一種自組裝多肽—凋亡素基因復(fù)合納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種自組裝多肽—凋亡素基因復(fù)合納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用。本發(fā)明所述的自組裝多肽—凋亡素基因復(fù)合納米顆粒是由自組裝多肽作為載體，通過自身的酸性氨基酸和堿性氨基酸所帶的電荷與攜帶凋亡素基因的質(zhì)粒分子之間形成離子鍵結(jié)合，質(zhì)粒分子牢固粘附于自組裝多肽表面，形成復(fù)合納米顆粒。該復(fù)合納米顆粒呈纖維狀，長度為100～200nm，直徑為10～20nm。該納米顆粒表面富含精氨酸，能與細(xì)胞膜表面精氨酸受體識(shí)別結(jié)合并被細(xì)胞攝取，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)其所攜帶的基因，所表達(dá)的凋亡素蛋白能特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對正常細(xì)胞無毒。本發(fā)明的復(fù)合納米顆粒是一種新型的抗腫瘤基因治療生物制劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【專利說明】-種自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒及其制備方法 和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因治療【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種能特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡而對正 常細(xì)胞無毒的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒及其制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 凋亡素（Apoptin)亦稱 VP3,是源自雞貧血病毒（chicken anemia virus，CAV)的 一種小分子蛋白，分子量13. 6 kDa，由121個(gè)氨基酸組成，富含脯氨酸、堿性氨基酸和高比 例的絲/蘇氨酸殘基。凋亡素與其他任何動(dòng)物或病毒蛋白沒有序列同源性。凋亡素能特異 性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和具有轉(zhuǎn)化表型的細(xì)胞凋亡而對正常細(xì)胞無毒性作用。迄今，已有的研究 報(bào)道表明，凋亡素能夠特異性的誘導(dǎo)15種以上不同組織來源的人腫瘤細(xì)胞類型共70余種 腫瘤細(xì)胞系凋亡，由此可見凋亡素具有廣譜的腫瘤細(xì)胞誘導(dǎo)凋亡效應(yīng)。是一種非常有應(yīng)用 前景的抗腫瘤生物制劑。
[0003] 以往在凋亡素應(yīng)用的探索中有以腺病毒為載體的質(zhì)粒投送、將凋亡素質(zhì)粒與唾液 酸糖蛋白通過多聚賴氨酸鏈接靶向?qū)敫闻K腫瘤、以滅活禽痘病毒為凋亡素質(zhì)粒載體、以 透膜肽TAT或PTD4與凋亡素蛋白融合，或在此基礎(chǔ)上對凋亡素的氨基酸序列進(jìn)行突變、改 造展開應(yīng)用研究、也有以噬菌體納米生物顆粒（Phage Nanobioparticle)作為凋亡素投送 載體的研究。這些研究為凋亡素的臨床應(yīng)用做出了有益的探索，但還是面臨一系列難題即： ①以改造的生物載體投送凋亡素質(zhì)?；虻蛲鏊鼗颍苽溥^程繁瑣、其投送效率低，誘導(dǎo)腫 瘤細(xì)胞凋亡效果不理想；②以改造后的病毒作為基因載體其安全性有待進(jìn)一步評估；③以 透膜肽融合凋亡素蛋白質(zhì)投送，凋亡素蛋白質(zhì)制備難度大、成本高、難以獲取大量可溶性蛋 白質(zhì)，由于凋亡素蛋白源自病毒其在溶液中易聚集沉淀，并且凋亡素蛋白質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)也會(huì) 使宿主產(chǎn)生相應(yīng)抗體，大大降低其誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。
[0004] 目前，納米技術(shù)的發(fā)展為腫瘤的生物治療提供了全新的技術(shù)平臺(tái)。納米技術(shù)是指 在1~100 nm尺度范圍內(nèi)研究原子、分子的結(jié)構(gòu)及其相互作用并加以應(yīng)用的技術(shù)。近年來， 納米給藥技術(shù)越來越多的被應(yīng)用到了抗腫瘤研究中。隨著研究的深入，現(xiàn)已認(rèn)識(shí)到，應(yīng)用納 米技術(shù)可改善藥物劑型的理化特性，并且提高了藥物的靶向性、增高實(shí)體瘤內(nèi)部血藥濃度、 緩釋性等優(yōu)點(diǎn)，是當(dāng)前腫瘤診斷和治療的研究熱點(diǎn)之一，主要集中在發(fā)展攜帶抗腫瘤藥物 或作為腫瘤成像試劑的納米顆粒載體。
