一種用于治療痤瘡的含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒，其特征在于由用可生物降解的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)制成的外殼及包裹在所述外殼中的包含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的內(nèi)核組成，其中所述抗菌肽占所述納米顆?？傊氐?-15重量％，所述細(xì)胞生長因子占所述納米顆?？傊氐?-4重量％。該納米顆粒直徑范圍為80-150納米，具有緩釋功能。內(nèi)含的抗菌肽可以殺死引起皮膚表面痤瘡形成的痤瘡丙酸桿菌，而細(xì)胞生長因子則有利于受損皮膚的修復(fù)再生。本發(fā)明所述的納米顆粒，可直接作用于皮膚，能持續(xù)殺死痤瘡丙酸桿菌及對受損皮膚進(jìn)行修復(fù)，從而有效減少痤瘡形成及因痤瘡而造成的皮膚疤痕。
【專利說明】—種用于治療痤瘡的含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用于皮膚修復(fù)的產(chǎn)品，具體而言，本發(fā)明涉及一種用于治療痤瘡的含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒。
【背景技術(shù)】
[0002]痤瘡俗稱“青春痘”、“肺風(fēng)粉刺”、“暗瘡”等，是一種常見的毛囊、皮脂腺慢性炎癥性疾病，通常好發(fā)于人面部、胸背部。在臨床上以白頭粉刺、黑頭粉刺、炎性丘疹、結(jié)節(jié)、囊腫等為主要表現(xiàn)。
[0003]痤瘡丙酸桿菌是引起人類痤瘡形成的最主要細(xì)菌，屬于典型革蘭氏陽性厭氧菌，一般寄居在皮膚的毛囊及皮脂腺中，通過消耗皮脂中的甘油三酯來生長繁殖。這種細(xì)菌代謝產(chǎn)生的脂肪酸會刺激皮膚并促進(jìn)皮脂腺過量分泌，從而使皮脂排泄不暢，最終導(dǎo)致炎癥性丘疹、粉刺和膿包的產(chǎn)生。此外，痤瘡丙酸桿菌還能分泌大量的蛋白酶、透明質(zhì)酸和一些趨化因子，誘導(dǎo)皮膚細(xì) 胞產(chǎn)生抗體及激活補(bǔ)體，進(jìn)而引起毛囊炎癥、皮膚破損以及形成疤痕。
[0004]痤瘡的治療方法有很多，其中抗生素治療是一種常用的方法。盡管抗生素已被證實(shí)在降低皮膚炎癥有效，但因其容易導(dǎo)致耐藥性細(xì)菌產(chǎn)生的問題現(xiàn)時受到廣泛質(zhì)疑，尤其是在低劑量長期治療上。此外，抗生素對減少皮膚過敏、損傷及疤痕形成作用不明顯。
[0005]抗菌肽是一類可由昆蟲、哺乳動物、植物甚至微生物體內(nèi)誘導(dǎo)產(chǎn)生的小分子多肽。作為機(jī)體的防御因子，抗菌肽具有殺死多種細(xì)菌和真菌、抑制部分病毒和寄生性原蟲以及選擇性誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用。與抗生素通過干擾代謝途徑或抑制核酸合成的殺菌機(jī)制不同，抗菌肽是通過干擾病菌細(xì)胞膜的穩(wěn)定性，使細(xì)胞內(nèi)容物外泄的方式殺死細(xì)菌。這種獨(dú)特的殺菌方式使病原微生物難以產(chǎn)生抗藥性。此外，抗微生物肽還具有無殘留毒性、不會產(chǎn)生抗原性等優(yōu)點(diǎn)，使其在臨床和日常應(yīng)用上具有優(yōu)越的應(yīng)用前景?，F(xiàn)時已有多種抗菌肽對痤瘡丙酸桿菌有顯著的抑殺作用，如果蠅來源的天蠶素(creCTopin)系列以及一些人工合成的多肽。
[0006]創(chuàng)傷愈合在臨床上經(jīng)常遇到的難題，因此，如何縮短治療時間、提高愈合質(zhì)量是目前臨床上亟待解決的課題。研究證實(shí)，細(xì)胞生長因子可通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化來修復(fù)各種皮膚損傷，改善傷口的愈合。與化學(xué)藥物相比，細(xì)胞生長因子，如酸性成纖維細(xì)胞生長因子、堿性成纖維細(xì)胞生長因子、表皮生長因子、角質(zhì)細(xì)胞生長因子、神經(jīng)細(xì)胞生長因子等都能通過對前膠原基因表達(dá)的下行調(diào)節(jié)作用，抑制成纖維細(xì)胞分泌膠原的合成及沉積，從而防止瘢痕疙瘩的產(chǎn)生，尤其是在燒傷創(chuàng)面和慢性難愈性傷口治療(如:褥瘡、慢性感染的傷口，糖尿病、營養(yǎng)缺乏癥、類固醇化病人的傷口，以及放射性傷口等)上，優(yōu)勢明顯。
