一種具有增強免疫調節(jié)作用的類球紅細菌納米粉及其制備方法
【專利摘要】一種具有增強免疫調節(jié)作用的類球紅細菌納米粉及其制備方法，屬于類球紅細菌【技術領域】。本發(fā)明用蘋果酸鈉、葡萄糖、硫酸銨和酵母浸粉為主要原料，生產具有增強免疫調節(jié)作用的納米粉的方法，采用的菌株是一株具有增強免疫調節(jié)作用的類球紅細菌(Rhodobacter?Sphaeroides)。本發(fā)明將類球紅細菌制備為納米粉，經(jīng)動物實驗表明該納米粉具有增強免疫調節(jié)作用。由于其尺寸上的微觀性，納米材料具有與傳統(tǒng)材料不同的表面效應、小尺寸效應、量子尺寸效應及宏觀量子隧道效應，因此類球紅細菌納米粉便于實驗動物和人體所吸收利用。采用高能納米沖擊磨制備納米粉容易實現(xiàn)擴大生產和產業(yè)化，將其開發(fā)為功能(保健)食品有利于人體健康。
【專利說明】-種具有增強免疫調節(jié)作用的類球紅細菌納米粉及其制備 方法

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于類球紅細菌【技術領域】，尤其涉及一種具有增強免疫調節(jié)作用的類球紅 細菌納米粉及其制備方法。

【背景技術】
[0002] 當前在國外，光合細菌已在保健食品中應用，在國內光合細菌沼澤紅假單胞菌已 獲準用于飼料添加劑?？梢姽夂霞毦诒＝∈称泛退幤分械膽靡丫哂幸欢ɑA[方 立超，魏泓，鄭峻松.8株光合細菌的鑒定及其系統(tǒng)進化關系分析[J].中國微生態(tài)學 雜志，2010,22 (5) :439-443.和 Deming Chen，Yonbin Han，Zhenxin Gu. Application of statistical methodology to the optimization of fermentative medium for carotenoids production by Rhodobacter sphaeroides. Process Biochemistry, 2006, 41 :1773 - 1778] 〇
[0003] 類球紅細菌（Rhodobacter Sphaeroides)是一種光合細菌，屬于細菌域中紫色 細菌群的α亞群，具有廣泛的代謝方式，可以在多種條件下生長。大量研究文獻表明，類 球紅細菌己經(jīng)成為一種極大工業(yè)化開發(fā)潛力的微生物【李袓明，馮斯雯，季越，等.類 球紅細菌3757產輔酶Q10和S0D的提取與穩(wěn)定性研究[J].食品科技，2013, 38(4) :2-6 和 Italiano F，D'amici G M，Rinalducci S, et al.The photosynthetic membrane proteome of Rhodobacter sphaeroides R-26· lexposed to cobalt[J]· Research in Microbiology，2011， 162:520-527.和 Callister S J，Nicora C D，Zeng X H，et al.Comparison of aerobic and photosynthetic Rhodobacter sphaeroides 2.4. lproteomes[J]· Journal of Microbiological Methods，2006,67:424_436.】類 球紅細菌保健食品具有調節(jié)免疫、調節(jié)血糖等多種保健功能，曾獲衛(wèi)生部保健食品 批文，進行了生產，投放市場，獲得了較好的經(jīng)濟和社會效益。經(jīng)動物實驗證明類球 紅細菌有增強免疫力等功能，且對動物無不良影響。