一種人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)的制備方法
【專利摘要】一種人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)的制備方法，是利用恒化器培養(yǎng)后的人腸道微生態(tài)系統(tǒng)預防和治療感染性疾病：采用自制的恒化器培養(yǎng)三個月無任何抗生素史的健康志愿者，用于治療恩諾沙星造成的感染性疾病。本發(fā)明的優(yōu)點是：相較于單一或幾種益生菌組合，本發(fā)明直接將健康志愿者整個微生態(tài)系統(tǒng)作為一個整體用于疾病的防治，其組成穩(wěn)定、抗干擾能力強、治愈效果好；此外，由于使用的微生態(tài)系統(tǒng)來源于人體，因此培養(yǎng)后的微生態(tài)系統(tǒng)對人體安全、無毒副作用。
【專利說明】一種人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)的制備方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)的制備方法。

【背景技術】
[0002] 在家畜養(yǎng)殖過程中，大量抗生素的濫用導致其殘留進入食品供應渠道，最終進入 人體并引起傳染性疾病。目前，中國、歐洲、澳大利亞和美國對抗生素使用的國標明確要求 須對微生物菌群進行安全評價。但是，濫用抗生素藥物的現(xiàn)象仍然存在。
[0003] 恩諾沙星是一種廣譜抗菌藥劑。在中國，它被允許使用在家畜飼養(yǎng)上，主要通過對 家畜進行皮下注射、肌肉注射或者口服等方式使用。而恩諾沙星殘留會隨著食品供應進入 人體腸道并改變食用者體內腸道菌群數(shù)量和多樣性，從而影響人體健康。
[0004] 腸道微生物與人類健康密切相關，許多疾病的發(fā)生往往都伴隨著腸道微生物的 失衡，包括菌群的定植位置、數(shù)量和種類的變化。當由抗生素引起的胃腸道疾病發(fā)生時， 我們會發(fā)現(xiàn)人類腸道微生物嚴重失調，并伴隨著致病菌的瘋長和益生菌 辦acieroiofes AiAbfeacieria)的大量減少。同時，微生物失調會導致人體對營養(yǎng)吸收的 能力降低、免疫力的下降和微生物對病原體的抗定植能力的減弱，使疾病惡化。因此，在很 長一段時間，用包含益生微生物的產品來恢復腸道健康都是一種極重要的方式，而菌株的 選擇主要有和它們越來越多的被用于改善人類的健康。
[0005] 然而，目前幾乎沒有人嘗試將人體腸道微生物菌群作為一個整體研究其對外界病 原體抵御能力的影響。本發(fā)明中，我們培養(yǎng)了健康人體腸道菌群，將活細胞計數(shù)法和DGGE 法相結合，綜合評價了恩諾沙星對腸道菌群多樣性的影響并評價了健康人體腸道菌群微生 態(tài)系統(tǒng)在預防感染中的良好效果。


【發(fā)明內容】

[0006] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的不足，提供一種人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)的制備方 法。
[0007] 本發(fā)明是利用健康人體腸道中存在的土著菌群抵抗外來致病菌，將在人體腸道微 生物系統(tǒng)中占優(yōu)勢地位的腸道微生態(tài)主要優(yōu)勢菌群培養(yǎng)后直接給人或者通過體外模型模 擬人體腸道來驗證其抵抗機會致病菌的效果。
