類載脂蛋白c-i及其在制備治療腎母細胞瘤的藥物中的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種新型的類載脂蛋白C-I及其在制備預防或治療腎母細胞瘤的藥物中的應用，本發(fā)明提供的用于預防或治療腎母細胞瘤的藥物，其有效成分是由55個氨基酸組成的單鏈多肽蛋白質(zhì)，即類載脂蛋白C-I（SEQ?ID?No.1），可通過化學方法合成。實驗表明，本發(fā)明的多肽蛋白質(zhì)藥物，通過抑制腎母細胞瘤的增殖與生長，達到治療腎母細胞瘤的作用。本發(fā)明的多肽蛋白質(zhì)藥物可在治療腎母細胞瘤中得到廣泛應用。
【專利說明】類載脂蛋白C-1及其在制備治療腎母細胞瘤的藥物中的應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領域，具體地說，涉及一種類載脂蛋白c-ι及其在制備預防或治療腎母細胞瘤的藥物中的應用。
【背景技術】
[0002]腎母細胞瘤(Nephroblastoma)，又名腎胚胎細胞瘤、wilms瘤(Wilms’ Tumor, WT),是最常見的兒童腎臟腫瘤，其發(fā)病率在小兒腹部腫瘤中占首位。在發(fā)達國家患兒的五年生存率大約為80%，死亡率小于5%[1]。在不發(fā)達國家中，大約有近一千萬患兒死于腎母細胞瘤，其中包括四百萬新生兒[2]。腎母細胞瘤的治療手段以手術切除為主，輔以化療，但這種治療手段仍難以完全解決轉(zhuǎn)移和復發(fā)的問題，且化療毒副反應嚴重，患兒難以承受。統(tǒng)計數(shù)據(jù)[3]表明:I期腎母細胞瘤8年存活率達90.5%-98.5%，I1-1II期的腎母細胞瘤患兒8年存活率為73.4%-88.7%，而IV期腎母細胞瘤患兒的8年存活率則僅為45.0%-57.1%。由以上數(shù)據(jù)可以看出，II期及以上腎母細胞瘤患兒的治療需要建立一種更高效、更安全的方法。因此，研究者一直在探索更為有效的、可最大限度上殺傷腫瘤細胞，同時不傷及正常細胞的生物治療方法。
[0003]目前，腫瘤學研究的熱點包括鑒定新的腫瘤標志物以提高早期診斷水平，篩選更有效的靶向藥物以及患兒的個體化治療等，蛋白質(zhì)組學為上述研究提供了新的平臺。蛋白質(zhì)組技術可以從整體上，全面的、動態(tài)的、定量的分析比較正常及病變標本中蛋白質(zhì)種類和數(shù)量的改變，有助于闡明蛋白質(zhì)間的調(diào)控網(wǎng)絡，從而有希望發(fā)現(xiàn)控制腫瘤進程的關鍵分子，為腫瘤的診斷、分型、藥物研究帶來新的思路和途徑[4]。
[0004]同時，多肽和蛋白質(zhì)類藥物是目前醫(yī)藥研發(fā)領域中最活躍，進展最快的部分，是二十一世紀最有前途的產(chǎn)業(yè)之一。腫瘤的發(fā)生是多種原因作用的結果，但最終都要涉及癌基因或癌蛋白的表達調(diào)控。不同腫瘤產(chǎn)生時所`需要的酶等調(diào)控因子不同，選擇特異性肽作為腫瘤發(fā)生時所需的調(diào)控因子等，封閉其活性位點，可防止腫瘤發(fā)生。現(xiàn)在已發(fā)現(xiàn)很多腫瘤相關基因?qū)δ[瘤產(chǎn)生調(diào)控因子，篩選與這些靶點特異結合的多肽，已成為尋找抗癌藥物的新熱點。日本科學家發(fā)現(xiàn)一種多肽聚合物[5]，由能夠與HER2蛋白特異性結合的靶向肽與Iytic肽通過肽鍵連接，該多肽聚合物具有高度細胞毒性作用，能夠在對正常細胞無副作用的情況下殺死乳腺癌細胞，這種方法為治療這一死亡率很高的惡性腫瘤開辟了新途徑。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種在腎母細胞瘤患兒血清中低表達的新型類載脂蛋白C-1。
