抑制Aβ及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子及制備和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于納米藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種抑制Aβ及金屬離子誘導(dǎo)Aβ聚集的納米粒子及其制備方法和應(yīng)用。該納米粒子為Y修飾的納米釕和/或硒粒子，Y為精氨酸、組氨酸、葡萄糖、蔗糖、維生素C和沒食子酸中的至少一種。本發(fā)明制備的Y修飾納米粒子包括了納米釕、納米硒、復(fù)合納米硒/釕，該納米粒子不僅能抑制Aβ的自發(fā)聚集，而且具有抑制金屬離子所誘導(dǎo)Aβ多肽聚集的作用，可應(yīng)用于制備抗阿爾茲海默綜合癥藥物中。本發(fā)明制備的維生素C和沒食子酸修飾的納米粒子是直接以維生素C和沒食子酸為還原劑與修飾劑，制備過程無需添加其它輔助試劑、產(chǎn)物體系簡(jiǎn)單，操作簡(jiǎn)單，方法簡(jiǎn)易，產(chǎn)品可直接保存和使用。
【專利說明】抑制Αβ及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子及制備和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于納米藥物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種抑制Αβ及金屬離子誘導(dǎo)Αβ聚集的納米粒子及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]阿爾茨海默病(AD)是一種以記憶和認(rèn)知功能障礙為主要特征的進(jìn)行性神經(jīng)變性疾病，亦稱老年癡呆癥。AD多發(fā)于老年群體，60歲以上人群中AD的患病率約為5~10%，而在85歲以上人群中AD的患病率急劇增加，高達(dá)40~50%。隨著人口的老齡化的加劇及缺乏有效的預(yù)測(cè)與治療的手段，AD患者數(shù)量一直在增加，預(yù)計(jì)到2050年全球AD患者數(shù)量將達(dá)到1.15億。AD患者的平均生存期僅為5.5年，該病已成為繼心臟病、癌癥、中風(fēng)之后，導(dǎo)致老年人死亡的第四大病因。臨床上根據(jù)AD癥狀所研發(fā)的治療AD的藥物帶來的效果總是喜憂參半，例如目前已進(jìn)入臨床應(yīng)用乙酰膽堿酯酶抑制劑及N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)，雖然這些藥物能適度減輕AD癥狀或減緩認(rèn)知能力的下降，但卻不能終止AD的病理進(jìn)程。因此，根據(jù)AD的發(fā)病機(jī)理研制新型的抗AD藥物具有重大意義。
[0003]AD患者的大腦所表現(xiàn)出的特征如大腦體積的縮小、海馬和新皮質(zhì)的神經(jīng)元和突觸減少、細(xì)胞外出現(xiàn)淀粉樣蛋白β (Αβ )聚集形成的老年斑及細(xì)胞內(nèi)磷酸化Tau蛋白形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)。其中，Αβ聚集形成的淀粉樣斑塊是一個(gè)行之有效的AD神經(jīng)病理學(xué)標(biāo)志。目前的淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)假說認(rèn)為在正常人體體內(nèi)，Αβ的產(chǎn)生和清除存在一個(gè)平衡，而在AD患者體內(nèi)，這一平衡被打破導(dǎo)致A β沉積的形成。A β是由36~43個(gè)氨基酸組成的多肽，是APP經(jīng)過水解生成 的天然代謝產(chǎn)物。APP經(jīng)過α和Y分泌酶降解所產(chǎn)生的Αβ是可溶的，而經(jīng)過β和Y分泌酶降解所產(chǎn)生的A β 1-40/42是AD患者腦部A β聚集形成的老年斑的主要成分。A β 1-40的含量約占A β總量的90%，但是A β 1-42比A β 1-40更容易聚集且對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的毒性較大。Αβ聚集形成的老年斑在AD發(fā)生和發(fā)展中起關(guān)鍵作用，因此，降低A β多肽在AD患者腦部的沉積對(duì)治療AD具有非常重要的意義。
