 本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌疫苗制劑，可含有常用的免疫佐劑以增強(qiáng)疫苗的免疫 效果。本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌疫苗制劑可以有多種免疫方式，如皮下、肌注、口服、鼻腔 吸入等，或者是上述方式的組合。
[0062] 本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌疫苗制劑，也可以有不同的免疫計(jì)量和免疫時(shí)間間 隔?？梢越o藥一次，也可以多次，優(yōu)選方案為第〇、7、14、28天共4次的免疫時(shí)間間隔，但具 體實(shí)施過程不局限于此，可以根據(jù)實(shí)際情況改變或者調(diào)整免疫次數(shù)和免疫時(shí)間點(diǎn)。
[0063] 本發(fā)明提供的銅綠假單胞菌疫苗制劑的劑量可根據(jù)受體情況調(diào)整，優(yōu)選劑量為每 次107?5X 109個(gè)細(xì)菌體。具體免疫數(shù)量也可以根據(jù)受體情況調(diào)整。
[0064] 本發(fā)明提供的疫苗制備方法不僅用來預(yù)防疾病，也可以應(yīng)用與治療疾病。針對(duì)正 常的動(dòng)物或者人體，使用本專利制備的疫苗可以增強(qiáng)機(jī)體的預(yù)防和抗病能力，達(dá)到預(yù)防疾 病的目的；對(duì)于患有相應(yīng)疾病或者感染的動(dòng)物和人體，本疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特定的針 對(duì)致病因素的反應(yīng)，快速有效的消滅病原體，達(dá)到治療疾病和病患的目的。
[0065] 以下通過實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明所提供的疫苗制備過程及相應(yīng)疫苗效果的實(shí) 驗(yàn)結(jié)果。本實(shí)施例只是一種舉例，是本發(fā)明的解決方案之一，并非講本發(fā)明局限于實(shí)施例， 也不局限于實(shí)施例之間的組合。
[0066] 下述實(shí)施例中的銅綠假單胞菌株均來源于美國(guó)菌種收藏所（ATCC)，LB培養(yǎng)基 和阿爾馬藍(lán)試劑購(gòu)自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司，C57/BL6小鼠購(gòu)買自北 京華阜康生物科技股份有限公司，X射線輻照儀為美國(guó)Rad Source公司產(chǎn)品，型號(hào)：RS 2000(RS2000 -Biological Irradiator)。其余試劑和設(shè)備為常規(guī)市售。
[0067] 實(shí)施例一、本發(fā)明銅綠假單胞菌疫苗的制備及功效試驗(yàn)
[0068] 選用銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC 27853,用LB培養(yǎng)基在37°C 220r/min的細(xì)菌搖床 上培養(yǎng)增殖16個(gè)小時(shí)，用0. 5麥?zhǔn)媳葷岫葯z測(cè)濃度，使細(xì)菌達(dá)到約1011個(gè)菌體數(shù)。收集細(xì) 菌培養(yǎng)基，在3500r/min條件下離心lOmin中，收集離心沉淀物用無(wú)菌生理鹽水重懸后再次 按照上述條件離心，重復(fù)3次。將細(xì)菌離心沉淀物用無(wú)菌生理鹽水重懸后，裝在50ml BD管 中，置于X射線輻照儀放射源中心位置下輻照，將完成照射處理的細(xì)菌，用無(wú)菌生理鹽水稀 釋100倍后，用細(xì)菌涂棒均勻涂布在LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)24h，觀察無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明細(xì) 菌無(wú)增殖能力。
[0069] 同時(shí)吸取0. 1ml照射后細(xì)菌于96孔板中，加入10ul阿爾瑪蘭試劑，37°C孵箱放置 4h之后檢測(cè)0D57(I值，與對(duì)照組相比，細(xì)菌保留了代謝活性。射線處理的增殖能力及代謝活 性的改變?nèi)鐖D2、3所示：當(dāng)射線總劑量為3300Gy時(shí)，細(xì)菌的增殖能力完全喪失，細(xì)菌涂板擴(kuò) 增無(wú)菌落生長(zhǎng)；而此時(shí)的細(xì)菌仍有57%的代謝活性，當(dāng)射線總劑量為7000Gy時(shí)，細(xì)菌的代 謝活性完全喪失，表明細(xì)菌死亡。將細(xì)菌再次重懸至lO^Vml，保存在_20°C備用。