[0007]人體皮膚表面是是一個巨大的微生態(tài)系統(tǒng)，成分復(fù)雜。在人體皮膚直接使用抗菌肽或者細(xì)胞生長因子，很容易因與外界環(huán)境(如酸堿度、蛋白酶等)直接接觸而導(dǎo)致快速失活，起不到抗菌和皮膚修復(fù)的作用。而反復(fù)使不但成本高，且容易出現(xiàn)皮膚過敏、色素沉淀及影響皮膚表面正常菌群微生態(tài)等。[0008]近來的研究發(fā)現(xiàn)聚(D,L_乳酸-共-乙醇酸)(poly(lactic-co_glycolicacid),PLGA)由兩種單體一乳酸和羥基乙酸隨機(jī)聚合而成，是一種可降解的功能高分子有機(jī)化合物，具有良好的生物相容性、無毒、良好的成囊和成膜的性能，被廣泛應(yīng)用于制藥、醫(yī)用工程材料和現(xiàn)代化工業(yè)領(lǐng)域。在美國，PLGA通過FDA認(rèn)證，被正式作為藥用輔料收錄進(jìn)美國藥典。
[0009]本發(fā)明利用聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)制成外殼，在其中包裹包含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的內(nèi)核，并制成納米級顆粒，用于痤瘡治療和受損皮膚的修復(fù)。研究發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明制成的納米顆粒，對皮膚沒有刺激作用，能夠很好地沉積在痤瘡等皮膚損傷部位，隨著外殼的生物降解，可以實(shí)現(xiàn)納米顆粒內(nèi)包裹的藥物的緩慢釋放，在臨床應(yīng)用時能減少給藥次數(shù)以及對皮膚病變進(jìn)行持續(xù)改善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明公開一種含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒，其特征在由用可生物降解的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)制成的外殼和包裹在所述外殼中的包含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的內(nèi)核組成。其中，所述抗菌肽占所述納米顆?？傊氐?-15重量％，細(xì)胞生長因子占所述納米顆?？傊氐?-4重量％。優(yōu)選地,所述抗菌肽占所述納米顆?？傊氐?2.36重量％。所述細(xì)胞生長因子占所述納米顆?？傊氐?.1重量％。更優(yōu)選地，所述納米顆粒的內(nèi)核是包含抗菌肽與細(xì)胞生長因子的組合物，并且在所述組合物中，所述抗菌肽與細(xì)胞生長因子的質(zhì)量比率約為4: I。最優(yōu)選地，所述納米顆粒的內(nèi)核是基本上由質(zhì)量比率約為4:I的抗菌肽與細(xì)胞生長因子組成的組合物。
[0011]所述納米顆粒的直徑為80-150納米，優(yōu)選100納米。本發(fā)明的納米顆粒具有緩釋功能，且能防止活性成分抗菌肽及細(xì)胞生長因子的快速失活。內(nèi)含的抗菌肽可殺死皮膚表面的痤瘡丙酸桿菌，而細(xì)胞生長因子則有利于受損皮膚的修復(fù)再生。
[0012]在一個優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述內(nèi)核由抗菌肽和細(xì)胞生長因子組成。在進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案中，在所述內(nèi)核中，抗菌肽和細(xì)胞因子的質(zhì)量比率約為4: I。
[0013]本發(fā)明的上述目的通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn):
[0014]1.一種含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒，其特征在于由用可生物降解的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)制成的外殼和包裹在所述外殼中的包含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的內(nèi)核組成，其中所述抗菌肽占所述納米顆粒總重的8-15重量％，細(xì)胞生長因子占所述納米顆?？傊氐?-4重量％。