[0008] 本發(fā)明所述制備方法包括下列步驟： 1、 樣品的收集和保存：收集志愿者早晨第1次排便樣品，轉人厭氧環(huán)境，加入甘油，其 重量為糞便和甘油總重量的10%，旋渦振蕩器混勻，-80 °C保存； 2、 恒化器的組裝和使用：將儲料罐，發(fā)酵罐，廢液罐，橡膠塞，硅膠管，裝NaOH的玻璃瓶 及通氣過濾器按順序連接起來，置于工作臺上，連接混合氣體，蠕動泵，pH調節(jié)器，磁力攪拌 器，廢氣排除裝置； 3、 恒化器內培養(yǎng)基的制備：按加入成分占終產物質量百分比加入如下成分：5%。可 溶性丨疋粉，3%。牛乳釀蛋白，3%。蛋白腺，0. 6%。果|父，0. 6%。木聚糖，0. 6%。阿拉伯半乳聚糖， 0. 6 %。支鏈淀粉，0. 4 %。半胱氨酸，0. 01 %。血紅素，0. 25 %。膽固醇，0. 25 %。鵝脫氧膽酸， 0. 25%。膽酸，2%。磷酸二氫鉀，10%。磷酸氫二鉀，4. 5%。氯化鈉，0. 5%。七水硫酸鎂，0. 45%。二 水氯化鈣，培養(yǎng)基經高壓滅菌后用蠕動泵泵入儲料罐內； 4、腸道微生態(tài)系統(tǒng)的制備：恒化器內通氮氣保持厭氧，恒化器置于37°C水浴，罐內pH 在線控制為6. 5,運行體積500 mL，以35 mL / h稀釋速率利用蠕動泵進泵出，待恒化器穩(wěn) 定后，按重量比接種10%在-80 °C保存的糞便樣品，連續(xù)培養(yǎng)8-16天后得到的的培養(yǎng)物即 為健康人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)。
[0009] 本發(fā)明的有益效果：相較于單一或幾種益生菌組合，本發(fā)明直接將健康志愿者整 個微生態(tài)系統(tǒng)作為一個整體用于疾病的防治，穩(wěn)定、抗干擾能力強、治愈效果好；此外，由于 使用的微生態(tài)系統(tǒng)來源于人體，因此培養(yǎng)后的微生態(tài)系統(tǒng)對人體安全、無毒副作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010] 圖1-1空白組中腸道微生態(tài)系統(tǒng)菌群數(shù)量監(jiān)測； 圖1-2 1. 25 μ g/mL恩諾沙星對恒化器中腸道微生態(tài)系統(tǒng)菌群數(shù)量的影響； 圖1-3 12. 5 μ g/mL恩諾沙星對恒化器中腸道微生態(tài)系統(tǒng)菌群數(shù)量的影響； 圖1-4 125 μ g/mL恩諾沙星對恒化器中腸道微生態(tài)系統(tǒng)菌群數(shù)量的影響； 圖1-5添加腸道微生態(tài)系統(tǒng)后對125 μ g/mL恩諾沙星造成腸道菌群數(shù)量紊亂的恢復 效果； 圖2腸道微生態(tài)系統(tǒng)抵抗機會致病菌白假絲酵母菌SC5314效果圖。

【具體實施方式】
[0011] 實施例1 : 人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)的制備方法 1.收集志愿者早晨第1次排便樣品，轉人厭氧環(huán)境，加入甘油，其重量為糞便和甘油總 重量的10%，旋渦振蕩器混勻，-80 °C保存。
[0012] 2.恒化器的組裝和使用：將儲料罐，發(fā)酵罐，廢液罐，橡膠塞，硅膠管，裝NaOH的玻 璃瓶及通氣過濾器按順序連接起來，置于工作臺上，連接混合氣體，蠕動泵，pH調節(jié)器，磁力 攪拌器，廢氣排除裝置 3.配制恒化培養(yǎng)的培養(yǎng)基，以總體積500毫升計，下列各成分質量百分比分別為：5%。 可溶性丨疋粉，3%。牛乳釀蛋白，3%。蛋白腺，0. 6%。果|父，0. 6%。木聚糖，0. 6%。阿拉伯半乳聚 糖，0. 6%。支鏈淀粉，0. 4%。半胱氨酸，0. 01 %。血紅素，0. 25%。膽固醇，0. 25%。鵝脫氧膽酸， 0. 25%。膽酸，2%。磷酸二氫鉀，10%。磷酸氫二鉀，4. 5%。氯化鈉，0. 5%。七水硫酸鎂，0. 45%。二 水氯化鈣。培養(yǎng)基經高壓滅菌后用蠕動泵泵入儲料罐內。
[0013] 4.腸道微生態(tài)系統(tǒng)的制備：恒化器內通氮氣保持厭氧，恒化器置于37°C水浴，罐 內pH在線控制為6. 5,運行體積500 mL，以35 mL / h稀釋速率利用蠕動泵進泵出。待恒 化器穩(wěn)定后，按重量比接種10%在-80 °C保存的糞便樣品，具體流程為：將-80 °C保存的樣 品室溫解凍1 h后，用厭氧與還原稀釋劑將糞便稀釋，均勻懸?。杭S便厭氧與還原稀釋比為 1:4。在第1天、第3天、第5天，分別通過容器的蓋子向總體積為50 mL的恒化器中接種注 射50 mL含有的10 g糞便的懸浮液。連續(xù)培養(yǎng)8-16天后得到的的培養(yǎng)物即為健康人體腸 道微生態(tài)系統(tǒng)。