[0004]Αβ可自發(fā)聚集成多種形態(tài)的聚集體，一種是由2~6多肽聚集形成的可溶性寡聚體，這也是形成纖維前的中間形態(tài)，另一種便是形成β_折疊片層結(jié)構(gòu)的不可溶纖維，這是Αβ斑塊的主要形態(tài)。Αβ聚集形成纖維受多種因素影響，如金屬離子、pH值、Aβ多肽濃度及其他蛋白質(zhì)等。其中金屬離子是誘導(dǎo)Αβ聚集的重要因素之一。在AD患者腦部Αβ斑塊中部分金屬離子的濃度顯著增加。特別是，過渡金屬鋅、銅、鐵等不僅可誘導(dǎo)Αβ形成β折疊還同A β的神經(jīng)毒性相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)銅離子可與A β上的His結(jié)合，使其形成組氨酸橋，這種銅-A β復(fù)合物具有很強(qiáng)的神經(jīng)毒性。而另一方面，具有氧化還原性的銅離子與A β結(jié)合后催化H2O2的形成。過量的H2O2滲透過細(xì)胞膜，如果未催化分解將形成反應(yīng)性高的羥基自由基，導(dǎo)致DNA損傷、脂質(zhì)過氧化等氧化損傷。由于Αβ 1-42對(duì)銅離子有更高的結(jié)合親和力，因而Aβ 1-42比Αβ 1-40更容易聚集。
[0005]根據(jù)以上研究，減少Aβ斑塊中金屬離子的含量及金屬離子同Aβ多肽結(jié)合是抑制金屬離子誘導(dǎo)的Αβ多肽聚集的2個(gè)主要方法。通過金屬螯合劑抑制金屬離子誘導(dǎo)的Αβ多肽聚集的是治療AD的有效方法。特別是氯碘喹啉(CQ)及其衍生物ΡΒΤ2不僅能抑制鋅、銅離子誘導(dǎo)的Αβ多肽聚集、減小Αβ斑塊及ROS的產(chǎn)生，而且能提高AD小鼠的認(rèn)知能力。然而，大部分的金屬螯合劑無法透過血腦屏障，另外，金屬螯合劑對(duì)金屬離子的螯合不具有選擇性，這將螯合身體內(nèi)一些必須的金屬離子從而產(chǎn)生毒副作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，本發(fā)明的首要目的在于提供一種抑制A β及金屬離子誘導(dǎo)Aβ聚集的納米粒子。
[0007]本發(fā)明另一目的在于提供一種上述抑制Αβ及金屬離子誘導(dǎo)Αβ聚集的納米粒子的制備方法。
[0008]本發(fā)明再一目的在于提供上述抑制A β及金屬離子誘導(dǎo)A β聚集的納米粒子在制備抗阿爾茲海默綜合癥藥物中的應(yīng)用。
[0009]本發(fā)明的目的通過下述方案實(shí)現(xiàn):
[0010]一種抑制A β及金屬離子誘導(dǎo)A β聚集的納米粒子，該納米粒子為Y修飾的納米釕和/或硒粒子，Y為精氨酸、組氨酸、葡萄糖、蔗糖、維生素C和沒食子酸中的至少一種。
[0011]上述抑制Αβ及金屬離子誘導(dǎo)Αβ聚集的納米粒子的制備方法，當(dāng)Y為維生素C或沒食子酸時(shí)，包括以下步驟:
[0012]把Na2SeO3和/或RuCl3配成溶液Α，滴加Y溶液，冷卻靜置，離心，得到納米粒子。
[0013]當(dāng)Y為精氨酸、組氨酸、葡萄糖或蔗糖時(shí)，包括以下步驟:
[0014]將Y與Na2SeO3和/或RuCl3配成溶液B，滴加硼氫化鈉，冷卻靜置，離心，得到納米粒子。
[0015]所述Y溶液的濃度為0.025~0.lmol/L。
[0016]所述溶液A或溶液B配置時(shí)所用Na2SeO3的濃度為0.lmol/L。
[0017]所述溶液A或溶液B配置時(shí)所用RuCl3的濃度為0.025~0.lmol/L。
[0018]優(yōu)選地，所述溶液A或溶液B中，Na2SeOjP RuCl3的摩爾濃度比為1.5:1~3:1。
[0019]優(yōu)選地，所述溶液A或溶液B中，Na2SeO3和RuCl3的摩爾濃度比為2:1。
[0020]所用Y的量與Na2SeO3和RuCl3總量的摩爾比為1:1~6:1。
[0021]優(yōu)選地，所用Y的量與Na2SeO3和RuCl3總量的摩爾比為4:1。
[0022]所用硼氫化鈉的濃度為0.025~0.8m0l/L,所用硼氫化鈉與Y的摩爾比為1:1~6:1。
[0023]所述冷卻靜置指冷卻至室溫放置12~24h。
[0024]優(yōu)選地，所述溶液A在滴加Y溶液前加熱至30~40°C。
[0025]優(yōu)選地，離心后所得納米粒子用純水洗滌。上述配置溶液均采用純水配置即可。