己有文獻報道，類球紅細菌可 發(fā)酵產生類胡蘿卜素【Kuo-Hsun Chiu, Wen-Sheng Liu. Dietary administration of the extract of Rhodobacter sphaeroides WL-APD911enhances the growth performance and innate immune responses of seawater red tilapia(Oreochromis mossambicusXOreochromis niloticus) [J]. Aquaculture, 2014, 418-419:32-38. Zhenxin Gu, Deming Chen, Yongbin Han, et al. Optimization of carotenoids extraction from Rhodobacter sphaeroides[J]. LWT, 2008, 41:1082-1088. Vladimir Z. Paschenko,Vladimir V.Gorokhov, Boris N. Korvatovskiy, et al.The rate of Qx 一 Qy relaxation in bacteriochlorophylIs of reaction centers from Rhodobacter sphaeroides determined by kinetics of the ultrafast carotenoid bandshift[J]. Biochimica et Biophysica Acta,2012,1817:1399-1406. Wentung Wu, Wensheng Liu. Anti-inflammatory property of biomaterial carotenoids production by Rhodobacter sphaeroides WL-APD911[J]· Advanced Materials Research, 2〇11，287_29〇:2〇28-2〇 31】。類胡蘿卜素是 光合細菌的第二大光合色素系統(tǒng)，且由于光合細菌便于大量培養(yǎng)，色素易于提取，這使光合 細菌成為非常有前途的天然類胡蘿卜素供體【周佳，郭秒，黃遵錫· 一株高產類胡蘿卜素 光合細菌Z1的研究[J].中國食品添加劑，2003, 6 (6):46-49, 118】。
[0004]輔酶Q10是一種脂溶性的類維生素物質，廣泛存在于生物體細胞的線粒體上，主 要結合在線粒體內膜上，構成呼吸鏈中的重要遞氫體，具有清除自由基、維持細胞膜的通透 性和提高機體自身免疫力的功能，在臨床醫(yī)藥、營養(yǎng)保健品及化妝品等方面具有廣闊的應 用0U景【李力，林丹楓，黃建忠·基因改造 Rhodobacter sphaeroides提高輔酶Q10的產 量·微生物學通報，2013, 40 (4): 593-602;李祖明，常平，高麗萍，惠博棣，白志輝·酶法 輔助超聲波法提取類球紅細菌輔酶Q10條件優(yōu)化·微生物學雜志，2014, 34(1) :47-52】。由 于輔酶Q10對人類健康的益處而受到保健品和藥品行業(yè)的廣泛重視，市場的需求巨大。它 的生產方法有動植物組織提取法、化學合成法和微生物發(fā)酵法，其中微生物發(fā)酵法因具有 來源廣泛、產物活性好和產量高等優(yōu)點而成為輔酶Q10的主要生產方法。產輔酶Q 10的微生 物種類較多，其中屬于光合細菌的類球紅細菌由于輔酶Q10含量較高，提取步驟相對簡單， 是目前工業(yè)化大規(guī)模生產的重要菌種[楊威，柯崇榕，邵慶偉，朱勇峰，黃建忠·類球紅 細菌產輔酶Q10發(fā)酵工藝的優(yōu)化·食品與發(fā)酵工業(yè)，2013, 39 (2) : 75-79]。
[0005] 類胡蘿卜素是一類C40類萜化合物及其衍生物的總稱，由8個類異戊二烯單位組 成，呈黃色、橙紅色或紅色的色素。類胡蘿卜素可分為40碳的碳氫化合物（胡蘿卜素）和 它們的氧化衍生物（葉黃素）兩大類色素。自然界中發(fā)現(xiàn)的類胡蘿卜素種類繁多，大約有 600多種。類胡蘿卜素是最重要的天然色素之一，廣泛分布于植物、動物、微生物中。既是一 種常用的著色劑，又具有多種生物活性。它是生物體必不可少的組成成分。類胡蘿卜素的 結構給予其非常特殊和卓越的性能，類胡蘿卜素是維生素 A原，具清除自由基、抗氧化、增 強免疫力、防癌等多種功能，作為著色劑和功能成分廣泛應用于食品、醫(yī)藥和化妝品等。 [000 6] 納米技術（nanotechnology)是在8〇年代末誕生并正在蓬勃發(fā)展的一種高新科 技，是用單個原子、分子制造物質的科學技術，研究結構尺寸在〇· 1至100納米范圍內材料 的性質和應用。納米技術具備促進食品傳統(tǒng)工業(yè)快速發(fā)展的巨大潛力，它可以幫助人類在 納米尺度范圍內認識和改造自然，即在生產過程中直接操縱原子、分子的排布，從而制造 出具有特定功能的新產品。由于其尺寸上的微觀性，納米材料具有與傳統(tǒng)材料不同的表面 效應、小尺寸效應、量子尺寸效應及宏觀量子隧道效應，被廣泛應用于原料化工、食品、農 業(yè)、紡織、電子電器、機械、醫(yī)學等眾多領域。納米技術已經(jīng)迅速發(fā)展成為21世紀三大支柱 科學領域之一，納米技術必將引發(fā)一場新的工業(yè)革命。
[0007] 有關將納米技術應用于類球紅細菌納米粉的制備方面的文獻未見報道。本專利首 次報道將類球紅細菌制備為納米粉，并介紹其制備方法；同時經(jīng)動物實驗表明該納米粉具 有增強免疫調節(jié)作用，為后續(xù)將該納米粉研究開發(fā)為功能保健食品奠定堅實的基礎。本人 正從事食品科學與工程學科的教學科研工作，該專利圍繞該學科開展研究開發(fā)工作，有利 于學科專業(yè)建設。


【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的目的是提供一種具有增強免疫調節(jié)作用的類球紅細菌納米粉及其制備 方法。
[0009] -種具有増強免疫調節(jié)作用的類球紅細菌納米粉的制備方法，其特征在于，包括 以下步驟：（1)類球紅細菌菌種活化
[0010]配制固體培養(yǎng)基（質量百分含量，以下同）：葡萄糖1-5%，胰蛋白胨0. 5-5%, 酵母浸粉〇· 5-5%，氯化鈉〇· 5-2%，瓊脂2%, PH = 7-9 ;并將其與培養(yǎng)皿置于121 °C高壓 蒸汽滅菌15-30min ;然后無菌條件下，倒平板，挑類球紅細菌進行平板劃線；將平板置于 28-37°C 培養(yǎng)，2-7d ;
[0011] 配置斜面培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基與上述固體培養(yǎng)基一樣，并于12TC高壓蒸汽滅菌 l5_30min ;無菌條件下，挑取上述平板上的類球紅細菌單菌落進行斜面接種；然后將斜面 置于 28-371：培養(yǎng)，2-7d;
[0012] (2)類球紅細菌發(fā)酵
[0013] ①種子培養(yǎng)：
[0014]種子培養(yǎng)基液體：葡萄糖1-5%，胰蛋白胨0.5-5%，酵母浸粉0.5-5%，氯化鈉 0· 5-2%，pH = 7-8 ;并于 121?高壓蒸汽滅菌 15-30min ;
[0015]用無菌接種環(huán)從步驟（1)活化后的類球紅細菌斜面中取菌體一環(huán)，接種到盛 有（優(yōu)選250mL三角瓶中含有2〇mL種子培養(yǎng)基液體）種子培養(yǎng)基液體的三角瓶中，于 28_37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到液體種子；
[0016]然后無菌條件下，將得到的液體種子按5-10%的接種量接種于滅菌的種子培養(yǎng)基 中，于28_37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h,得到活化的液體種子；
[0017] ②發(fā)酵：
[0018]液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蘋果酸鈉0.4-5%,葡萄糖1-1〇%，硫酸銨0.5-5%，酵母 浸粉0. 5-5%，磷酸氫二鉀〇. 05-0. 15 %，磷酸二氫鉀〇. 03-0. 10%，pH = 7-8,生長因 子溶液〇_5-2%，并于121<€高壓蒸汽滅菌15-3〇1^11，其中生長因子溶液配方 ：維生素 B10. 05-0· 2%，煙酰胺（VPP)0_ 〇5_0. 2%，生物素0. 001-〇. 〇〇2%，生長因子過濾除菌； [0019]按照5_10%的接種量將①搖床活化的液體種子接種到盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三 角瓶中，于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)24-48h，得類球紅細菌發(fā)酵液；