[0005] 隨著納米生物技術(shù)的飛速發(fā)展，一種新型的非病毒載體系統(tǒng)：納米基因載體系統(tǒng) 的出現(xiàn)為腫瘤的基因治療注入了新的活力。它與病毒載體相比有如下的優(yōu)點(diǎn)：低免疫原性； 高容量性；可對插入其中的物質(zhì)成分有很好的保護(hù)作用。也有學(xué)者利用納米技術(shù)在體內(nèi)投 送 Small Interfering RNA (Si RNA)進(jìn)行了探索。
[0006] 最近，一種新型原位水溶膠納米投送材料被開發(fā)出來，該系統(tǒng)基于自組裝多肽 (self-assembling peptide),它能夠在生理?xiàng)l件下自發(fā)組裝交聯(lián)成直徑1(T20 nm納米纖 維水凝膠，在含有離子的水溶液中形成穩(wěn)定的β -折疊結(jié)構(gòu)，無免疫原性，組裝交聯(lián)過程中 無需經(jīng)過紫外或化學(xué)修飾，其序列中富含精氨酸殘基，易于與細(xì)胞膜表面精氨酸受體結(jié)合 轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)，可用于蛋白質(zhì)、小分子RNA、疏水性化療藥物紫杉醇的包裝投送。但大分子 量的重組質(zhì)粒DNA與自組裝多肽的包裝和相關(guān)研究尚無報(bào)道，以往向細(xì)胞內(nèi)投送重組質(zhì)粒 DNA常用的方法有：脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、低溫磷酸鈣轉(zhuǎn)染、DEAE葡聚糖介導(dǎo)轉(zhuǎn)染、電穿孔、顯微 注射等，上述方法各自有其優(yōu)缺點(diǎn)。但都存一個(gè)共性：對細(xì)胞有損傷。
[0007] 為此，研制開發(fā)一種自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒及其制備方法和應(yīng) 用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明第一目的在于提供一種自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒；第二目的 在于提供一種自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒的制備方法；第三目的在于提供一種 自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒在抗腫瘤治療中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明第一目的這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒，是 以自組裝多肽作為載體，通過自身的酸性氨基酸和堿性氨基酸所帶的電荷與攜帶凋亡素基 因的質(zhì)粒分子之間形成離子鍵結(jié)合，質(zhì)粒分子牢固粘附于自組裝多肽表面，形成復(fù)合納米 顆粒。
[0010] 本發(fā)明第二目的這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒的制 備方法，包括如下步驟： (1) 合成自組裝多肽； (2) 構(gòu)建含凋亡素基因的質(zhì)粒； (3) 配制自組裝多肽溶液； (4) 在多肽溶液中加入步驟（2)構(gòu)建的質(zhì)粒溶液，充分作用后得到納米顆粒懸濁液； (5) 納米顆粒檢測。
[0011] 本發(fā)明第三目的這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒在抗 腫瘤治療中的應(yīng)用。