[0070] 選用C57/BL6小鼠鼻腔免疫模型，分為疫苗免疫組和生理鹽水免疫組，每組10只。 用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，將麻醉好的小鼠放在傾斜45°C的操作臺(tái)上，保持小鼠 處于頭高腳底位。實(shí)驗(yàn)組小鼠于第〇, 7, 14, 28天給小鼠2側(cè)鼻孔各緩慢注入10ul上述制 備的銅綠假單胞菌菌體疫苗，對(duì)照組小鼠2側(cè)鼻腔注入lOul無(wú)菌生理鹽水，觀察小鼠生存 狀態(tài)。第35天用ATCC27853活菌5X107個(gè)菌體數(shù)腹腔注射兩組小鼠，觀察一周生存率。結(jié) 果圖4所示，免疫組小鼠7天總生存率為100%，而對(duì)照組小鼠感染銅綠假單胞菌后第2天 死亡率即達(dá)到90 %，免疫組小鼠生存率較對(duì)照組小鼠明顯提高，說明本發(fā)明的銅綠假單菌 疫苗有效。
[0071] 實(shí)施例二、本發(fā)明銅綠假單胞菌疫苗的制備及功效試驗(yàn)
[0072] 選用銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)株ATCC27853,用LB培養(yǎng)基在37°C 220r/min的細(xì)菌搖床 上培養(yǎng)增殖16個(gè)小時(shí)，用0. 5麥?zhǔn)媳葷岫葯z測(cè)濃度，使細(xì)菌達(dá)到約1011個(gè)菌體數(shù)。收集細(xì) 菌培養(yǎng)基，在3500r/min條件下離心lOmin中，收集離心沉淀物用無(wú)菌生理鹽水重懸后再次 按照上述條件離心，重復(fù)3次。將細(xì)菌離心沉淀物用無(wú)菌生理鹽水重懸后，裝在50ml BD管 中，置于X射線輻照儀放射源中心位置下輻照，條件8Gy/min，共間斷照射470分鐘，（照射 20分鐘，停止5分鐘后繼續(xù)，重復(fù)上述循環(huán)，總照射時(shí)間為470分鐘）。
[0073] 取lOOul完成照射處理的細(xì)菌，用無(wú)菌生理鹽水稀釋100倍后，用細(xì)菌涂棒均勻涂 布在LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)24h，觀察無(wú)菌落生長(zhǎng)，表明細(xì)菌無(wú)增值能力。
[0074] 同時(shí)吸取lOOul照射后細(xì)菌于96孔板中，加入10ul阿爾瑪蘭試劑，37°C孵箱放置 4h之后檢測(cè)0D 57(I值，與未接受射線輻照的對(duì)照組細(xì)菌相比，細(xì)菌代謝活性為對(duì)照組未處理 過的細(xì)菌代謝活性的58. 3%，將此處理的細(xì)菌涂板在細(xì)菌培養(yǎng)箱中放24h，無(wú)菌落增長(zhǎng)。將 細(xì)菌再次重懸至保存在_20°C備用。
[0075] 選用C57/BL6小鼠鼻腔免疫模型，用10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠，將麻醉好 的小鼠放在傾斜45°C的操作臺(tái)上，保持小鼠處于頭高腳底位進(jìn)行免疫。實(shí)驗(yàn)組小鼠于第 0, 7, 14, 28天給小鼠2側(cè)鼻孔各緩慢注入10ul上述制備的銅綠假單胞菌菌體疫苗，對(duì)照 組小鼠給予等量無(wú)菌生理鹽水鼻腔注入，每次免疫后觀察小鼠生存狀態(tài)。第35天用ATCC 27853活菌108個(gè)菌體數(shù)腹腔注射感染小鼠，觀察一周生存率。
[0076] 結(jié)果顯示全菌體疫苗免疫組小鼠生存率提高（圖5)，且對(duì)照生理鹽水組小鼠銅綠 假單胞菌激發(fā)后8h小鼠肺中中性粒細(xì)胞募集數(shù)量為7. 14%，而疫苗免疫組小鼠銅綠假單 胞菌激發(fā)后8h小鼠肺中中性粒細(xì)胞募集數(shù)量增加到34. 7%，表明其抵抗銅綠假單胞菌感 染能力增強(qiáng)（圖6)。
【權(quán)利要求】