[0026]上述抑制A β及金屬離子誘導(dǎo)A β聚集的納米粒子在制備抗阿爾茲海默綜合癥藥物中的應(yīng)用。
[0027]本發(fā)明制備得到不同修飾劑的納米釕和/或硒粒子，利用其與Αβ多肽上的金屬離子結(jié)合位點(diǎn)，從而干預(yù)金屬離子同Αβ多肽的結(jié)合，抑制金屬離子誘導(dǎo)Αβ多肽的聚集。研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)結(jié)合到納米表面后構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化這將影響了蛋白聚集過程?，F(xiàn)有研發(fā)所發(fā)現(xiàn)的能同Αβ蛋白結(jié)合的納米材料分為無機(jī)納米粒子(納米金、磁性納米粒子及量子點(diǎn)等)、高分子納米材料和碳為基礎(chǔ)的納米材料(富勒烯、碳納米管、石墨烯)等。這些納米材料能有效地抑制Αβ多肽的聚集，其抑制作用主要是由于納米有著較大比表面積及較強(qiáng)的吸附能力，當(dāng)納米與多肽結(jié)合后可能覆蓋了位于蛋白質(zhì)中央疏水性活性位點(diǎn)同時(shí)也減少了溶液中的淀粉樣蛋白的濃度，從而抑制了 Αβ多肽的纖維化聚集。納米的修飾劑、納米粒徑及表面電荷均會(huì)影響納米同Αβ多肽的結(jié)合。采用不同修飾劑可修飾出不同粒徑及電荷的納米，并通過研究不同修飾劑制備得到的納米粒子的性能，確定修飾劑、納米粒徑及表面電荷對(duì)于納米同Αβ多肽的結(jié)合能力的影響，本發(fā)明利用精氨酸、組氨酸、葡萄糖、蔗糖、維生素C和沒食子酸修飾的納米粒子，具有明顯優(yōu)異的抑制金屬離子所誘導(dǎo)Aβ多肽聚集的作用，可應(yīng)用于制備抗阿爾茲海默綜合癥藥物中。
[0028]本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)，具有如下的優(yōu)點(diǎn)及有益效果:
[0029]( I)本發(fā)明制備的Y修飾納米粒子包括了納米釕、納米硒、復(fù)合納米硒/釕，該Y修飾納米粒子不僅能抑制A β的自發(fā)聚集，而且具有抑制金屬離子所誘導(dǎo)的A β多肽聚集的作用，可應(yīng)用于制備抗阿爾茲海默綜合癥藥物。
[0030](2)本發(fā)明制備的維生素C和沒食子酸修飾的納米粒子是直接以維生素C和沒食子酸為還原劑與修飾劑，制備過程無需添加其它輔助試劑、產(chǎn)物體系簡(jiǎn)單，精氨酸、組氨酸、葡萄糖、蔗糖作為修飾劑，可以提高納米的生物相容性，另外，所修飾的納米釕的穩(wěn)定性高。操作簡(jiǎn)單，方法簡(jiǎn)易，產(chǎn)品可直接保存和使用。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0031]圖1是精氨酸修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕形貌圖。
[0032]圖2是精氨酸修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕與A β 40多肽結(jié)合的透射電鏡圖。
[0033]圖3是精氨酸修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕對(duì)鋅離子誘導(dǎo)的Aβ 40多肽聚集體神經(jīng)毒性的抑制作用。
[0034]圖4是精氨酸修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕抑制鋅離子誘導(dǎo)Aβ 40多肽聚集的原子力圖。
[0035]圖5是精氨酸修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕減少聚集A β 40多肽所引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡的結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0036]下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。
[0037]下列實(shí)施例中所用原料的純度只要達(dá)到化學(xué)純以上即可，來源均可從市場(chǎng)購得。
