α-蒎烯、β-蒎烯、1,8-桉葉油醇、莰烯中一種以上在制備人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷藥物的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種α-蒎烯、β-蒎烯、1,8-桉葉油醇、莰烯中的一種或一種以上在制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明可以有效提高內(nèi)皮細(xì)胞存活率，從而具有制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物的新用途。
【專利說明】α -蒎烯、β -蒎烯、1, 8-桉葉油醇、莰烯中一種以上在制備人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷藥物的應(yīng)用
[0001]

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0002]本發(fā)明涉及α-菔烯、β-菔烯、1，8_桉葉油醇、莰烯中的一種或一種以上在制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物的應(yīng)用，屬于制藥領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0003]心血管系統(tǒng)疾病(card1vascular disease, CVD)如高血壓、糖尿病導(dǎo)致的心血管系統(tǒng)損傷，動脈粥樣硬化，心肌梗死，心絞痛，風(fēng)濕性心臟病等是心血管疾病的常見疾病，已成為嚴(yán)重危害人類健康、引起死亡的主要疾病，同時也是老年人認(rèn)知功能障礙和情感障礙的重要原因之一。我國為CVD高發(fā)國家，CVD年發(fā)病率為(185?219) /10萬，估計(jì)每年有200萬新發(fā)CVD病例，有150萬人死于CVD，有CVD存活者700萬人。CVD是我國人口死亡的第一位原因，2 /3的CVD患者死亡或遺留不同程度的殘疾，給國家和家庭造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。據(jù)估計(jì)每年CVD的治療費(fèi)用約150億元人民幣。
[0004]內(nèi)皮細(xì)胞(vascular endothelial cell, VEC)作為人體最大的器官,在維持血管穩(wěn)態(tài)功能中起重要作用。整個血管的內(nèi)表面由一層內(nèi)皮細(xì)胞所覆蓋，是構(gòu)成血管通透性的主要屏障，并能合成和分泌調(diào)節(jié)凝血-纖溶系統(tǒng)的物質(zhì)、調(diào)節(jié)血管張力的因子以及細(xì)胞因子等，在血管張力、血管形成及炎癥反應(yīng)中起有重要作用。血管內(nèi)皮細(xì)胞層不僅是血液與組織間的屏障，而且是十分活躍的代謝及內(nèi)分泌器官，血管內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中起十分重要的作用。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，心血管疾病的發(fā)生與炎性反應(yīng)的產(chǎn)生有著密切的聯(lián)系。炎性反應(yīng)細(xì)胞因子包括TNF-α、IL、TXA2、Ang I1、IFN Y、細(xì)胞集落因子等，血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)是各種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展過程中的一個關(guān)鍵組成部分，是其共同的病理生理學(xué)基礎(chǔ)。當(dāng)血管內(nèi)皮細(xì)胞受到損傷時，除了引起血管壁的損傷外，更重要的是內(nèi)分泌功能的失調(diào)，使其分泌的多種活性物質(zhì)及相關(guān)因子之間的平衡被打破，從而導(dǎo)致心血管系統(tǒng)功能的障礙?？刂蒲仔苑磻?yīng)的機(jī)制十分復(fù)雜，體外亦具有諸多的影響因素，其作用過程包含許多環(huán)節(jié)。因此，開展血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷保護(hù)作用的研究，對降低心血管系統(tǒng)的危險(xiǎn)因素及心腦血管系統(tǒng)疾病的預(yù)防、治療和愈后具有非常重要的意義，目前已成為心腦血管疾病研究的新熱點(diǎn)。