[0020] (3)類球紅細菌離心分離
[0021] 取步驟（2)類球紅細菌發(fā)酵液于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，棄上清， 再用蒸餾水清洗菌體1-3次，分別于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，即得類球紅細 菌濕菌體；
[0022] (4)制備類球紅細菌納米粉
[0023] 將類球紅細菌濕菌體在-40--60°c，壓力小于lpa的條件下冷凍干燥得干菌體， 將干菌體放入高能納米沖擊磨罐中，于1-8°C下震磨6-10h，將干菌體磨成納米粉。
[0024] 本發(fā)明的類球紅細菌納米粉作為增強免疫調節(jié)作用的物質。
[0025]本發(fā)明一般采用常規(guī)的類球紅細菌均可。
[0026] 本專利發(fā)明了一種用蘋果酸鈉、葡萄糖、硫酸銨和酵母浸粉為主要原料，生產具有 增強免疫調節(jié)作用的納米粉的方法，采用的菌株是一株具有增強免疫調節(jié)作用的類球紅細 菌（Rhodobacter Sphaeroides)。本發(fā)明首次報道將類球紅細菌制備為納米粉，經(jīng)本發(fā)明方 法，納米粉粒度87. S%在3〇0納米以下，經(jīng)動物實驗表明該納米粉具有增強免疫調節(jié)作用， 并介紹其制備方法。由于其尺寸上的微觀性，納米材料具有與傳統(tǒng)材料不同的表面效應、小 尺寸效應、量子尺寸效應及宏觀量子隧道效應，因此類球紅細菌納米粉便于實驗動物和人 體所吸收利用。采用高能納米沖擊磨制備納米粉容易實現(xiàn)擴大生產和產業(yè)化，將其開發(fā)為 功能（保?。┦称酚欣谌梭w健康。

【具體實施方式】
[0027] 下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。
[0028] 所用菌株為類球紅細菌（Rhodobacter sphaeroides) 3757菌株，效果更好；該菌 株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，編號CGMCC N0. 3757。
[0029] 實施例1
[0030] ①類球紅細菌菌種活化
[0031] 固體培養(yǎng)基：葡萄糖2%，胰蛋白胨1%，酵母浸粉1%,氯化鈉0. 5%，瓊脂2%，pH =8. 5,并于121?高壓蒸汽滅菌20min ;無菌條件下，倒平板，挑類球紅細菌進行平板劃線； 將平板置于37°C培養(yǎng)，3-5d ;配置斜面培養(yǎng)基（配方同固體培養(yǎng)基），并于121°C高壓蒸汽 滅菌20min ;無菌條件下，挑取平板上的類球紅細菌單菌落進行斜面接種；將斜面置于37°C 培養(yǎng)，3-5d。
[0032] ②類球紅細菌發(fā)酵
[0033] (1)種子培養(yǎng)基：
[0034] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，胰蛋白胨1 %，酵母浸粉1 %，氯化鈉0. 5%，pH = 7. 2,并 于121°C尚壓蒸汽滅菌20min ;
[0035]用無菌接種環(huán)從活化后的類球紅細菌斜面中取菌體適量，接種到盛有液體種子培 養(yǎng)基的三角瓶中（250mL三角瓶中裝20mL種子培養(yǎng)基液體），于32Γ，180r/min搖床振蕩培 養(yǎng)24h，得到液體種子；
[0036]然后將得到的液體種子按5%的接種量接種于高壓蒸汽滅菌的種子培養(yǎng)基中，于 32Γ，18〇r/min搖床振蕩培養(yǎng)24h，得到活化的液體種子。
[0037] (2)發(fā)酵：