[0038]實(shí)施例1:精氨酸修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕的制備
[0039](I)稱取0.1729g亞硒酸鈉，用蒸餾水定容至IOmL配制成0.lmol/L儲(chǔ)存液；同時(shí)稱取0.0435g精氨酸，用蒸餾水定容至IOmL配制成0.025mol/L儲(chǔ)存液；稱取0.0259g三氯化釕，用蒸懼水定容至5mL配制成0.025mol/L儲(chǔ)存液。
[0040] (2)取0.2mL亞硒酸鈉儲(chǔ)備液與不同比例精氨酸混合，在400rpm/min的條件下逐漸滴加不同比例的硼氫化鈉，顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榇u紅色后停止攪拌，說明已還原出納米硒，亞硒酸鈉與精氨酸或硼氫化鈉的摩爾比分別為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6。其中，精氨酸修飾的納米硒中亞硒酸鈉與精氨酸的摩爾比為1:4的樣品最穩(wěn)定，而亞硒酸鈉與硼氫化鈉的摩爾比為1:4。將上述溶液在4°C下放置12h，離心分離，棄上清液，洗滌，定容至IOmL,得到2mM精氨酸修飾的納米硒。通過TEANA1-10型透射電子顯微鏡(TEM)觀察，如圖1A所示。得到納米粒子的分散體系，其粒徑在IlOnm左右。該納米粒子能在室溫下穩(wěn)定存在，各易保存。
[0041](3)精氨酸修飾的納米釕的步驟與(2)相似，即取0.4mL三氯化釕儲(chǔ)備液與不同比例精氨酸混合，在400rpm/min的條件下逐漸滴加不同比例的硼氫化鈉，顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗷疑笸Ｖ箶嚢?，最終三氯化釕與精氨酸的摩爾比分別為1: 1、1: 2、1: 3、1:4、1: 5、1:6。精氨酸修飾的納米釕中三氯化釕與精氨酸的摩爾比為1:4時(shí)最穩(wěn)定，亞硒酸鈉與硼氫化鈉的摩爾比同樣為1:4。該溶液在4°C下放置12h，離心分離，棄上清液，洗滌，定容至10mL，得到2mM精氨酸修飾的納米釕。通過TEANA1-10型透射電子顯微鏡(TEM)觀察，如圖1B所示。得到納米粒子的分散體系，其粒徑在30nm左右。該納米粒子在室溫下穩(wěn)定存在。
[0042](4)取0.2mL亞硒酸鈉與0.4mL三氯化釕儲(chǔ)備液及精氨酸(精氨酸與亞硒酸鈉和三氯化釕兩者總量和摩爾比為4:1)混合加熱到40°C，隨后在400rpm/min的條件下按步驟
(2)與(3)優(yōu)選出的還原劑最佳比例(硼氫化鈉與亞硒酸鈉和三氯化釕兩者總量和摩爾比為4:1)滴加進(jìn)入硼氫化鈉儲(chǔ)備液。優(yōu)選出精氨酸修飾的復(fù)合納米硒/釕中硒與釕的摩爾比為2:1。該溶液在4°C下放置12h，離心分離，棄上清液，洗滌，定容至10mL，得到2mM精氨酸修飾的復(fù)合納米硒/釕。通過TEANA1-10型透射電子顯微鏡(TEM)觀察，如圖1C所示。得到納米粒子的分散體系，其粒徑在90nm左右。該納米粒子能在室溫下穩(wěn)定存在，各易保存。
[0043]組氨酸、葡 萄糖或蔗糖修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕的制備步驟同上，除試劑由精氨酸換為上述試劑。
[0044]實(shí)施例2:沒食子酸修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕的制備
[0045](I)稱取0.1729g亞硒酸鈉,用蒸懼水定容至IOmL配制成0.lmol/L儲(chǔ)存液；同時(shí)稱取0.0425g沒食子酸，用蒸餾水定容至IOmL配制成0.025mol/L儲(chǔ)存液；稱取0.0259g三氯化釕，用蒸懼水定容至5mL配制成0.025mol/L儲(chǔ)存液。
[0046](2)取0.2mL亞硒酸鈉儲(chǔ)備液,在400rpm/min的條件下逐漸滴加不同比例的沒食子酸，顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榇u紅色后停止攪拌，說明已還原出納米硒，最終亞硒酸鈉與沒食子酸的摩爾比分別為1: 1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6。其中，沒食子酸修飾的納米硒中亞硒酸鈉與沒食子酸的摩爾比為1:4的樣品最穩(wěn)定。將上述溶液在4°C下放置12h，離心分離，棄上清液，洗滌，定容至10mL，得到2mM沒食子酸修飾的納米硒。該納米粒子能在室溫下穩(wěn)定存在，容易保存。