1. 銅綠假單胞菌疫苗的制備方法，其特征包括以下步驟；首先獲取銅綠假單胞菌菌 體；然后接受射線輻照得到細(xì)菌疫苗。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的銅綠假單胞菌疫苗的制備方法，其特征在于：所獲取的銅綠 假單胞菌菌體是處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)菌菌體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1-2所述的銅綠假單胞菌疫苗的制備方法，其特征在于包括以下步 驟： (1) .獲取用于制備疫苗的銅綠假單胞菌細(xì)菌株； (2) .增殖細(xì)菌：將步驟（1)獲取的細(xì)菌株接種在適宜培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)菌處于對(duì)數(shù) 增長(zhǎng)期； (3) .收集菌體：收集步驟（2)得到的含有菌體及基質(zhì)成分的培養(yǎng)基，離心并收集離心 沉淀物； (4) .射線處理：將上述凈化處理的離心沉淀物重懸成細(xì)菌懸液，移至非金屬容器中， 用射線輻照細(xì)菌懸液； (5) .調(diào)節(jié)菌體濃度：將步驟（4)得到的射線輻照后的細(xì)菌懸液再次重懸，調(diào)節(jié)為最終 使用目標(biāo)細(xì)菌濃度，即得到銅綠假單胞菌疫苗。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的銅綠假單胞菌疫苗的制備方法，其特征在于：在射 線輻照處理前或者射線輻照后，進(jìn)行純化菌體的步驟；或者，在射線輻照處理前后均進(jìn)行純 化菌體的步驟。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述的銅綠假單胞菌疫苗的制備方法，其特征在于：所述 射線輻照為使細(xì)菌失去增殖活性且代謝活性保留。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的銅綠假單胞菌疫苗的制備方法，其特征在于：所 述增殖活性是指在適宜培養(yǎng)基上培養(yǎng)24-48小時(shí)，無(wú)菌落產(chǎn)生；所述代謝活性保留是指用 細(xì)胞活性檢測(cè)試劑檢測(cè)其代謝活性與未接受過輻照的對(duì)照組細(xì)菌相比不低于正常活性的 50%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6任一項(xiàng)所述的銅綠假單胞菌疫苗的制備方法，其特征在于：所述代 謝活性保留是指用細(xì)胞活性檢測(cè)試劑檢測(cè)其代謝活性與未接受過輻照的對(duì)照組細(xì)菌的正 ?；钚韵啾鹊?0% -70%。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-7任一項(xiàng)所述的銅綠假單胞菌疫苗的制備方法，其特征在于：所述 的射線輻照使用的射線為X射線、gamma射線或同位素放射源Co 6°產(chǎn)生的射線。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8任一項(xiàng)所述的銅綠假單胞菌疫苗的制備方法，其特征在于：所述 的射線輻照的總劑量為：3300-3500Gy。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)所述的銅綠假單胞菌疫苗的制備方法，其特征在于：所述 的射線輻照的方式為低劑量，長(zhǎng)時(shí)間，間斷照射。
11. 根據(jù)權(quán)利要求10所述的銅綠假單胞菌疫苗的制備方法，其特征在于：所述的射線 輻照的方式為每照射20-25分鐘，停止4-5分鐘，進(jìn)行循環(huán)照射；劑量為8-9Gy/min，照射 6. 2-7. 3 小時(shí)。
12. 銅綠假單胞菌疫苗，其特征在于，由權(quán)利要求1-11任一項(xiàng)所述的方法制成的銅綠 假單胞菌疫苗作為主要活性成分。
13. 根據(jù)權(quán)利要求12所述的銅綠假單胞菌疫苗，其特征在于：還含有免疫佐劑。
14. 根據(jù)權(quán)利要求12或13所述的銅綠假單胞菌疫苗，其特征在于：所述銅綠假單胞菌 疫苗的劑型為皮下注射制劑、肌注注射制劑、口服或鼻腔吸入制劑。
15. 權(quán)利要求12-14任一項(xiàng)所述的銅綠假單胞菌疫苗在制備治療銅綠假單胞菌引起的 感染性疾病的藥物中的用途。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15所述的用途，其特征在于所述的銅綠假單胞菌引起的感染性疾病 為肺炎、敗血癥、角膜炎或皮膚軟組織感染中的至少一種。
【文檔編號(hào)】A61P31/04GK104189898SQ201410437862
【公開日】2014年12月10日 申請(qǐng)日期:2014年8月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月27日
【發(fā)明者】魏于全, 李燕燕, 王震玲 申請(qǐng)人:四川大學(xué)