肺部遞送mRNA至非肺靶細胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供被配制成用于肺部施用的包含mRNA的組合物，以及將所述mRNA和/或所編碼的蛋白質(zhì)遞送至非肺細胞或組織的相關方法。所述組合物和方法可用于預防或改善與所述mRNA編碼的蛋白質(zhì)相關聯(lián)的疾病的癥狀。
【專利說明】肺部遞送mRNA至非肺靶細胞
[0001] 相關申請
[0002] 本申請要求2012年6月8日提交的美國臨時申請第61/657,452號的權益，該申 請的內(nèi)容以引用的方式并入本文。
[0003] 背景
[0004] 常規(guī)基因療法涉及使用DNA來將所需遺傳信息插入宿主細胞中。引入細胞中的 DNA通常整合至一個或多個轉(zhuǎn)染細胞的基因組中，從而允許所引入的遺傳物質(zhì)在宿主中的 長效作用。雖然這類持續(xù)作用可具有大致上益處，但是外源性DNA整合至宿主基因組中也 可具有許多有害效應。舉例來說，可能所引入的DNA將插入完整基因中，導致阻礙或甚至完 全消除內(nèi)源性基因的功能的突變。因此，使用DNA的基因療法可導致?lián)p害所治療宿主的重 要遺傳功能，如例如，消除或有害減少必需酶的產(chǎn)生或干擾對于細胞生長的調(diào)控起關鍵作 用的基因，從而導致未經(jīng)調(diào)控的或癌性的細胞增殖。另外，使用常規(guī)基于DNA的基因療法， 為了有效表達所需基因產(chǎn)物，必需包括強的啟動子序列，這也可導致細胞中的正?；虮?達的調(diào)控的不當變化。也可能基于DNA的遺傳物質(zhì)將導致誘導不需要的抗-DNA抗體，進而 可觸發(fā)可能致命的免疫響應。
[0005] 與DNA相比，使用RNA作為基因治療劑大致上更安全，因為（I) RNA不涉及穩(wěn)定整 合至轉(zhuǎn)染細胞的基因組中的風險，由此消除了所引入的遺傳物質(zhì)干擾必需基因的正常運作 或?qū)е乱鹩泻蛑掳┬耐蛔兊念檻]；（2)外來的啟動子序列不為有效翻譯編碼蛋白 質(zhì)所需要，再次避免了可能有害的副作用；（3)與質(zhì)粒DNA (pDNA)相比，信使RNA (mRNA)沒 有免疫原性CpG基元以使得不產(chǎn)生抗-RNA抗體；并且（4)由于RNA的半衰期相對較短，確 實由基于mRNA的基因療法產(chǎn)生的任何有害效應具有有限的持續(xù)時間。此外在許多應用中， mRNA的瞬時性質(zhì)轉(zhuǎn)移至細胞，S卩，其中任何治療效果的持續(xù)時間受mRNA和細胞中的蛋白質(zhì) 產(chǎn)物的壽命限制，從而比使用基于DNA的基因療法獲得的潛在更長持續(xù)效應更合乎需要。 另外，不必需要mRNA進入細胞核來進行它的功能，因而避免基于DNA的基因療法的主要障 礙。
[0006] 基于mRNA的基因療法在過去未更多使用的一個原因是mRNA的穩(wěn)定性比DNA小得 多，尤其在它到達細胞的細胞質(zhì)并且暴露于降解酶時。mRNA中的糖部分的第二碳上的羥基 的存在導致空間位阻，從而防止mRNA形成DNA的更穩(wěn)定雙螺旋結構，因而使得mRNA更傾向 于水解降解。因此，直到最近，廣泛地認為mRNA太不穩(wěn)定以致于不能經(jīng)受住轉(zhuǎn)染方案。
[0007] RNA穩(wěn)定修飾的進展引起在基因療法中使用mRNA代替質(zhì)粒DNA的更多關注。然 而，盡管修飾mRNA的穩(wěn)定性增加，但是在體內(nèi)以允許產(chǎn)生治療水平蛋白質(zhì)的方式將mRNA遞 送至細胞仍然是難題，尤其對于編碼全長蛋白質(zhì)的mRNA。使用將mRNA引入宿主中的病毒載 體來已經(jīng)獲得了一些成功，然而使用病毒載體的mRNA轉(zhuǎn)染可產(chǎn)生不利免疫響應。在一些情 況下，病毒載體甚至可整合至宿主基因組中。另外，臨床等級病毒載體的產(chǎn)生也昂貴并且費 時。所引入的遺傳物質(zhì)使用病毒載體的靶向遞送還可能難以控制。
[0008] mRNA的非病毒遞送可使用注射裸核酸、多聚復合物、脂質(zhì)復合物或脂質(zhì)體包埋 mRNA、經(jīng)由基因槍的生物彈射遞送、微粒載體介導遞送和電穿孔來實現(xiàn)。與遞送mRNA的病 毒載體相比，非病毒轉(zhuǎn)染或遞送媒介物總體上毒性更小、免疫原性更小，并且制備更容易和 更便宜。某些遞送媒介物，如陽離子脂質(zhì)或聚合物遞送媒介物還可有助于保護所轉(zhuǎn)染的 mRNA使之免于內(nèi)源性RNA酶。