[0047](3)沒食子酸修飾的納米釕的步驟與(2)相似，即取0.4mL三氯化釕儲(chǔ)備液，在400rpm/min的條件下逐漸滴加不同比例的沒食子酸，顏色轉(zhuǎn)變?yōu)榍嗷疑笸Ｖ箶嚢?，最終三氯化釕與沒食子酸的摩爾比分別為1:1、1:2、1:3、1:4、1:5、1:6。沒食子酸修飾的納米釕中三氯化釕與沒食子酸的摩爾比為1:4時(shí)最穩(wěn)定。該溶液在4°C下放置12h，離心分離，棄上清液，洗滌，定容至10mL，得到2mM沒食子酸修飾的納米釕。該納米粒子在室溫下穩(wěn)定存在。
[0048](4)取0.2mL亞硒酸鈉與0.4mL三氯化釕儲(chǔ)備液混合加熱到4(TC,隨后在400rpm/min的條件下按步驟(2)與(3)優(yōu)選出的還原劑最佳比例(沒食子酸與兩者總量和摩爾比為4:1)滴加進(jìn)入沒食子酸儲(chǔ)備液。優(yōu)選出沒食子酸修飾的復(fù)合納米硒/釕中硒與釕的摩爾比為2:1。該溶液在4°C下放置12h，離心分離，棄上清液，洗滌，定容至IOmL,得到2mM沒食子酸修飾的復(fù)合納米硒/釕。該納米粒子能在室溫下穩(wěn)定存在，容易保存。
[0049]維生素C修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕的制備方法同上。
[0050]實(shí)施例3:Y修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕與Αβ 1-40多肽結(jié)合
[0051]先取30 μ M A β 4ο (購自上海GL Biochem Ltd.公司)在37°C下孵育3天形成纖維狀聚集，隨后往該樣品中分別加入60 μ g/mL實(shí)施例1和實(shí)施例2制備得到的修飾并用羅丹明B標(biāo)記的納米粒子再孵育6h。取IOyL的上述溶液滴在表面經(jīng)過正電荷處理的玻片，待樣品干燥后，通過激光共聚焦顯微鏡下觀察。結(jié)果表明，本發(fā)明制備得到的精氨酸、組氨酸、葡萄糖、蔗糖、維生素C和沒食子酸分別修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕均可與Αβ40多肽結(jié)合，其中納米釕及復(fù)合納米硒/釕與多肽結(jié)合的量比納米硒多，說明納米釕及復(fù)合納米硒/釕與多肽的結(jié)合能力大于納米硒。
[0052]其中，精氨酸修飾的納米硒(SeNPs)、納米釕(RuNPs)及復(fù)合納米硒/釕(Se/RuNPs)與Αβ 1-40多肽結(jié)合的TEM掃描結(jié)果如圖2所示。
[0053]實(shí)施例4:Υ修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕對(duì)鋅離子誘導(dǎo)的A β4(ι多肽聚集體神經(jīng)毒性的抑制作用
[0054]本實(shí)驗(yàn)中PC12細(xì)胞購自ATCC公司，培養(yǎng)條件為添加了 5%馬血清、10%牛血清的DMEM培養(yǎng)基，5%C02,37 dC條件下。
[0055]MTT測(cè)試方法
[0056]30 μ M A β 40多肽分別與60 μ M實(shí)施例1和實(shí)施例2制備得到的修飾納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕在PBS，37°C條件下孵育3天；取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的腫瘤細(xì)胞，調(diào)整活細(xì)胞濃度為2 X IOVmL加于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μ L，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h待貼壁后，分別加入不同孵育樣品，加樣組和對(duì)照組均設(shè)6個(gè)復(fù)孔，置37°C，5%C02培養(yǎng)72h，然后加入MTT(5mg/mL)20 μ L/孔,5h后離心棄上清液,加入二甲基亞砜(DMSO)IOO μ L/孔,振蕩IOmin左右，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下測(cè)定OD值，計(jì)算細(xì)胞存活率。