[0015]2.根據(jù)第I項(xiàng)所述的納米顆粒，其直徑范圍為80~150納米。
[0016]3.根據(jù)第2項(xiàng)所述的納米顆粒，所述納米顆粒的直徑為100納米。
[0017]4.根據(jù)第I項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述抗菌肽占所述納米顆?？傊氐?2.36重量％。
[0018]5.根據(jù)第I項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述細(xì)胞生長因子占所述納米顆?？傊氐?br> 3.1重量％。
[0019]6.根據(jù)第I項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述內(nèi)核是包含抗菌肽與細(xì)胞生長因子的組合物，并且 在所述組合物中，所述抗菌肽與細(xì)胞生長因子的質(zhì)量比率約為4: I。
[0020]7.根據(jù)第I項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述納米顆粒的內(nèi)核是基本上由質(zhì)量比率約為4:I的抗菌肽與細(xì)胞生長因子組成的組合物。
[0021] 8.根據(jù)第I項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述內(nèi)核中的抗菌肽為能夠殺死痤瘡丙酸桿菌的多肽，其選自天蠶素(crecropin，SEQ ID Nos.1-3)和SEQ ID Nos.9-11所示的人工合成多肽(ILWKRK、ILPWKWLWWLWKKKR、KWKLFRRIGAVLRVL)中的一種或多種。
[0022]9.根據(jù)第8項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述內(nèi)核中的抗菌肽為SEQ IDN0.10 (ILPffKffLffffLffKKKR)。
[0023]10.根據(jù)第I項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述內(nèi)核中的細(xì)胞生長因子是選自人源酸性成纖維細(xì)胞生長因子(SEQ ID N0.4)、人源堿性成纖維細(xì)胞生長因子(SEQ ID N0.5)、人源表皮生長因子(SEQ ID N0.6)、人源角質(zhì)細(xì)胞生長因子(SEQ ID N0.7)或人源神經(jīng)細(xì)胞生長因子(SEQ ID N0.8)中的任一種。
[0024]11.根據(jù)第10項(xiàng)所述的納米顆粒，其中所述內(nèi)核中的細(xì)胞生長因子是人源堿性成纖維細(xì)胞生長因子(SEQ ID N0.5)。
[0025]12.根據(jù)第I項(xiàng)所述的納米顆粒，其中在所述內(nèi)核中，所述抗菌肽為SEQ IDN0.10 (ILPWKWLWWLWKKKR)，并且所述細(xì)胞生長因子是人源堿性成纖維細(xì)胞生長因子(SEQID N0.5)。
[0026]13.一種制備權(quán)利要求1的含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒的方法，該方法包括以下步驟:
[0027]I).稱取2737毫克聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)溶解于100毫升乙酸乙酯中，振蕩成澄清溶液；
[0028]2).稱取40暈克抗菌肽固體和10暈克細(xì)胞生長因子固體；
[0029]3).取10毫升步驟I)中所述溶液中加入200微升Tween-100溶液，超聲混勻；
[0030]4).將步驟2)中稱取好的抗菌肽和細(xì)胞生長因子溶于步驟3)中所述溶液中，攪拌混勻；
[0031]5).將步驟4)中制備的溶液用蠕動泵以霧化方式加入到含聚乙烯醇4-88的水溶液中，室溫攪拌過夜；
[0032]6).收集步驟5)中所述的溶液，高速離心并收集沉淀,棄去上清液；
[0033]7).用去離子水重懸步驟6)收集的沉淀，然后凍干，得到含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒。