[0014] 實施例2 :腸道微生態(tài)系統(tǒng)治療恩諾沙星造成的感染性疾病的治療效果 1.按實施例1中步驟1，步驟2,步驟3,步驟四構建恒化器，配制培養(yǎng)基并制作人體腸 道微生態(tài)系統(tǒng)。
[0015] 2.待恒化器運行23天穩(wěn)定后，分別加入1. 25 μ g/mL，12. 5 μ g/mL，125 μ g/mL, 125 μ g/mL恩諾沙星制造抗生素紊亂模型，同時以不加恩諾沙星的恒化器作為對照組。
[0016] 3.自培養(yǎng)17-31天起，每天從個發(fā)酵罐取培養(yǎng)物10 mL，利用活菌計時方法分別 計數(shù)培養(yǎng)物中微生物的數(shù)量變化；利用變性梯度凝膠電泳方法監(jiān)測培養(yǎng)物種菌群種類的變 化?；罹嫈?shù)和變性梯度凝膠電泳具體操作如下： 活菌計數(shù)：樣品無菌條件下取樣，經十倍倍比稀釋后，置于適宜條件下培養(yǎng)，數(shù)日后觀 察平皿菌落生長情況，取菌落數(shù)大于30小于300的平皿進行計數(shù)。根據(jù)平皿菌落總數(shù)按下 列公式計算活菌數(shù)：活菌數(shù)（CFU /粒）=(3個平皿菌落數(shù)之和/ 3) X (10 /粒數(shù)）X稀 釋度。培養(yǎng)基分別為培養(yǎng)總厭氧菌和總需氧菌的腦心浸液培養(yǎng)基、培養(yǎng)乳酸菌的MRS瓊脂 培養(yǎng)基、培養(yǎng)雙歧桿菌的SBM培養(yǎng)基、培養(yǎng)大腸桿菌的BSM培養(yǎng)基和培養(yǎng)擬桿菌的BBE培養(yǎng) 基。
[0017] 變性梯度凝膠電泳：按每種培養(yǎng)物取菌液1 mL計，提取基因組DNA :按體積比加 入70%包含500暈摩氯化鈉、50暈摩Tris-鹽酸、0. 5暈摩乙二胺四乙酸，和質量百分 比4%十二烷基磺酸鈉聽的裂解緩沖液，30%酚/氯仿/異戊醇體積比為25 :24 :1的酚氯 仿異戊醇和0.4 g玻璃珠，混勻，并將離心管置于渦旋振蕩器上振蕩10分鐘，20000轉離 心5分鐘后，向上清液中加入占總體積0.075%的10摩爾乙酸銨，DNA隨即使用兩次酚 /氯仿/異戊醇提取和一次氯仿提取，異丙醇沉淀，體積比為70 %乙醇洗滌，風干后，加入 100微升無菌水，加入2微升RNA酶在37°C孵育15分鐘。擴增16S rDNA V3區(qū)引物為GC clamp-TACGGGAGGCAGCAG-3'，5' -ATTACCGCGGCTGCTGG-3'。擴增體系 50 微升：包括 100 納克DNA模板，IX MTaq緩沖液，200微摩脫氧核糖核苷三磷酸混合物，200納摩各 引物，25微升PCR Mix。參照Muyzer等方法，GC夾子序列為：clamp sequence: CGCCCGG GGCGCGCCCCGGGCGGGGCGGGGGCACGGGGGG)。反應條件：94 °C，反應 5 min;隨后進行 30 個循 環(huán)：94°C 30秒；56°C，30秒；72°C，1分鐘；最后72°C延伸7分鐘。
[0018] 使用質量比8%聚丙烯酰胺凝膠，質量比35%?65% [100%變性梯度定義為體積 比40%甲酰胺和7 Μ尿素的變性梯度。首先在220 V電壓下預電泳10分鐘，隨后在85 V 的固定電壓下電泳16小時。電泳結束后，進行硝酸銀染色。
[0019] 4.從32天開始，向每個發(fā)酵罐中加入108個白假絲酵母菌SC5314,基因號：NW_13 個9422. 1，按實施例2中活菌計數(shù)方法計數(shù)白假絲酵母菌SC5314數(shù)量的變化。