[0005]研究表明，機(jī)體組織NO含量的變化直接影響內(nèi)皮功能，從而導(dǎo)致原發(fā)性高血壓、冠狀動脈粥樣硬化、心肌缺血再灌注損傷、充血性心力衰竭等許多心血管疾病。NO是由一氧化氮合酶(NOS)從L-精氨酸合成的自由基，是一種高反應(yīng)的小分子。NO執(zhí)行重要的生物功能，包括擴(kuò)張血管、抗血小板聚集、抑制平滑肌細(xì)胞增殖等。內(nèi)皮細(xì)胞存在有兩種一氧化氮合酶，即iNOS和eNOS。一氧化氮合酶是NO產(chǎn)生過程中的限速酶，因此NOS的酶活性及其表達(dá)量直接影響到NO的產(chǎn)量。在正常人血管內(nèi)皮細(xì)胞中eNOS表達(dá)較多，iNOS表達(dá)較少，而病理情況下則相反。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κ B在體內(nèi)存在于胞漿中，被激活后進(jìn)入細(xì)胞核與TNF-a等促炎細(xì)胞因子、iNOS等基因的位點(diǎn)結(jié)合，啟動多種炎性基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯過程，導(dǎo)致持續(xù)或放大的炎癥反應(yīng)。從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能炎性損傷，誘發(fā)包括高血壓、冠心病、慢性腎衰、外周血管疾病、糖尿病及慢性腎衰等一系列心腦血管疾病。基于上述理想，如何發(fā)明一種制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物應(yīng)用，成為了業(yè)界亟待解決的課題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于，提供一種α-菔烯、β-菔烯、1，8_桉葉油醇、莰烯中的一種或一種以上在制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物的應(yīng)用。本發(fā)明可以有效提高內(nèi)皮細(xì)胞存活率，從而具有制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物的新用途。
[0007]為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供的技術(shù)方案如下:α -菔烯、β -菔烯、1，8-桉葉油醇、莰烯中的一種或一種以上在制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物的應(yīng)用。
[0008]上述的α-菔烯、β-菔烯、1，8_桉葉油醇、莰烯中的一種或一種以上在制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物的應(yīng)用，是在制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的高血壓、冠心病、慢性腎衰、外周血管疾病、糖尿病或慢性腎衰的藥物的應(yīng)用。
[0009]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明可以有效提高內(nèi)皮細(xì)胞存活率，具有制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物的新用途。
[0010]1、以下為本發(fā)明的藥效研究實(shí)驗(yàn):
1.1 LPS的配制
將0.1gLPS粉末溶于20ml 0.9%的氯化鈉注射液中，配成終濃度為5mg/ml的母液，過濾除菌后-20°C冰箱中保存，臨用時用氯化鈉注射液稀釋成所需濃度。
[0011]1.2 α-菔烯、β -菔烯、1，8-桉葉油醇和莰烯標(biāo)準(zhǔn)品均可從市場購得。
[0012]1.3 α-菔烯試液的配制
取標(biāo)準(zhǔn)品10 μ 1，加DMSO定容至10ml，配成濃度為0.98mg/ml的母液，過濾除菌常溫避光保存，臨用時用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度(0.371 μ g/L)。
[0013]1.4 菔烯試液的配制
取標(biāo)準(zhǔn)品10 μ 1，加DMSO定容至10ml，配成濃度為0.98mg/ml的母液，過濾除菌常溫避光保存，臨用時用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度(0.202 μ g/L)。
[0014]1.5 1，8-桉葉油醇試液的配制
取標(biāo)準(zhǔn)品10 μ 1，加DMSO定容至10ml，配成濃度為0.99mg/ml的母液，過濾除菌常溫避光保存，臨用時用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度(0.438 μ g/L)。
[0015]1.6莰烯試液的配制
稱取標(biāo)準(zhǔn)品0.1g,加DMSO溶解并定容至1ml,配成濃度為10mg/ml,過濾除菌常溫避光保存，臨用時用無血清的DMEM培養(yǎng)基稀釋成所需濃度(0.405 μ g/L)。
[0016]2實(shí)驗(yàn)方法
2.1 HUVECs的復(fù)蘇
HUVECs購于美國SCIENCELL公司，北京裕恒豐國內(nèi)代理公司。從超低溫冰箱中取出凍存的HUVECs，立即放入37°C水浴中迅速解凍。顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)(I X 15個/ml)后，以1:3的比例將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入3個25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶，每瓶加2.5ml ECM,平晃使其均勻鋪滿瓶底。放入37°C，飽和濕度，5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液一次。