[0034]其中，天蠶素(crecropin)主要包括一些果蜆來源的多肽,例如，SEQ ID Nos.1-3的多肽。在本發(fā)明具體的實(shí)施方案中，SEQ ID Nos.1-3的多肽可以由吉爾生化(上海)有限公司化學(xué)合成，純度大于98%。人源的細(xì)胞因子SEQ ID Nos.5-8可商購獲得，例如，購自Peprotech, U.S.A.等。
[0035]更具體地，除了化學(xué)合成或商業(yè)購買途徑之外，用于制成本發(fā)明所述的內(nèi)核抗菌肽或者細(xì)胞生長因子可以通過基因工程技術(shù)表達(dá)、分離純化得到(參見SambiOOk et al.，Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor, NY,1989)。
[0036]優(yōu)選地，本發(fā)明還公開一種含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒的制備方法，該方法包括以下步驟:
[0037]I).稱取2737毫克聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)溶解于100毫升乙酸乙酯中，振蕩成澄清溶液；
[0038]2).稱取40暈克抗菌肽固體和10暈克細(xì)胞生長因子固體；
[0039]3).取10毫升步驟I)中所述溶液中加入200微升Tween-100溶液，超聲混勻；
[0040]4).將步驟2)中稱取好的抗菌肽和細(xì)胞生長因子溶于步驟3)中所述溶液中，攪拌混勻；
[0041]5).將步驟4)中制備的溶液用蠕動泵以霧化方式加入到含聚乙烯醇4-88的水溶液中，室溫攪拌過夜；
[0042]6).收集步驟5)中所述的溶液，高速離心并收集沉淀,棄去上清液；
[0043]7).用去離子水重懸步驟6)收集的沉淀，然后凍干，得到含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒。
[0044]聚(D，L_乳酸-共-乙醇酸)易溶于乙酸乙酯溶液，然后在2%聚乙烯醇4-88溶液中發(fā)生聚合，自發(fā)形成中空囊泡狀納米顆粒(見圖2的電鏡圖片)，并在形成囊泡過程中包裹水溶液藥物。
[0045]在這個納米顆粒制備過程中(詳見實(shí)施例1)，其制備溶液含有少量的水、乙酸乙酯，吐溫-100等雜質(zhì)。本發(fā)明人將溶液放于離心管中，14°C，60000xg，離心I小時，收集納米顆粒并棄去上清液。加入100毫升滅菌去離子水，重懸納米顆粒，然后，以14°C，60000xg，離心I小時的方法，洗滌顆粒2次，以去除吐溫-100、聚乙烯醇4-88以及大部分水和乙酸乙酯。
[0046]由于乙酸乙酯具揮發(fā)性、而固體水分在凍干過程中也可以通過升華方式去除，因此，本發(fā)明人利用凍干的方法，除去剩余雜質(zhì)。從這一角度上，也可以說，本發(fā)明的納米顆粒的內(nèi)核是基本上由抗菌肽和細(xì)胞生長因子組成的組合物，并且在所述組合物中，所述抗菌肽與細(xì)胞生長因子的質(zhì)量比率約為4: I。因此，成品納米顆粒只含有聚(D，L_乳酸-共-乙醇酸)形成的囊泡和由抗菌肽與細(xì)胞生長因子組成的內(nèi)核(正常情況下，凍干品會含有0.5-3%的水分)。
[0047]本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，上述制備方法中各成分的用量并不限于所示的量，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以進(jìn)行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整，例如，成比例的增加或減少用量，這些變化均包含在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
[0048]本發(fā)明制備的含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒還可以用于制備祛痘化妝品制劑方:通過將上述的納米顆粒與本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的藥物載體或賦形劑組合，按照祛痘化妝品領(lǐng)域的常規(guī)方法制成適于外用的霜劑、乳化劑或者水劑等劑型。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0049]圖1.為本發(fā)明所述的納米顆粒的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0050]圖2.為本發(fā)明所述的納米顆粒的電鏡示意圖；