[0012] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為： (1) 本發(fā)明首次以合適的自組裝多肽與大分子重組質(zhì)粒DAN間的量質(zhì)比，制備自組裝 多肽包裝凋亡素編碼重組質(zhì)粒（pcDNA3-別)，形成一種纖維狀復(fù)合納米顆粒，其化 學(xué)本質(zhì)為自組裝多肽與質(zhì)粒DNA形成的復(fù)合生物大分子，長度度約100?200nm，直徑約 10?20nm不等； (2) 本發(fā)明所述的復(fù)合納米顆粒能被細(xì)胞攝取，不損傷細(xì)胞，能被細(xì)胞高效率攝取，攝 取率大于95%，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)其所攜帶基因，所表達(dá)的凋亡素蛋白能特異性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋 亡而對正常細(xì)胞無毒。由于凋亡素不損傷正常細(xì)胞，可克服以往腫瘤基因治療中治療基因 靶向性不足的缺點(diǎn)，此復(fù)合納米顆粒是一種新型的抗腫瘤基因治療生物制劑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013] 圖 1 為 pcDNA3-/i4-a/7〇/7ii/7 質(zhì)粒分子結(jié)構(gòu)圖； 圖2為自組裝多肽溶液與自組裝多肽一pcDNA3-別-卻復(fù)合納米顆粒懸濁液； 圖3為未包裝pcDNA3-/^-a/7〇/?ii與自組裝多肽一pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7復(fù)合納米顆粒 瓊脂糖凝膠電泳； 圖中，I-DNA marker ;2-未包裝pcDNA3-ffl-<3/70/7ii/? ;3-自組裝多膚一^>c\Mk?>-HA-apoptin 復(fù) 合納米顆粒； 圖4為自組裝多肽一pcDNA3-別-卻復(fù)合納米顆粒透射電鏡圖片； 圖5為免疫熒光技術(shù)檢測凋亡素基因在腎臟透明細(xì)胞癌7860內(nèi)表達(dá)(放大倍數(shù)： 10X20)； 圖中，A-自組裝多肽處理，細(xì)胞無凋亡素蛋白表達(dá)；B-熒光染料DAPI顯示細(xì)胞核； C-未包裝的pcDNA3-別-卻質(zhì)粒處理，細(xì)胞無凋亡素蛋白表達(dá)；D-熒光染料DAPI顯 示細(xì)胞核；E-自組裝多肽一pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7復(fù)合納米顆粒攜帶的pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7 質(zhì)粒能在腎臟透明細(xì)胞癌7860細(xì)胞內(nèi)表達(dá)；F-熒光染料DAPI顯示細(xì)胞核； 圖6為免疫熒光技術(shù)檢測凋亡素基因在腎臟透明細(xì)胞癌7860細(xì)胞株和腎小管近端上 皮細(xì)胞HK2細(xì)胞株(正常細(xì)胞）內(nèi)表達(dá)定位(放大倍數(shù)：10X50); 圖中，A-自組裝多肽一pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7復(fù)合納米顆粒攜帶的pcDNA3-/i4-a/7〇/7ii/7 質(zhì)粒在正常內(nèi)表達(dá)，熒光顯示凋亡素蛋白；B-熒光染料DAPI顯示細(xì)胞核；C-A，B重疊拼 合顯示正常細(xì)胞輪廓及細(xì)胞核，在正常細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的凋亡素蛋白主要分布于細(xì)胞質(zhì)中； D-自組裝多肽一pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7復(fù)合納米顆粒攜帶的pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7質(zhì)粒在腫 瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，突光顯示凋亡素蛋白；E-突光染料DAPI顯示細(xì)胞核；F- D, E重疊拼合顯示 正常細(xì)胞輪廓及細(xì)胞核，在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)出的凋亡素蛋白主要分布于細(xì)胞核內(nèi)； 圖7為光鏡檢測腎臟透明細(xì)胞癌7860細(xì)胞株和腎小管近端上皮細(xì)胞HK2細(xì)胞株(正常 細(xì)胞）經(jīng)納米顆粒處理后增殖狀況(放大倍數(shù)：10 X 20); 圖8為光鏡檢測腎臟透明細(xì)胞癌7860細(xì)胞(放大倍數(shù)：10 X 40)。

【具體實(shí)施方式】
[0014] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于 本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換，均落入本發(fā)明保護(hù)范圍。