[0038] 發(fā)酵培養(yǎng)基:蘋果酸鈉〇· 4 %，葡萄糖2 %，硫酸銨0. 7 %，酵母浸粉1 %，磷酸氫二 鉀0· 〇9%，磷酸二氫鉀〇· 06%，生長因子溶液1 %，pH = 7. 0,121 °C滅菌20min ;其中生長因 子溶液配方：維生素 Β10· 1%，煙酰胺（VPP)O. 1%，生物素〇.〇〇16%，生長因子過濾除菌；
[0039] 按照10%的接種量將搖瓶活化的液體種子接種到盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶 中，于32°C，180r/min搖床振蕩培養(yǎng)40h，得類球紅細菌發(fā)酵液。
[0040] ③類球紅細菌離心分離
[0041] 取步驟②類球紅細菌發(fā)酵液于lOOOOrpm離心20min，收集菌體，棄上清，再用蒸餾 水清洗菌體2次，于l〇〇〇〇rpm離心2〇min，收集菌體，即得類球紅細菌濕菌體；
[0042] ④制備類球紅細菌納米粉
[0043] 將類球紅細菌濕菌體在-50°C，壓力小于lpa的條件下冷凍干燥得干菌體，將千 菌體放入高能納米沖擊磨罐中，于1-8°C下震磨6-10h，將干菌體磨成納米粉。納米粉粒度 87. 8%在300納米以下。
[0044]類球紅細菌納米粉增強免疫調節(jié)作用的實驗
[0045] 由國家衛(wèi)生部批準的"北京聯(lián)合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心"實驗， 實驗依據(jù)是《保健食品檢驗與評價技術規(guī)范》（2003版）[衛(wèi)生部衛(wèi)生監(jiān)督司·保健食品檢 驗與評價技術規(guī)范（2003年版）北京，2003:23-35]。
[0046] 1.實驗材料
[0047] 1. 1 樣品：
[0048] 上述實施例1生產的類球紅細菌納米粉。小鼠推薦劑量：12g/kgBW。受試物用玉 米油配制，供試驗用。
[0049] 1. 2實驗動物：
[0050] 選用北京華阜康生物科技股份有限公司[許可證號：SCXK (京）2009-0007]繁殖 的18g?22g昆明種清潔級雌性小鼠96只，共分為四批進行實驗，每批隨機分為2組，每 組12只。實驗一批進行臟器/體重比值測定、遲發(fā)型變態(tài)反應實驗、半數(shù)溶血值（HC 5。）的 測定和抗體生成細胞數(shù)的測定；實驗二批進行碳廓清實驗；實驗三批進行小鼠腹腔巨噬細 胞吞噬雞紅細胞實驗；實驗四批進行ConA誘導的小鼠淋巴細胞轉化實驗和NK細胞活性測 定。實驗動物飼養(yǎng)于北京聯(lián)合大學應用文理學院保健食品功能檢測中心SPF級動物室。實 驗動物使用許可證號：SYXK (京）2012-0031?；A飼料由北京華阜康生物科技股份有限公 司[許可證號：SCXK (京）2009-0008]生產。
[0051] 1.3 劑量：
[0052] 類球紅細菌納米粉僅設一個劑量組（12g/kgBW),受試物配制方法：每0. 24g樣品 對應溶入〇· 4mL玉米油中，現(xiàn)用現(xiàn)配。每日一次經(jīng)口給予，連續(xù)灌胃36天后，測各項指標。 小鼠灌胃體積為〇· 2mL/10gBW。同時設一空白對照組（Og/kgBW)，用玉米油代替受試物，每 日灌胃體積與受試物組相同。各劑量組均給予基礎飼料。
[0053] 1. 5實驗方法：
[0054] 1. 5. 1類球紅細菌納米粉中輔酶Q10含量的測定
[0055] 按《保健食品中輔酶Q10的測定》（GB/T22252-2008)進行。
[0056] 1. 5. 2類球紅細菌納米粉中類胡蘿卜素含量的測定
[0057] 試樣的處理[保健食品中輔酶Q10的測定GB/T22252-2008]:
[0058] 稱取〇· lg類球紅細菌納米粉（精確至0. 001g)，置于l〇mL離心管中，加丙酮5mL， 用超聲波清洗機震蕩2〇min后，離心（10000rpm，20min)，后取上清液于紫外可見分光光度 計480nm波長處檢測。
[0059] 計算[Zhenxin Gu，Deming Chen, Yongbin Han，et al. Optimization of carotenoids extraction from Rhodobacter sphaeroides[J]. LWT, 2008, 41:1082-1088.