[0051]圖3.為本申請所述納米顆粒促成纖維細(xì)胞增殖的示意圖(*表示P < 0.05 ;***表示 P < 0.001)；
[0052]圖4.為本申請所述納米顆粒抑制痤瘡桿菌生長的示意圖。
[0053]序列表說明
[0054] SEQ ID N0.1:黑腹果蠅天蠶素A氨基酸序列(N端-C端，共63個氨基酸，參見AAF57025 ; 可由吉爾生化(上海)有限公司化學(xué)合成，純度大于98% )；
[0055]SEQ ID N0.2:黑腹果蠅天蠶素B氨基酸序列(N端-C端，共63個氨基酸，參見AAF57027 ;可由吉爾生化(上海)有限公司化學(xué)合成，純度大于98% )；
[0056]SEQ ID N0.3:黑腹果蠅天蠶素C氨基酸序列(N端-C端，共63個氨基酸，參見AAF57028 ;可由吉爾生化(上海)有限公司化學(xué)合成，純度大于98% )；
[0057]SEQ ID N0.4:人源酸性成纖維細(xì)胞生長因子(N端-C端，共154個氨基酸，參見AAB29057 ;可購自 Peprotech, U.S.A.，貨號:100-17A)；
[0058]SEQ IDN0.5:人源堿性成纖維細(xì)胞生長因子(N端-C端，共155個氨基酸，參見AAA52448，可購自 Peprotech, U.S.A.，貨號:100-18B)；
[0059]SEQ ID N0.6:人源表皮生長因子(N端-C端，共53個氨基酸，參見AAS83395 ;可購自 Peprotech, U.S.A.，貨號:AF-100-15)
[0060]SEQ ID N0.7:人源角質(zhì)細(xì)胞生長因子(N端-C端，共194個氨基酸，參見AAB21431 ;可購自 Peprotech, U.S.A.，貨號:AF-100-19)；
[0061]SEQ ID N0.8:人源神經(jīng)細(xì)胞生長因子(N端-C端，共168個氨基酸，參見AAA35961 ;可購自 Peprotech, U.S.A.，貨號:AF-450-01)；
[0062]SEQ IDN0.9:1LWKRK (人工合成的抗菌肽);
[0063]SEQ IDN0.10:1LPWKWLffffLWKKKR (人工合成的抗菌肽)；
[0064]SEQ ID N0.11:KWKLFRRIGAVLRVL (人工合成的抗菌肽)。
【具體實(shí)施方式】:
[0065]以下通過實(shí)施例來進(jìn)一步闡明本發(fā)明。但是應(yīng)該理解，所述實(shí)施例只是舉例說明的目的，并不意欲限制本發(fā)明的范圍和精神。
[0066]需要說明的是，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，下述實(shí)施例中所用的試劑、酶類等除特別說明外，均為可從試劑公司商購的分析純級別的試劑或酶類。
[0067]實(shí)施例1.含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒的制備
[0068]稱取2737毫克的聚(D,L-乳酸-共-乙醇酸)(poly(lactic-co-glycolic acid),PLGA, Iactide: glycolide(50: 50)，購自 Sigma，U.S.A.，貨號 Ρ2191)并溶于 100 毫升乙酸乙酯中(購自Sigma，U.S.A.，貨號437549，)，并命名為EA溶液。取10毫升EA溶液，加入200微升吐溫80 (Tween-80,購自Sigma, U.S.A.，貨號T2575)，振蕩混勻，并命名為SBE溶液。
[0069]分別稱取40毫克抗菌肽ILPWKWLffffLWKKKR(SEQ ID N0.10，序列為從氨基端(N端)到羧基端(C端)的氨基酸順序，由吉爾生化(上海)有限公司化學(xué)合成，純度大于98% )和10毫克人源堿性成纖維細(xì)胞生長因子(序列為SEQ ID N0.5，購自P印rotech，U.S.A.，貨號:100-18B)，加入到上述的SBE溶液中，水浴超聲(型號:VCX500，Sonics，U.S.A.)至溶液變澄清后，再全部轉(zhuǎn)移到剩余的EA溶液中，渦旋振蕩30秒混勻并靜置2分鐘。