[0009] 核酸的脂質(zhì)體遞送已經(jīng)用作實現(xiàn)基于經(jīng)包封的質(zhì)粒DNA、反義寡核苷酸、短干擾 RNA和微小RNA療法的位點特異性遞送的手段。然而，高效的、治療有效遞送mRNA至靶細胞 和組織以及隨后轉(zhuǎn)染這類靶細胞和組織仍然是技術難題，尤其對于遞送編碼全長蛋白質(zhì)的 mRNA。重要的是設計如下脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)，它提供到達所需靶細胞的足夠穩(wěn)定性和將其包 封材料有效地釋放至這類靶細胞以允許在治療有效水平下翻譯功能性蛋白質(zhì)的能力。
[0010] 用于構建這類基于脂質(zhì)體的遞送媒介物的許多陽離子脂質(zhì)在用于遞送治療有效 量的包封劑時對于靶細胞具有毒性。因此，與陽離子脂質(zhì)相關聯(lián)的毒性代表其一般用作非 病毒遞送媒介物的顯著障礙，尤其在將治療有效量的mRNA成功遞送至靶細胞所必需的數(shù) 量下。
[0011] 迄今為止，已經(jīng)在應用中獲得使用mRNA基因療法的顯著進展，尤其是低水平翻譯 并非限制因素的應用，如用編碼抗原的mRNA來免疫。涉及通過皮內(nèi)注射裸或魚精蛋白復合 mRNA來針對腫瘤抗原進行疫苗接種的臨床試驗已經(jīng)證明可行性、沒有毒性以及有希望的結 果。X. Su 等人，Mol. Pharmaceutics 8:774-787(2011)。然而，在需要 mRNA 編碼蛋白質(zhì)的 較高水平持續(xù)穩(wěn)定性以發(fā)揮長時間生物或治療效果的其它應用中，低水平翻譯可限制基于 mRNA的基因療法的利用。
[0012] 另外，因為如與基于DNA的基因療法相比，mRNA基因療法益處是相對瞬時的，經(jīng)常 需要重復施用，并且通常通過注射來提供長期效應。因此，在體內(nèi)更高效轉(zhuǎn)染和非侵入性和 /或在粘膜位點遞送mRNA的能力可改善成功應用mRNA基因療法的前景。
[0013] 概述
[0014] 本發(fā)明涵蓋以下意外發(fā)現(xiàn):mRNA的基于納米顆粒的制劑能夠在肺部遞送之后易 位，即，通過主動或被動方式從肺完整地移動至全身血液供給，并隨后沉積于不同非肺細胞 或組織，如例如肝中。包含編碼治療性蛋白如例如β -半乳糖苷酶的mRNA的納米顆粒的此 轉(zhuǎn)運構成活性藥物成分在肺部以外的非侵入性全身遞送，導致為全身可接近的非肺細胞或 組織產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì)。
[0015] 因此，本發(fā)明提供使用非侵入性肺部施用來遞送mRNA基因治療劑的方法。尤其， 本發(fā)明提供編碼蛋白質(zhì)的mRNA的遞送，其可用于治療和/或預防疾病的方法中。在一個具 體方面，本發(fā)明提供將信使RNA(mRNA)遞送至非肺細胞或組織的方法，其包括向肺部施用 包含編碼蛋白質(zhì)的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物，其中向肺部施用導致將mRNA和/或 蛋白質(zhì)遞送至非肺細胞或組織。
[0016] 在另一方面，本發(fā)明提供將治療性蛋白遞送至受試者的非肺細胞或組織的方法， 其包括向肺部施用包含編碼治療性蛋白的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物，以使得將治 療性蛋白遞送至非肺細胞或組織。
[0017] 在另一方面，本發(fā)明提供誘導在受試者的非肺細胞或組織中產(chǎn)生治療性蛋白的方 法，其包括向肺部施用包含編碼治療性蛋白的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物。
[0018] 在另一方面，本發(fā)明提供治療疾病或病癥的方法，其包括向肺部施用包含編碼治 療性蛋白的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物，其中施用至肺部導致將治療性蛋白遞送至 受疾病或病癥影響的非肺細胞或組織。
[0019] 在另一方面，本發(fā)明提供包含編碼蛋白質(zhì)的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的用于肺部 遞送信使RNA(mRNA)的組合物，其中配制所述組合物使得一旦其被施用至肺部，它導致將 mRNA和/或蛋白質(zhì)遞送至非肺細胞或組織。