[0006]本發(fā)明的另一目的是提供類載脂蛋白C-1在制備預防或治療腎母細胞瘤的藥物中的應用。
[0007]為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種類載脂蛋白C-1，其氨基酸序列為:1)SEQ IDN0.1 ;或2) SEQ ID N0.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且同等功能的由I)衍生的蛋白。
[0008]本發(fā)明還提供編碼所述類載脂蛋白C-1的基因。
[0009]本發(fā)明還提供含有編碼所述類載脂蛋白C-1基因的載體、轉(zhuǎn)基因細胞系和工程菌。
[0010]本發(fā)明還提供所述類載脂蛋白c-ι在制備預防或治療腎母細胞瘤的藥物中的應用。
[0011]本發(fā)明進一步提供一種用于預防或治療腎母細胞瘤的藥物，其有效成分為類載脂蛋白C-1。
[0012]發(fā)明人在前期研究中應用蛋白質(zhì)組學技術完成了腎母細胞瘤血清和組織蛋白質(zhì)標記物篩查及特異性標記物鑒定，鑒定出M/Z值為6455.5的特異性多肽蛋白質(zhì)標記物，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)該特異性多肽蛋白質(zhì)標記物與載脂蛋白C-1的覆蓋比達55.56%，將其命名為類載脂蛋白C-1肽[6]，這種標記物在腎母細胞瘤患兒血清中低表達，在正常兒童血清中高表達。發(fā)明人用蛋白質(zhì)組學技術篩選腎母細胞瘤特異性多肽蛋白質(zhì)標記物類載脂蛋白C-1肽的同時，構建了腎母細胞瘤血清蛋白質(zhì)指紋圖譜診斷模型[7]，腎母細胞瘤血清蛋白質(zhì)指紋圖譜臨床分期模型[8]，腎母細胞瘤血清蛋白質(zhì)指紋圖譜預后監(jiān)測模型[9]，發(fā)現(xiàn)類載脂蛋白C-1肽會隨著病情的發(fā)展而不同，根治性手術切除腫瘤后患兒血清中該標記物表達量接近正常兒童水平，姑息性手術切除腫瘤后患兒血清中該標記物表達量無變化。因此，類載脂蛋白C-1肽可以作為腎母細胞瘤血清特異性標記物，用于前期診斷腎母細胞瘤并作為腎母細胞瘤治療預后監(jiān)測指標。
[0013]根據(jù)以上研究推測，類載脂蛋白C-1肽與腎母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展可能存在某種生物學關系。而多肽和蛋白質(zhì)類藥物是人體內(nèi)源性物質(zhì)或針對生物體內(nèi)調(diào)控因子研發(fā)而得，通過參與、介入、促進或抑制人體內(nèi)或細菌病毒中生理生化過程而發(fā)揮作用。相比化療藥物，多肽和蛋白質(zhì)類藥物具有副作用低、藥效高、針對性強，不會蓄積于體內(nèi)而引起中毒。本發(fā)明以開發(fā)一種能夠治療腎母細胞瘤的多肽蛋白質(zhì)藥物為目標，對類載脂蛋白C-1肽對腎母細胞瘤生物學特性的影響進行了進一步研究。