[0057]細(xì)胞存活率(％)=加藥孔的實(shí)際OD值/陰性對(duì)照孔的OD值；
[0058]結(jié)果表明，本發(fā)明制備得到的精氨酸、組氨酸、葡萄糖、蔗糖、維生素C和沒食子酸分別修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕的細(xì)胞毒性都很低，細(xì)胞存活率達(dá)91%。
[0059]其中，精氨酸修飾的納米硒(SeNPs)、納米釕(RuNPs)及復(fù)合納米硒/釕(Se/RuNPs)的結(jié)果見圖3，本發(fā)明中精氨酸修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕的細(xì)胞毒性都很低，而復(fù)合納米硒/釕能有效地抑制鋅離子誘導(dǎo)的Aβ 4(|多肽聚集體神經(jīng)毒性，相比于對(duì)照組，細(xì)胞存活率達(dá)91%。
[0060]實(shí)施例5:透射電鏡觀察Y修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕抑制鋅離子誘導(dǎo)A β 4(|多肽聚集形態(tài)的變化
[0061]在50mM PBS，ρΗ7.4 溶液中，30 μ M A β 4。多肽分別與 60 μ M Zn (Ac) 2 或 / 與 60 μ g/mL實(shí)施例1和實(shí)施例2制備得到的修飾納米粒子在37°C條件下孵育3天。取10 μ L上述孵育溶液滴在新劈開的云母片上，等樣品半干的時(shí)候，用蒸餾水輕輕沖洗云母片，在室溫中過夜干燥。樣品通過Hitach1-7650透射電子顯微鏡觀察。孵育3天后，單獨(dú)的Aβ 4(|多肽形成明顯可辨的纖維狀聚集，而鋅離子能顯著增加Αβ4(ι多肽聚集的量，而本發(fā)明的精氨酸、組氨酸、葡萄糖、蔗糖、維生素C和沒食子酸分別修飾的納米硒、納米釕及復(fù)合納米硒/釕均明顯表現(xiàn)為抑制鋅離子誘導(dǎo)的A β 4(|多肽聚集，其中，修飾的復(fù)合納米硒/釕效果最顯著，在該組中，Αβ 4(|多肽僅形成短的纖維。說明本發(fā)明制備得到的復(fù)合納米硒/釕能結(jié)合于Αβ 4(|多肽并有效地減少鋅離子與多肽的結(jié)合從而抑制鋅離子誘導(dǎo)的A β 4(|多肽聚集。
[0062]其中，精氨酸修飾的納米硒(SeNPs)、納米釕(RuNPs)及復(fù)合納米硒/釕(Se/RuNPs)的結(jié)果見圖4。
[0063]實(shí)施例6:Y修飾的納米硒減少聚集A β 4(|多肽所引起的神經(jīng)細(xì)胞凋亡
[0064]在12孔培養(yǎng)板中各孔放置一片高溫滅菌過的玻片，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PC12細(xì)胞用
0.1%胰蛋白酶溶液消化制成細(xì)胞懸浮液，調(diào)整細(xì)胞濃度為I X IO5個(gè)/mL，接種于玻片上，在超凈工作臺(tái)上放置40min，添加ImL培養(yǎng)基，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后加入事先孵育好的A β 40多肽及鋅離子或本發(fā)明的修飾納米粒子的樣品(孵育步驟同例4)。48h后，將玻片取出，用多聚甲醛固定，按TUNEL試劑盒說明書上的要求進(jìn)行染色，最后用DAPI染色15min便可Nikon Eclipse TE2000-E熒光顯微鏡下觀察凋亡的細(xì)胞量。凋亡的細(xì)胞核被染成綠色，正常的細(xì)胞核被染成藍(lán)色。結(jié)果顯示，鋅離子與Αβ4(ι多肽共同孵育樣品組凋亡細(xì)胞的數(shù)量顯著高于單獨(dú)Αβ4(ι多肽組，而本發(fā)明的精氨酸、組氨酸、葡萄糖、鹿糖、維生素C和沒食子酸分別修飾的納米硒、納米釕及納米硒/釕能顯著減少鋅離子所誘導(dǎo)的A β 4(|多肽的神經(jīng)毒性，其中，復(fù)合納米硒/釕的凋亡細(xì)胞數(shù)量最少。
[0065]精氨酸修飾的納米硒(SeNPs)、納米釕(RuNPs)及復(fù)合納米硒/釕(Se/RuNPs)的觀察圖如圖5所示，納米硒部分減少凋亡細(xì)胞的數(shù)量，說明復(fù)合納米硒/釕抑制鋅離子誘導(dǎo)的A β 4(|多肽聚集的能力優(yōu)于納米硒。