[0020] 在一些實施方案中，組合物通過氣溶膠化來施用至肺部。在一些實施例中，組合物 通過氣管內(nèi)氣溶膠化來遞送至肺部。在一些實施方案中，組合物通過霧化來施用。在一些 實施方案中，組合物通過滴注來施用至肺部。在一些具體實施方案中，使用選自由以下組成 的組的設備將組合物施用至受試者的肺部：計量劑量吸入器、噴射霧化器、超聲波霧化器、 干粉吸入器、基于推進劑的吸入器或吹入器。
[0021] 在一些實施方案中，所述mRNA包括編碼一種或多種蛋白質(zhì)的多個mRNA種類。在一 些實施方案中，所述mRNA包括至少兩個mRNA種類，其各自編碼不同蛋白質(zhì)。在一些實施方 案中，所述mRNA編碼全長蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA編碼截短式的天然存在的 全長蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA以單一轉(zhuǎn)錄物的形式編碼一種或多種蛋白質(zhì)。 在一些實施方案中，所述mRNA編碼嵌合體蛋白質(zhì)，其中并非天然地與原生蛋白質(zhì)相關聯(lián)的 一條或多條蛋白質(zhì)序列在表達期間通過所得嵌合體蛋白質(zhì)中的肽鍵來連接。在一些實施方 案中，適合于本發(fā)明的mRNA具有或大于約0. 5kb、lkb、I. 5kb、2. 0kb、2. 5kb、3. 0kb、3. 5kb、 4. Okb、4. 5kb 或 5. Okb 的長度。
[0022] 在一些實施方案中，所述mRNA編碼胞內(nèi)蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA 編碼胞質(zhì)蛋白。在一些實施方案中，所述mRNA編碼與肌動蛋白細胞骨架相關聯(lián)的蛋白質(zhì)。 在一些實施方案中，所述mRNA編碼與質(zhì)膜相關聯(lián)的蛋白質(zhì)。在一些具體實施方案中，所述 mRNA編碼跨膜蛋白質(zhì)。在一些具體實施方案中，所述mRNA編碼離子通道蛋白質(zhì)。在一些實 施方案中，所述mRNA編碼核周蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA編碼核蛋白質(zhì)。在一 些具體實施方案中，所述mRNA編碼轉(zhuǎn)錄因子。在一些實施方案中，所述mRNA編碼伴侶蛋白 質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA編碼胞內(nèi)酶。在一些實施方案中，所述mRNA編碼涉及細 胞代謝、DNA修復、轉(zhuǎn)錄和/或翻譯的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA編碼細胞外蛋 白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA編碼與細胞外基質(zhì)相關聯(lián)的蛋白質(zhì)。在一些實施方案 中，所述mRNA編碼分泌蛋白。
[0023] 在一些實施方案中，所述mRNA編碼在表1、2、3或4中列出的蛋白質(zhì)（即治療性蛋 白）。在一些具體實施方案中，所述蛋白質(zhì)選自由以下組成的組：α半乳糖苷酶、促紅細胞 生成素 、α 1-抗胰蛋白酶、羧肽酶N、a-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫酸酯酶、N-乙 酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、溶酶體酸脂肪酶、芳基硫酸酯酶-A α -氨 基葡糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫酸酯酶、β -葡 萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖醛酸酶、葡糖腦苷酯酶、乙酰 肝素磺酰胺酶（heparan sulfamidase)、透明質(zhì)酸酶、半乳糖腦苷醋酶、人生長激素、鳥氨酸 轉(zhuǎn)氨甲酰酶（OTC)、氨基甲酰磷酸合成酶-I (CPSl)、精氨琥珀酸合成酶-I (ASSl)、精氨琥珀 酸裂解酶（ASL)、精氨酸酶-I(ARGl)、囊性纖維化跨膜傳導調(diào)控蛋白（CFTR)、因子VII、因子 VIII、因子IX、乙酰肝素-N-硫酸酯酶及其組合。在一些具體實施方案中，所述蛋白質(zhì)是選 自由以下組成的組的細胞內(nèi)或跨膜蛋白質(zhì)：鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（OTC)、氨基甲酰磷酸合成 酶-I (CPSl)、精氨琥珀酸合成酶-I (ASSl)、精氨琥珀酸裂解酶（ASL)、精氨酸酶-I (ARGl)、 囊性纖維化跨膜傳導調(diào)控蛋白（CFTR)及其組合。