[0014]鑒于類載脂蛋白C-1肽在腎母細胞瘤患兒血清中的特異表達:腎母細胞瘤患兒血清中低表達，在正常兒童血清中高表達；根治性手術切除腫瘤后患兒血清中該標記物表達量接近正常兒童水平，姑息性手術切除腫瘤后患兒血清中該標記物表達量無變化。本發(fā)明首先通過化學合成方法，合成出類載脂蛋白C-1肽，由長度55個氨基酸的多肽序列組成，通過高效液相色譜HPLC對其進行純化，使其純度達到99%以上；臨床手術中，完整切除III/IV期腎母細胞瘤志愿者的瘤體后,剖開瘤體,選擇生長良好的腫瘤標本,進行原代培養(yǎng),培養(yǎng)出穩(wěn)定的細胞系以后進行鑒定為腎母細胞瘤細胞。再使用熒光標記物FITC標記類載脂蛋白C-1肽，將標記有FITC的類載脂蛋白C-1肽與腎母細胞瘤細胞共培養(yǎng)48h，在熒光顯微鏡下觀察類載脂蛋白C-1肽在細胞上的表達情況，結果表明該多肽蛋白質(zhì)能夠與腎母細胞瘤細胞相結合(圖1)。
[0015]本發(fā)明進行類載脂蛋白C-1肽干預腎母細胞瘤細胞生長的體內(nèi)試驗。經(jīng)類載脂蛋白C-1肽干預的腎母細胞瘤細胞列為觀察組，未經(jīng)類載脂蛋白C-1肽干預的腎母細胞瘤細胞列為對照組:計算出細胞倍增時間，繪制細胞生長曲線；經(jīng)00(8染色試劑處理后，酶標儀下獲得相關數(shù)據(jù)計算出細胞生長活性曲線和類載脂蛋白C-1肽IC5cAIC8tl抑制濃度；流式細胞儀技術檢測觀察組與對照組的細胞生長周期和凋亡率。結果顯示，類載脂蛋白c-1肽能夠抑制腎母細胞瘤細胞的增殖。
[0016]進而本發(fā)明設計動物試驗，對BALB/c裸鼠皮下種植腎母細胞瘤細胞，成功構建荷瘤鼠后，未經(jīng)干預的荷瘤裸鼠列為對照組，使用類載脂蛋白C-1肽治療的荷瘤裸鼠列為觀察組。實驗結果:觀察組裸鼠的腫瘤較對照組裸鼠的腫瘤體積明顯縮??；觀察組裸鼠的體重和健康狀況較對照組裸鼠的體重、健康狀況和精神狀態(tài)明顯改善；觀察組裸鼠的腫瘤切片病理檢查顯示出現(xiàn)不同程度的凋亡壞死情況，對照組裸鼠的腫瘤切片病理檢查顯示仍以活性較好的增生期腎母細胞瘤細胞為主。以上結果表明類載脂蛋白C-1肽能夠有效地治療腎母細胞瘤，且安全性高、副作用小、藥效高。
[0017]由此，本發(fā)明提出一種治療腎母細胞瘤的多肽蛋白質(zhì)藥物，其氨基酸序列及相關信息如表1所示。
[0018]表1類載脂蛋白C-1肽氨基酸序列及相關信息
[0019]
【權利要求】
1.類載脂蛋白C-1，其特征在于，其氨基酸序列為:
1)SEQ ID N0.1 ;或 2)SEQ ID N0.1所示氨基酸序列經(jīng)取代、缺失和/或添加一個或幾個氨基酸且同等功能的由I)衍生的蛋白。
2.編碼權利要求1所述類載脂蛋白C-1的基因。
3.含有權利要求2所述基因的載體。
4.含有權利要求2所述基因的轉(zhuǎn)基因細胞系。
5.含有權利要求2所述基因的工程菌。
6.權利要求1所述類載脂蛋白C-1在制備預防或治療腎母細胞瘤的藥物中的應用。
7.一種用于預防或治療腎母細胞瘤的藥物，其有效成分為權利要求1所述的類載脂蛋白 C-1。
【文檔編號】A61P35/00GK103880949SQ201410077671
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月5日 優(yōu)先權日:2014年3月5日
【發(fā)明者】王家祥 申請人:王家祥, 鄭州大學第一附屬醫(yī)院