[0015] 本發(fā)明所述的自組裝多肽一凋亡素（Apoptin)基因復(fù)合納米顆粒是以自組裝多肽 作為載體，通過自身的酸性氨基酸和堿性氨基酸所帶的電荷與攜帶凋亡素基因的質(zhì)粒分子 之間形成離子鍵結(jié)合，質(zhì)粒分子牢固粘附于自組裝多肽表面，形成復(fù)合納米顆粒。該復(fù)合納 米顆粒呈纖維狀，長度為100?200nm，直徑為10?20nm。
[0016] 本發(fā)明所述的自組裝多肽的序列如SEQ ID No. 1所示。所述的含有凋亡素基因的 質(zhì)粒為pcDNA3-/^-a/7〇/7ii/?質(zhì)粒，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。
[0017] 本發(fā)明所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒的制備方法，包括如下步 驟： (1) 根據(jù)序列SEQ No. 1，合成自組裝多肽； (2) 構(gòu)建pcDNA3-/^-a/7〇/?ii/7質(zhì)粒：以pcDNA3為載體，設(shè)計(jì)、定制合成引 物，以 pcDNA3-a/7〇/?ii/7 為模板，擴(kuò)增 目的基因片段，構(gòu)建 pcDNA3-/^-a/7〇/7ii/? 質(zhì)粒;引物序列如下： 上游引物（下劃線為漢3? HI酶切位點(diǎn)）：

【權(quán)利要求】
1. 一種自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒，其特征在于以所述的自組裝多肽作為 載體，通過自身的酸性氨基酸和堿性氨基酸所帶的電荷與攜帶凋亡素基因的質(zhì)粒分子之間 形成離子鍵結(jié)合，質(zhì)粒分子牢固粘附于自組裝多肽表面，形成復(fù)合納米顆粒。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒，其特征在于所述復(fù) 合納米顆粒呈纖維狀，長度為100?200nm，直徑為10?20nm。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒，其特征在于所述自 組裝多肽的序列如SEQ ID No. 1所示。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒，其特征在于所述的 攜帶凋亡素基因的質(zhì)粒為pcDNA3-/^-a/7〇/7ii/?質(zhì)粒。
5. -種權(quán)利要求1?4任一所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒的制備方 法，其特征在于包括如下步驟 ： (1) 合成自組裝多肽； (2) 構(gòu)建含凋亡素基因的質(zhì)粒； (3) 配制自組裝多肽溶液； (4) 在多肽溶液中加入步驟（2)構(gòu)建的質(zhì)粒溶液，充分作用后得到納米顆粒懸濁液； (5) 納米顆粒檢測。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征 在于步驟（3)所述的自組裝多肽溶液的質(zhì)量濃度為5. 26 mg/mL，配制的具體過程為：超凈 工作臺(tái)內(nèi)操作，將白色粉末狀多肽溶解于無菌PBS緩沖溶液，然后置于冰水浴中，并使用超 聲波助溶，超聲波功率為4 W/mL，每次工作3 s，停止5 s，助溶總持續(xù)時(shí)間為20 min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征 在于步驟（4)所述的質(zhì)粒溶液的質(zhì)量濃度為2 μ g/μ L，質(zhì)粒與自組裝多肽的質(zhì)量比為1 : 45 ?1 :55。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征 在于步驟（4)所述的充分作用為在向多肽溶液中加入質(zhì)粒后，蓋緊蓋子，顛倒混勻，混勻后 蓋口和蓋子再用封口膠密封，置搖床150 r/min，12h。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒的制備方法，其特征 在于步驟（5)所述的納米顆粒檢測的方法為瓊脂糖凝膠電泳檢測和/或透射電子顯微鏡檢 測。
10. -種權(quán)利要求1?4任一所述的自組裝多肽一凋亡素基因復(fù)合納米顆粒在抗腫瘤 治療中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK104288776SQ201410303298
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年6月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月30日
【發(fā)明者】狄勇, 彭傳梅 申請人:昆明醫(yī)科大學(xué)