[0024] 在一些實施方案中，所述mRNA編碼與表4中列出的疾病或病癥（即，適應癥）相 關聯(lián)的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，用于所述方法中的蛋白質(zhì)基于它的預防、治療和/或治 愈受表4中列出的疾病或病癥（即適應癥）影響的受試者的能力來選擇。在具體的實施方 案中，所述疾病或病癥選自由以下組成的組：SMNl相關脊髓性肌萎縮（SM)，肌萎縮性側索 硬化癥（ALS)，GALT相關半乳糖血癥，囊性纖維化（CF)，SLC3A1相關的病癥，胱氨酸尿癥， COL4A5相關的病癥，奧爾波特綜合征（Alport syndrome)，半乳糖腦苷醋酶缺乏，X-連鎖的 腦白質(zhì)腎上腺萎縮癥，腎上腺脊髓神經(jīng)病，弗里德賴希共濟失調(diào)（Friedreich' s ataxia)， 佩利措伊斯-梅茨巴赫?。≒elizaeus-Merzbacher disease)，TSCl或TSC2相關結節(jié)性硬 化癥，桑菲列普B綜合征（Sanfilippo B syndrome) (MPS IIIB)，CTNS相關胱氨酸病，F(xiàn)MRl 相關的病癥，包括脆性X綜合征、脆性X相關震顫/共濟失調(diào)綜合征、脆性X卵巢早衰綜合 征，普拉德-威利綜合征（Prader-Willi syndrome)，法布里病（Fabry disease)，遺傳性出 血性毛細血管擴張癥（AT)、尼曼-匹克病Cl型，神經(jīng)元蠟樣脂褐質(zhì)沉積癥相關的疾病，幼 年神經(jīng)元賭樣脂褐質(zhì)沉積癥（JNCL)、幼年巴登氏?。↗uvenile Batten disease)，桑-哈 二氏?。⊿antavuori-Haltia disease)，詹-比二氏病（Jansky-Bielschowsky disease)， PTT-I缺乏癥，TPPl缺乏癥，EIF2B1，EIF2B2, EIF2B3, EIF2B4和EIF2B5相關的兒童共濟失 調(diào)伴中樞神經(jīng)系統(tǒng)髓鞘化不良/白質(zhì)消融，CACNA1A和CACNB4相關發(fā)作性共濟失調(diào)2型， MECP2相關的病癥，經(jīng)典雷特綜合征（Classic Rett Syndrome)，MECP2相關重癥新生兒腦 病，PPM-X綜合征，⑶KL5相關非典型雷特綜合征，肯尼迪?。↘ennedy' s disease) (SBM)， Notch-3相關腦常染色體顯性動脈病伴皮質(zhì)下梗死和腦白質(zhì)?。–ADASIL)，SCNlA和SCNlB 相關癲癇癥，聚合酶G相關的病癥，Alpers-Huttenlocher綜合征，POLG相關感覺共濟失調(diào) 性神經(jīng)病，構音障礙，眼肌癱瘓，常染色體顯性和隱性漸進眼外肌麻痹伴線粒體DNA缺失，X 連鎖的腎上腺發(fā)育不良，X連鎖丙種球蛋白缺乏血癥，威爾森氏癥（Wilson' s disease)，和 凝血病癥。
[0025] 在一些實施方案中，遞送至肺之后，所述mRNA和/或蛋白質(zhì)被遞送至非肺組織。在 一些實施方案中，非肺組織包括除了肺之外的身體的任何器官和/或器官系統(tǒng)。在一些具 體實施方案中，非肺組織選自由以下組成的組：心、肝、脾、腎、骨骼肌、淋巴節(jié)、大腦皮膚、腦 脊液、血漿及其組合。在一些具體實施方案中，非肺組織是肝。在一些具體實施方案中，非 肺組織是心。在一些具體實施方案中，非肺組織是脾。
[0026] 在一些實施方案中，遞送至肺之后，所述mRNA和/或蛋白質(zhì)被遞送至非肺細胞。在 一些實施方案中，非肺細胞選自由以下組成的組：肝細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、 內(nèi)皮細胞、骨細胞、干細胞、間質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、心臟細胞、脂肪細胞、血管平滑肌細胞、心 肌細胞、骨骼肌細胞、β細胞、垂體細胞、滑液襯里細胞、卵巢細胞、睪丸細胞、成纖維細胞、B 細胞、T細胞、網(wǎng)織紅細胞、白細胞、粒細胞、腫瘤細胞、巨噬細胞、嗜中性粒細胞、抗原呈遞細 胞（樹突狀細胞）、成纖維細胞及其組合。在一些具體實施方案中，非肺細胞是肝細胞。