[0060] 和惠伯棣，李京.紅和黃瓤西瓜中類胡蘿卜素含量和組成比較[J].食品科學， 2008，
[0061] 29(12) :587-591]：
[0062]

【權利要求】
1. 一種具有增強免疫調節(jié)作用的類球紅細菌納米粉的制備方法，其特征在于，包括以 下步驟： (1) 類球紅細菌菌種活化 配制固體培養(yǎng)基（質量百分含量，以下同）：葡萄糖H%，胰蛋白胨〇. 5-5%，酵母浸 私0· 5 5 ,虱化納〇· 5-2 %，瓊脂2 %，pH = 7-9 ;并將其與培養(yǎng)皿置于121 °C 1?壓蒸汽滅 菌15-3〇min ;然后無菌條件下，倒平板，挑類球紅細菌進行平板劃線；將平板置于28_3rc 培養(yǎng)，2-7d ; 配置斜面培養(yǎng)基，斜面培養(yǎng)基與上述固體培養(yǎng)基一樣，并于12rc高壓蒸汽滅菌 15-30min ;無菌條件下，挑取上述平板上的類球紅細菌單菌落進行斜面接種；然后將斜面 置于 28-37°C 培養(yǎng)，2-7d; (2) 類球紅細菌發(fā)酵 ① 種子培養(yǎng)： 種子培養(yǎng)基液體：葡萄糖1-5 %，胰蛋白胨〇. 5-5 %，酵母浸粉0. 5-5 %，氯化鈉 0. 5-2%，pH = 7_8 ;并于 m-C高壓蒸汽滅菌 15-30min ; 用無菌接種環(huán)從步驟（1)活化后的類球紅細菌斜面中取菌體一環(huán)，接種到盛有（優(yōu) 選250mL三角瓶中含有2〇mL種子培養(yǎng)基液體）種子培養(yǎng)基液體的三角瓶中，于28-37Γ， 150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到液體種子； 然后無菌條件下，將得到的液體種子按5-10%的接種量接種于滅菌的種子培養(yǎng)基中， 于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)12-36h，得到活化的液體種子； ② 發(fā)酵： 液體發(fā)酵培養(yǎng)基：蘋果酸鈉0.4-5%，葡萄糖1-1〇%，硫酸銨0.5-5%，酵母浸 粉 0·5-5 %，磷酸氫二鉀 0·〇5_0· I5 %，磷酸二氫鉀 0.03-0. 10 %，pH = 7-8,生長因 子溶液0.5-2%，并于1211高壓蒸汽滅菌15-3〇11^11，其中生長因子溶液配方：維生素 BA 〇5_0· 2 %，煙酰胺（VPP) 0· 05-0· 2 %，生物素0. 001-0. 〇〇2 %，生長因子過濾除菌； 按照5-10%的接種量將①搖床活化的液體種子接種到盛有液體發(fā)酵培養(yǎng)基的三角瓶 中，于28-37°C，150-200r/min搖床振蕩培養(yǎng)24-48h，得類球紅細菌發(fā)酵液； (3) 類球紅細菌離心分離 取步驟（2)類球紅細菌發(fā)酵液于6000-20000rpm離心5-30tnin，收集菌體，棄上清，再用 蒸餾水清洗菌體1-3次，分別于6000-20000rpm離心5-30min，收集菌體，即得類球紅細菌濕 菌體； (4) 制備類球紅細菌納米粉 將類球紅細菌濕菌體在-40--60?，壓力小于lpa的條件下冷凍干燥得千菌體，將干 菌體放入高能納米沖擊磨罐中，于1-8°C下震磨6-10h，將干菌體磨成納米粉。
2. 按照權利要求1的方法制備得到的具有增強免疫調節(jié)作用的類球紅細菌納米粉。
3. 按照權利要求1的方法制備得到的具有增強免疫調節(jié)作用的類球紅細菌納米粉作 為增強免疫調作用的物品。
【文檔編號】A61P37/02GK104189016SQ201410247137
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年6月5日 優(yōu)先權日:2014年6月5日
【發(fā)明者】李祖明, 孔麗娜, 高麗萍, 惠博棣, 白志輝, 王棟, 楊衛(wèi)東 申請人:北京聯(lián)合大學