[0020] 5.活菌計數(shù)結果如圖1-1所示，在1. 25 μ g/mL恩諾沙星的實驗組，總厭氧菌、總 需氧菌、乳酸菌、腸球菌、擬桿菌，但是雙歧桿菌的數(shù)量下降了 100倍，降到1〇4菌落數(shù)量單 位（CFU)/mL。當加入12. 5 μ g/mL恩諾沙星的實驗組，乳酸菌、雙歧桿菌、腸球菌和大腸桿 菌在第27天約下降了 10-100倍，但乳酸菌和大腸桿菌正在沒加藥物后可以恢復到穩(wěn)定水 平，但是雙歧桿菌和腸球菌未恢復到正常水平。擬桿菌的數(shù)量在該濃度下影響很小。在125 yg/mL恩諾沙星的濃度下所有的細菌都被影響。第25天，所有待測細菌都減少了，總厭氧 菌、總需氧菌和大腸桿菌都大量增加，比沒有藥物的對照組要高，然而乳酸菌、雙歧桿菌、腸 球菌、脆弱擬桿菌都不能恢復到正常水平。在益生菌實驗組中，隔了兩天再加藥物，以便大 腸桿菌的生長和維持腸球菌的數(shù)量，結果表明，相較于125 μ g /mL恩諾沙星實驗組，培養(yǎng) 人類腸道菌群能幫助脆弱擬桿菌恢復到正常水平。在益生菌組和125 μ g /mL ENR實驗組， 總厭氧菌和總需氧菌沒有發(fā)現(xiàn)明顯的改變。
[0021] 圖1-2中恒化器抵抗外來致病菌定植實驗表明，12. 5 μ g/mL劑量組和空白組可 抑制白假絲酵母菌SC5314在恒化器中的定植，而1. 25 μ g/mL和125 μ g/mL組中紊亂的 腸道菌群無法抵抗白假絲酵母菌SC5314的定植。與125 μ g/mL組相比，添加腸道微生態(tài) 系統(tǒng)的的益生菌組可明顯抑制白假絲酵母菌SC5314定植，即可用于預防和治療抗生素濫 用造成的菌群紊亂。 <uo> i.4y+A 大學 <120> 一，?人體*道微Φ/態(tài)系統(tǒng)的制備方法 <〇0> 3 <160> 3 <170> Patent! n version 3.3 <210> 1 <211> 15 <212> DMA <2J3>人丁序列 <400> I tacgggaggc agcag 15 <210> 2 <211> 17 <212> DMA <213> 人丄序列 <400> 2 attaccgcgg ctgctgg 17 <210> 3 <211> 40 <212> DMA <2?3> 人丄斤:列 <400> 3 CgCCCfiggC gcgccccggg CggggCgggi gcacgggglg 40
【權利要求】
1. 一種人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)的制備方法，其特征是： A、 樣品的收集和保存：收集志愿者早晨第1次排便樣品，轉人厭氧環(huán)境，加入甘油，其 重量為糞便和甘油總重量的10%，旋渦振蕩器混勻，-80 °C保存； B、 恒化器的組裝和使用：將儲料罐，發(fā)酵罐，廢液罐，橡膠塞，硅膠管，裝NaOH的玻璃瓶 及通氣過濾器按順序連接起來，置于工作臺上，連接混合氣體，蠕動泵，pH調節(jié)器，磁力攪拌 器，廢氣排除裝置； C、 恒化器內培養(yǎng)基的制備：按加入成分占終產物質量百分比加入如下成分：5%?？?溶性丨疋粉，3%。牛乳釀蛋白，3%。蛋白腺，0. 6%。果|父，0. 6%。木聚糖，0. 6%。阿拉伯半乳聚糖， 0. 6 %。支鏈淀粉，0. 4 %。半胱氨酸，0. 01 %。血紅素，0. 25 %。膽固醇，0. 25 %。鵝脫氧膽酸， 0. 25%。膽酸，2%。磷酸二氫鉀，10%。磷酸氫二鉀，4. 5%。氯化鈉，0. 5%。七水硫酸鎂，0. 45%。二 水氯化鈣，培養(yǎng)基經高壓滅菌后用蠕動泵泵入儲料罐內； D、 腸道微生態(tài)系統(tǒng)的制備：恒化器內通氮氣保持厭氧，恒化器置于37°C水浴，罐內pH 在線控制為6. 5,運行體積500 mL，以35 mL / h稀釋速率利用蠕動泵進泵出，待恒化器穩(wěn) 定后，按重量比接種10%在-80 °C保存的糞便樣品，連續(xù)培養(yǎng)8-16天后得到的的培養(yǎng)物即 為健康人體腸道微生態(tài)系統(tǒng)。
【文檔編號】A61P31/00GK104107194SQ201410139415
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年4月9日 優(yōu)先權日:2014年4月9日
【發(fā)明者】陳廷濤, 辛洪波, 王鑫 申請人:南昌大學