[0027] 在一些實施方案中，所述mRNA和/或蛋白質(zhì)可在施用至肺之后至少約4小時、6小 時、8小時、10小時、12小時、18小時、24小時或更長時間在非肺細胞和/或組織中檢測到。 在一些實施方案中，所述mRNA和/或蛋白質(zhì)可在施用至肺之后至少約1天、2天、3天、4天、 5天、6天、7天、8天、9天或10天在非肺細胞和/或組織中檢測到。在一些實施方案中，所 述mRNA和/或蛋白質(zhì)可在施用至肺之后至少約1周、2周、3周、4周、5周或6周在非肺細 胞和/或組織中檢測到。在一些實施方案中，所述mRNA使用選自由以下組成的組的方法來 檢測到：原位雜交、RT-PCR、實時RT-PCR、RNA印跡、核酸酶保護測定及其組合。在一些實施 方案中，所述蛋白質(zhì)使用選自由以下組成的組的方法來檢測到：蛋白質(zhì)印跡、ELISA、免疫沉 淀反應、BCA測定、免疫組織化學及其組合。
[0028] 在一些實施方案中，所述mRNA以每劑量大于約0. 5mg/kg(例如，大于約I. Omg/ kg、l. 5mg/kg、2. 0mg/kg、2. 5mg/kg、3. 0mg/kg、4. 0mg/kg、5. 0mg/kg、6. 0mg/kg、7. Omg/kg、 8. 0mg/kg、9. Omg/kg或10. Omg/kg)體重的mRNA量來遞送。在一些實施方案中，所述mRNA以 每劑量約 〇· l_l〇〇mg/kg(例如，約 0· l_90mg/kg、0· l_80mg/kg、0· l_70mg/kg、0· l_60mg/kg、 0· l_50mg/kg、0· l_40mg/kg、0· l_30mg/kg、0· l_20mg/kg、0· 1-lOmg/kg)體重范圍內(nèi)的 mRNA 量來遞送。在一些實施方案中，所述mRNA以每劑量或大于約lmg、5mg、10mg、15mg、20mg、 25mg、30mg、35mg、40mg、45mg、50mg、55mg、60mg、65mg、70mg、75mg、80mg、85mg、90mg、95mg、 100mg、150mg、200mg、250mg、300mg、350mg、400mg、450mg 或 500mg 的量來遞送。
[0029] 在一些實施方案中，所述mRNA包封于單一脂質(zhì)載體媒介物中。在一些實施方案 中，所述mRNA包封于一種或多種脂質(zhì)載體媒介物中。在一些實施方案中，所述mRNA包封于 一種或多種脂質(zhì)載體媒介物中，所述媒介物在其脂質(zhì)組成、脂質(zhì)組分的摩爾比、尺寸、電荷 (ζ電勢）、靶向配體及其組合方面不同。
[0030] 在一些實施方案中，脂質(zhì)載體媒介物是脂質(zhì)體。在一些實施方案中，脂質(zhì)體包括一 種或多種陽離子脂質(zhì)、一種或多種非陽離子脂質(zhì)、一種或多種基于膽固醇的脂質(zhì)和一種或 多種PEG修飾的脂質(zhì)。在一些實施方案中，一種或多種陽離子脂質(zhì)是可電離脂質(zhì)。在一些 實施方案中，一種或多種陽離子脂質(zhì)是可裂解脂質(zhì)。在一些實施方案中，一種或多種陽離子 脂質(zhì)是膽固醇衍生陽離子脂質(zhì)。在一些實施方案中，一種或多種陽離子脂質(zhì)選自C12-200、 HGT4003、HGT5000、HGT5001、RE-1、RE-2、RE-3、ICE、GL-67、DLinKC2-DMA、DODAP、D0DMA、 DLinDMA、CLinDMA 及其組合。
[0031] 在一些實施方案中，所述組合物還包含肺表面活性劑。在一些實施方案中，所述組 合物被配制為可呼吸的顆粒。在一些實施方案中，可呼吸的顆粒的尺寸小于約500 μπι(例 如，小于約 450 μ m、400 μ m、350 μ m、300 μ m、250 μ m、200 μ m、150 μ m、100 μ m 或 50 μ m)。在 一些實施方案中，所述組合物被配制為可霧化脂質(zhì)。在一些實施方案中，所述組合物被配制 為干粉。
[0032] 在各種實施方案中，本發(fā)明還提供在將信使RNA(mRNA)遞送至非肺細胞或組織的 方法中使用的如本文描述的包含編碼蛋白質(zhì)的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物，其中所 述方法包括將組合物施用至受試者的肺部的步驟，并且另外其中向肺部施用導致將mRNA 和/或蛋白質(zhì)遞送至非肺細胞或組織。
[0033] 在各種實施方案中，本發(fā)明提供在將治療性蛋白遞送至非肺細胞或組織的方法中 使用的如本文描述的包含編碼蛋白質(zhì)的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物，其中所述方法 包括將組合物施用至受試者的肺部的步驟。