[0070]制備20毫升2%聚乙烯醇4-88溶液(購自Merck，Germany，貨號141350)，然后，用蠕動泵(Millipore，U.S.A.，型號:xx8200230)及超聲波破碎儀(Sonics，U.S.A.，型號:VCX500)將含有抗菌肽和細(xì)胞生長因子的EA溶液以霧化方式均勻加入2%的聚乙烯醇4-88溶液中，(流速:1毫升/分鐘，超聲能量:133瓦)，攪拌混勻后，再加入30毫升去離子水，室溫攪拌12-14小時。
[0071]將溶液至于離心管(Corning,U.S.A.，貨號:430828)中，14°C，60000xg，離心 I小時，收集納米顆粒并棄去上清液。加入100毫升滅菌去離子水，重懸納米顆粒，然后，以14°C，60000xg，離心I小時的方法，洗滌顆粒2次，以去除吐溫-100、聚乙烯醇4-88以及大部分水和乙酸乙酯。最后，用40毫升滅菌去離子水重懸納米顆粒，并置于凍干機(jī)中，-50°C真空凍干18-24小時，即得到含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒，其外殼由聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)形成。通過電鏡檢測，其顆粒直徑在87納米左右。
[0072]實(shí)施例2.細(xì)胞增殖活性的測定
[0073]米用噻唑藍(lán)(3_(4,5-Dimethylthiazol_2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide, MTT，購自sigma，U.S.A.，貨號:M2128)染色法測定納米顆粒中細(xì)胞生長因子對NIH/3T3成纖維細(xì)胞(購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC，目錄號:CRL_1658)的促增殖活性。用含10%胎牛血清的F-12K(Ham' s)培養(yǎng)基(購自Panreac AppliChem,Germany,貨號:A1297)培養(yǎng)NIH-3T3成纖維細(xì)胞至對數(shù)生長期，然后用0.25% (w/v)的胰蛋白酶(購自Life Technologies, U.S.A.，貨號:R-001_100)溶液消化并計數(shù)，按每孔7000個細(xì)胞加入到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(Corning，U.S.A.，貨號:3300)中，于37°C，5%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng)24小時后，換入含2%血清的新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)16小時。用培養(yǎng)基對實(shí)施例1中制備的納米顆粒樣品按倍比方法進(jìn)行系列稀釋，使其作用終濃度為0.05毫克/毫升(低劑量)、0.1毫克/毫升(中劑量)以及0.33毫克/毫升(高劑量)，然后加入到細(xì)胞培養(yǎng)板中(100微升/孔)培養(yǎng)48小時。以30納克/毫升的堿性成纖維細(xì)胞生長因子以及3暈克/毫升的不含細(xì)胞生長因子及抗菌肽的納米顆粒分別作為陽性和陰性對照。培養(yǎng)結(jié)束后，加入20微升MTT (5毫克/毫升)溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。棄上清，加入二甲基亞砜(DMS0，購自Sigma，U.S.A.，貨號:D8418) 100微升，室溫放置30分鐘后，用酶聯(lián)免疫比色儀(Bio-tek, U.S.A.，型號:ELX800)測定其吸光度，測定波長為570nm，對照波長為630nm。結(jié)果顯示，終濃度為0.1毫克/毫升的實(shí)施例1制備的納米顆粒即具有顯著的促成纖維細(xì)胞增殖能力(圖3)。
[0074]實(shí)施例3.抑菌活性的測定
[0075]稱取適量的實(shí)施例1制備的納米顆粒，用水溶解，制備成終濃度為I毫克/毫升、2暈克/毫升以及6暈克/毫升的工作溶液。取100毫升細(xì)菌液體培養(yǎng)基(蛋白胨10克/升，酵母提取物5克/升，氯化鈉10克/升，pH7.0)高溫滅菌后，冷卻至45°C，加入100微升(約3xl05個克隆)過夜培養(yǎng)的痤瘡丙酸桿菌(Propionibacterium acnes,購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心ATCC，貨號=ATCC-11827)，輕輕搖勻后接種到6孔板中(500微升/孔)。然后，每孔加入500微升納米顆粒工作液，混勻，37°C恒溫培養(yǎng)24小時，每2小時取樣，酶聯(lián)免疫比色儀(Bio-tek, U.S.A.，型號:ELX800)測量密度值(測量波長600nm)。以100微克/毫升的合成抗菌肽ILPWKWLffffLWKKKR以及3毫克/毫升的不含細(xì)胞生長因子及抗菌肽的納米顆粒分別作為陽性和陰性對照。結(jié)果顯示，終濃度為I毫克/毫升的實(shí)施例1制備的納米顆粒能完全抑制痤瘡桿菌的生長，與陽性組沒有顯著差異(圖4)。