[0066]上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種抑制A β及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子，其特征在于該納米粒子為Y修飾的納米釕和/或硒粒子，Y為精氨酸、組氨酸、葡萄糖、蔗糖、維生素C和沒食子酸中的至少一種。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制Αβ及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子的制備方法，其特征在于: 當(dāng)Y為維生素C或沒食子酸時(shí)，包括以下步驟: 把Na2SeO3和/或RuCl3配成溶液Α，滴加Y溶液，冷卻靜置，離心，得到納米粒子； 當(dāng)Y為精氨酸、組氨酸、葡萄糖或蔗糖時(shí)，包括以下步驟: 將Y與Na2SeO3和/或RuCl3配成溶液B，滴加硼氫化鈉，冷卻靜置，離心，得到納米粒子。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制Aβ及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子的制備方法，其特征在于:所述Y溶液的濃度為0.025~0.lmol/L。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制Aβ及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子的制備方法，其特征在于:所述溶液A或溶液B配置時(shí)所用Na2SeO3的濃度為0.lmol/L。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制Aβ及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子的制備方法，其特征在于:所述溶液A或溶液B配置時(shí)所用RuCl3的濃度為0.025~0.lmol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制Aβ及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子的制備方法，其特征在于:所述溶液A或溶液B中，Na2SeO3和RuCl3的摩爾濃度比為1.5:1~3:1。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制Aβ及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子的制備方法，其特征在于:所用Y的量與Na2SeO3和RuCl3總量的摩爾比為1:1~6:1。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制Αβ及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子的制備方法，其特征在于:所述溶液A或溶液B中，Na2SeO3和RuCl3的摩爾濃度比為2:1 ;所用Y的量與Na2SeO3和RuCl3總量的摩爾比為4:1。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抑制Aβ及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子的制備方法，其特征在于:所用硼氫化鈉的濃度為0.025~0.8mol/L,所用硼氫化鈉與Y的摩爾比為1:1~6:1 ;所述冷卻靜置指冷卻至室溫放置12~24h。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抑制Aβ及金屬離子誘導(dǎo)其聚集的納米粒子在制備抗阿爾茲海默綜合癥藥物中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】A61K47/48GK103948935SQ201410150890
【公開日】2014年7月30日 申請(qǐng)日期:2014年4月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月15日
【發(fā)明者】劉杰, 楊麗聰 申請(qǐng)人:暨南大學(xué)