[0034] 在各種實施方案中，本發(fā)明提供在誘導蛋白質(zhì)在非肺細胞或組織中產(chǎn)生的方法中 使用的如本文描述的包含編碼蛋白質(zhì)的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物，其中所述方法 包括將組合物施用至肺的步驟。
[0035] 在各種實施方案中，本發(fā)明提供用于治療疾病或病癥的如本文描述的包含編碼蛋 白質(zhì)的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物，其中所述方法包括將組合物施用至肺的步驟，并 且另外其中向肺部施用導致將mRNA和/或蛋白質(zhì)遞送至受疾病或病癥影響的非肺細胞或 組織。
[0036] 如本申請中使用，術語"約"和"大約"可作為等效形式使用。在本申請中具有或 不具有約/大約來使用的任何數(shù)字意欲涵蓋相關領域普通技術人員了解的任何正常波動。
[0037] 本發(fā)明的其它特征、目標和優(yōu)勢在以下詳細說明中是顯而易知的。然而，應了解， 詳細說明，雖然指示本發(fā)明的實施方案，但是只為了說明來給出，不具有限制性。本發(fā)明范 圍內(nèi)的各種變化和修飾根據(jù)詳細說明為本領域技術人員顯而易知的。
[0038] 附圖簡述
[0039] 圖1展示氣管內(nèi)（IT)噴射施加后6小時的小鼠的生物發(fā)光成像（BLI)。⑷圖1、 2、3展示用裸FFL mRNA治療的小鼠中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生，與圖4、5、6中的C12-200:D0PE:膽固 醇：01?^^62000(40:30:25:5)納米顆粒（即）中的？?1^1111?隱治療的小鼠中的蛋白質(zhì)產(chǎn)生 比較。⑶圖1、2 (裸修飾的FFL mRNA)與圖3、4、5 (基于C12-200的NP中的經(jīng)修飾的FFL mRNA)相比。
[0040] 圖2展示使用BLI，IT噴射施加后6小時的BLI。圖1、2、3(基于C12-200的NP中 的FFL mRNA)與圖4、5、6(基于C12-200的NP中的經(jīng)修飾的FFL mRNA)相比。
[0041] 圖3展示IT噴射施加后的小鼠的BLI圖像。（A)所有小鼠（基于C12-200的NP 中的FFL mRNA) ;24小時之后的圖1、2、3與6小時之后的圖4、5、6相比。（B)所有小鼠（基 于C12-200的NP中的經(jīng)修飾的FFL mRNA) ;24小時之后的圖1、2與6小時之后的圖3、4、 5相比。（C)圖1、2(基于C12-200的NP中的FFL mRNA)與24小時之后的圖3、4、5(基于 C12-200的NP中的經(jīng)修飾的FFL mRNA)相比。
[0042] 圖4展示施加后24小時用裸FFL mRNA治療的小鼠的BLI圖像。圖1、2 (第一施 加之后24小時）；圖3、4 (第二施加之后24小時）；圖5、6 (第三施加之后24小時）。
[0043] 圖5展示施加后24小時用裸修飾的FFL mRNA治療的小鼠的BLI圖像。圖（第一 施加之后24小時）；圖3、4 (第二施加之后24小時）；圖5、6 (第三施加之后24小時）。
[0044] 圖6展示IT噴射施加后6小時的小鼠的BLI圖像。（A)圖1、2(基于C12-200的 NP 中的 FFL mRNA (10 μ g/ 小鼠））；圖 3、4 (基于 C12-200 的 NP 中的 FFL mRNA (5 μ g/ 小 鼠）。⑶圖1 (基于C12-200的NP中的經(jīng)修飾的FFL mRNA (10 μ g/小鼠））；圖2、3 (基于 C12-200的NP中的經(jīng)修飾的FFL mRNA (5 μ g/小鼠）。
[0045] 圖7展示以10 μ g/小鼠的劑量IT噴射施加后6小時和24的小鼠的BLI圖像。（A) 所有小鼠（基于C12-200的NP中的FFL mRNA);圖1、2(24小時）；圖3、4(6小時）。⑶所 有小鼠（基于C12-200的NP中的經(jīng)修飾的FFL mRNA);圖1 (24小時）；圖2 (6小時）。（C) IT噴射后24小時圖1、2(基于C12-200的NP中的FFL mRNA)與圖3(基于C12-200的NP 中的經(jīng)修飾的FFL mRNA)的比較。
[0046] 圖8展示IT噴射后5或10 μ g/小鼠劑量下的基于C12-200的NP中的FFL和經(jīng) 修飾的FFL mRNA的生物分布。