[0076] 應(yīng)該理解，盡管參考其示例性的實(shí)施方案，已經(jīng)對本發(fā)明進(jìn)行具體地顯示和描述，但是本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)該理解，在不背離由后附的權(quán)利要求所定義的本發(fā)明的精神和范圍的條件下，可以在其中進(jìn)行各種形式和細(xì)節(jié)的變化，可以進(jìn)行各種實(shí)施方案的任意組合。[0077]等同實(shí)施方案:本發(fā)明可以體現(xiàn)為其他具體的但不偏離其精神或基本特征的形式，因此認(rèn)為前述實(shí)施方案是在所有方面說明而不是限制本文所描述的發(fā)明。因此，本發(fā)明的范圍包括在權(quán)利說 明書等同目的和范圍內(nèi)的所有修改和組合。
【權(quán)利要求】
1.一種含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的納米顆粒，其特征在于由用可生物降解的聚(D，L-乳酸-共-乙醇酸)制成的外殼和包裹在所述外殼中的包含抗菌肽和細(xì)胞生長因子的內(nèi)核組成，其中所述抗菌肽占所述納米顆粒總重的8-15重量％，細(xì)胞生長因子占所述納米顆?？傊氐?-4重量％。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于:所述納米顆粒的直徑范圍為80-150納米。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的納米顆粒，所述納米顆粒的直徑為100納米。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中所述抗菌肽占所述納米顆粒總重的12.36重量％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中所述細(xì)胞生長因子占所述納米顆?？傊氐?.1重量％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其中所述內(nèi)核是包含抗菌肽與細(xì)胞生長因子的組合物，并且在所述組合物中，所述抗菌肽與細(xì)胞生長因子的質(zhì)量比率約為4: 1。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于:所述內(nèi)核中的抗菌肽為能夠殺死痤瘡丙酸桿菌的多肽，其選自SEQ ID Nos.1-3所示的天蠶素和SEQ ID Nos.9_11所示的人工合成多肽中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的納米顆粒，其中所述內(nèi)核中的抗菌肽為SEQID N0.10。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的納米顆粒，其特征在于:所述內(nèi)核中的細(xì)胞生長因子是選自人源酸性成纖維細(xì)胞生長因子、人源堿性成纖維細(xì)胞生長因子、人源表皮生長因子、人源角質(zhì)細(xì)胞生長因子或人源神經(jīng)細(xì)胞生長因子中的任一種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的納米顆粒，其中所述內(nèi)核中的細(xì)胞生長因子是人源堿性成纖維細(xì)胞生長因子。
【文檔編號】A61P17/00GK103933553SQ201410201096
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月13日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月29日
【發(fā)明者】王宏, 楊海濤, 劉斌, 伍建軍, 張紹偉, 高社 申請人:廣州柏縱生物科技有限公司