[0017]2.2 HUVECs 的傳代
待細(xì)胞生長融合成單層細(xì)胞后，棄掉培養(yǎng)液，用無菌PBS緩沖液洗滌兩次，每次3ml。加入Iml 0.25%胰蛋白酶，置倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞回縮變圓后，迅速加入1.2ml中和液終止消化，用吸管吹打制成細(xì)胞懸液，常溫1500r/min離心5_6min.棄上清，加入6mlECM按
I: 3比例將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶，置37°C，飽和濕度，5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0018]2.3 HUVECs 的凍存
待細(xì)胞長滿后，胰酶消化法收集第3代對數(shù)生長期細(xì)胞，顯微鏡下細(xì)胞計(jì)數(shù)(I X 15個/ml)后，1500r/min離心5-6min。棄上清，每管加入1.5ml凍存液，混勻后轉(zhuǎn)移至凍存管內(nèi)，采取梯度冷凍先置于4°C 30 min、再-20°C lh、后置于_80°C長期保存。
2.4藥效研究實(shí)驗(yàn)
2.4.1實(shí)驗(yàn)分組
實(shí)驗(yàn)分成六個組:空白組(Control Dose, Contr.)、LPS 模型組(Model Dose, LPS)、α -菔烯組、β -菔烯組、I, 8-桉葉油醇組和莰烯組。
[0019]2.4.2蘇木素-伊紅染色(HE染色)
將形態(tài)完好的細(xì)胞接種到6孔板內(nèi)，長滿后按上述分組加藥，LPS孵育12h后，取出PBS浸洗3次，每次5分鐘，加4%的多聚甲醛固定15min，棄去多聚甲醛，PBS浸洗3次，每次5分鐘，待孔內(nèi)干燥后，加蘇木精染液染色15-20 min, PBS浸洗3次，每次5分鐘，HCL-乙醇(75%乙醇配制1%HCL)分化30秒，PBS浸洗3次，每次5分鐘，95%乙醇潤洗5秒，伊紅染液染色(5-10)分鐘，70%乙醇洗2次。鏡檢著色滿意后觀察細(xì)胞，拍照。
[0020]2.4.3四氮唑鹽法(MTT)分析細(xì)胞存活率
取生長良好的傳代培養(yǎng)的HUVECs，制成細(xì)胞懸液，以每孔I X 14個接種于96孔培養(yǎng)板(每孔100 μ I),培養(yǎng)至細(xì)胞基本融合，換成無血清的DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24h，使細(xì)胞同步化。每孔分別加入上述配置好的各種藥物，繼續(xù)培養(yǎng)12h，再加入MTT (5mg/ml)20y 1，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)。小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μ I 二甲基亞砜，低速震蕩lOmin，使結(jié)晶物充分溶解。在酶聯(lián)免疫檢測儀490nm波長處測量各孔吸光值，結(jié)果以O(shè)D值表示。細(xì)胞存活率=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值X 100%。
[0021]2.4.4乳酸脫氫酶(LDH)的測定
將HUVECs經(jīng)過上述分組給藥處理后，收集24孔板培養(yǎng)液，吸出培養(yǎng)液，-20°C冰箱保存，備測。
[0022](I)分析原理:LDH能夠催化乳酸生成丙酮酸，丙酮酸與2，4-二硝基苯肼反應(yīng)在堿性環(huán)境下形成棕紅色苯腙化合物，在440nm波長測定，通過比色求出酶的活力。
[0023](2)分析方法:根據(jù)試劑盒說明書完成。取樣:

【權(quán)利要求】
1.α-菔烯、β-菔烯、1，8-桉葉油醇、莰烯中的一種或一種以上在制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的α-菔烯、β-菔烯、1，8_桉葉油醇、莰烯中的一種或一種以上在制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的藥物的應(yīng)用，其特征在于:是在制備治療人血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷導(dǎo)致的高血壓、冠心病、慢性腎衰、外周血管疾病、糖尿病或慢性腎衰的藥物的應(yīng)用。
【文檔編號】A61P9/00GK104127394SQ201410335806
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年7月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月15日
【發(fā)明者】沈祥春, 陶玲, 張彥燕, 令狐克剛, 張小金 申請人:沈祥春, 陶玲