[0047] 圖9展示IT噴射施加后6小時的小鼠的BLI圖像。圖1、2、3(基于C12-200的NP 中的經(jīng)修飾的FFL mRNA);圖4、5 (基于HGT5001的NP中的經(jīng)修飾的FFL mRNA)
[0048] 圖 10 展示 IOyg/小鼠劑量的 HGT5001:D0PE:膽固醇：DMG-PEG2000(40:20:35:5) 納米顆粒中的經(jīng)修飾的FFL mRNA的IT噴射施加后6小時（圖1、2)和24小時（圖3、4) 的小鼠的BLI圖像。
[0049] 圖11展示IT噴射施加后24小時的小鼠的BLI圖像。（A)去除皮毛的小鼠（基 于C12-200的NP中的經(jīng)修飾的FFL mRNA)。⑶皮毛完整的小鼠（基于C12-200的NP中 的經(jīng)修飾的FFL mRNA)。
[0050] 圖12展示包封mRNA的脂質(zhì)納米顆粒制劑，C12-200:D0PE:膽固 醇：DMG-PEG2000(40:30:25:5)和 HGT5001:D0PE:膽固醇：DMG-PEG2000(40:20:35:5)的單 一、靜脈內(nèi)注射治療之后在小鼠的肺、肝中檢測到的FFL發(fā)光。小鼠在施用后6小時和24 小時處死。
[0051] 圖13展示用基于PEI的NP中的經(jīng)修飾的FFL mRNA(圖1、2)和FFL mRNA(圖3、 4)霧化后6小時的小鼠的BLI圖像。
[0052] 定義
[0053] 為了更加容易地理解本公開，以下首先對某些術語進行定義。用于以下術語和其 它術語的另外的定義將在整個說明書中闡述。
[0054] 氨基酸：如本文所使用，術語"氨基酸"，在它的最廣泛含義下，是指可并入多肽鏈 中的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實施方案中，氨基酸具有一般結構H 2N-C(H) (R)-C00H。在一些實施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些實施方案中，氨基酸是合成 氨基酸；在一些實施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些實施方案中，氨基酸是1-氨基酸。 "標準氨基酸"是指普遍地在天然存在的肽中發(fā)現(xiàn)的二十種標準1-氨基酸中的任何一種。 "非標準氨基酸"是指除了標準氨基酸以外的任何氨基酸，不論它是合成制備還是從天然來 源獲得。如本文所使用，"合成氨基酸"涵蓋化學修飾的氨基酸，包括但不限于鹽、氨基酸衍 生物（如酰胺）和/或取代。氨基酸，包括肽中的羧基末端氨基酸和/或氨基末端氨基酸， 可通過以下方式來修飾：甲基化、酰胺化、乙?；⒈Ｗo基團和/或用可改變肽的循環(huán)半衰 期而不有害地影響其活性的其它化學基團來取代。氨基酸可參與二硫鍵。氨基酸可包含一 種或翻譯后修飾，如與一個或多個化學實體（例如，甲基、醋酸根、乙?；?、磷酸根、甲酸基 部分、類異戊二烯基團、硫酸根、聚乙二醇部分、脂質(zhì)部分、碳水化合物部分、生物素部分等） 相聯(lián)。術語"氨基酸"可與"氨基酸殘基"互換使用，并且可意指游離氨基酸和/或肽的氨 基酸殘基。從術語所使用的上下文顯而易知它是指游離氨基酸還是肽的殘基。
[0055] 動物：如本文所使用，術語"動物"是指動物界的任何成員。在一些實施方案中，"動 物"是指在任何發(fā)育階段下的人。在一些實施方案中，"動物"是指在任何發(fā)育階段下的非 人動物。在某些實施方案中，非人動物為哺乳動物（例如，嚙齒動物、小鼠、大鼠、兔、猴、狗、 貓、綿羊、牛、靈長類動物或豬）。在一些實施方案中，動物包括但不限于哺乳動物、鳥類、爬 行動物、兩棲動物、魚、昆蟲以及蠕蟲。在一些實施方案中，動物可為轉(zhuǎn)基因動物、遺傳工程 化的動物和/或克隆。
[0056] 大約或約：如本文所使用，在應用于一個或多個目標值時，術語"大約"或"約"是 指類似于所說明的參考值的值。在某些實施方案中，術語"大約"或"約"是指在所說明的參 考值的任一方向上的（大于或小于）25%、20%、19%、18%、17%、16%、15%、14%、13%、 12%、11%、10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%或更小范圍內(nèi)的值范圍，除非另 外說明或以另外從上下文顯而易見（除了這樣的數(shù)字將超過可能值的100% )。
[0057] 給藥方案：如本文所使用的術語"給藥方案"（或"治療方案"）為通常按時間段分 開而單獨向受試者施用的一組單位劑量（通常多于一個）。在一些實施方案中，給定的治療 劑具有建議的給藥方案，所述給藥方案可以涉及一個或多個劑量。在一些實施方案中，給藥 方案包括多個劑量，所述多個劑量中的每一個彼此按相同長度的時間段分開；在一些實施 方案中，給藥方案包括多個劑量和使單獨劑量分開的至少兩個不同的時間段。
[0058] 表達：如本文所使用，核酸序列的"表達"是指以下事件中的一個或多個：（1)從 DNA序列產(chǎn)生RNA模板（例如，通過轉(zhuǎn)錄）；（2)加工RNA轉(zhuǎn)錄物（例如，通過剪接、編輯、5' 帽形成和/或3'端形成）；（3)RNA翻譯成多肽或蛋白質(zhì)；和/或（4)多肽或蛋白質(zhì)的翻譯 后修飾。在本申請中，術語"表達"和"產(chǎn)生"及語法等效物可互換地使用。
[0059] 改進、增加或減少：如本文所使用，術語"改進"、"增加"或"減少"或語法等效物指 示相對于基線測量的值，如在開始本文所述治療之前的同一個體中的測量，或不存在本文 所述治療時的對照受試者（或多個對照受試者）中的測量。"對照受試者"是與所治療受試 者大約相同年齡的罹患與所治療受試者相同形式疾病的受試者。
[0060] 體外：如本文所使用，術語"體外"是指發(fā)生在人工環(huán)境中，例如試管或反應容器 中、細胞培養(yǎng)物等中，而不是在多細胞生物體內(nèi)的事件。
[0061] 體內(nèi)：如本文所使用，術語"體內(nèi)"是指在多細胞生物體，如人和非人類動物內(nèi)發(fā)生 的事件。在基于細胞的系統(tǒng)的情況下，該術語可用于意指在活細胞（如例如體外系統(tǒng)相反） 內(nèi)發(fā)生的事件。
[0062] 信使RNA (mRNA):如本文所使用，術語"信使RNA (mRNA) "是指編碼至少一個多肽的 多核苷酸。如本文所使用的mRNA涵蓋修飾和未修飾的RNA。mRNA可含有一個或多個編碼 和非編碼區(qū)域。
[0063] 核酸：如本文所使用，術語"核酸"，在它的最廣泛含義下，是指并入或可并入多核 苷酸鏈中的任何化合物和/或物質(zhì)。在一些實施方案中，核酸是經(jīng)由磷酸二酯鍵并入或可 并入多核苷酸鏈中的化合物和/或物質(zhì)。在一些實施方案中，"核酸"是指個別核酸殘基（例 如，核苷酸和/或核苷）。在一些實施方案中，"核酸"是指包括個別核酸殘基的多核苷酸鏈。 在一些實施方案中，"核酸"涵蓋RNA以及單鏈和/或雙鏈DNA和/或cDNA。此外，術語"核 酸"、"DNA"、"RNA"和/或類似術語包括核酸類似物，S卩，具有除了磷酸二酯骨架以外的類似 物。舉例來說，本領域中已知并且在骨架中具有肽鍵代替磷酸二酯鍵的所謂"肽核酸"被認 為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。術語"編碼氨基酸序列的核苷酸序列"包括彼此為簡并型式和/或 編碼相同氨基酸序列的所有核苷酸序列。編碼蛋白質(zhì)和/或RNA的核苷酸序列可包括內(nèi)含 子。核酸可從天然來源純化、使用重組表達系統(tǒng)來產(chǎn)生并且任選地純化、化學合成等。在適 當情況下，例如，在化學合成分子的情況下，核酸可包括核苷類似物如具有化學修飾堿基或 糖、骨架修飾等的類似物。除非另外指示，否則核酸序列以5'至3'方向來呈現(xiàn)。在一些實 施方案中，核酸是或包括天然核苷（例如，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿苷、脫氧腺苷、脫氧胸 苷、脫氧鳥苷和脫氧胞苷）；核苷類似物（例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并-嘧 啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿 苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基 腺苷、7-脫氮腺苷、7-脫氮鳥苷、8-氧代腺苷、8-氧代鳥苷、O (6)-甲基鳥嘌呤和2-硫代胞 苷）；化學修飾的堿基；生物修飾的堿基（例如，甲基化堿基）；夾層堿基；經(jīng)修飾的糖（例 如，2'-氟核糖、核糖、2'-脫氧核糖、阿拉伯糖和己糖）；和/或經(jīng)修飾的磷酸根（例如，硫 代磷酸酯和5'-N-亞磷酰胺鍵）。在一些實施方案中，本發(fā)明尤其針對"未修飾的核酸"，意 指未被化學修飾以便促進或?qū)崿F(xiàn)遞送的核酸（例如，多核苷酸和殘基，包括核苷酸和/或核 苷）。
[0064] 受試者：如本文所使用，術語"受試者"或"患者"是指例如出于實驗、診斷、預防和 /或治療目的可向其施用根據(jù)提供的組合物的任何生物體。典型患者包括動物（例如，哺乳 動物如小鼠、大鼠、兔、非人靈長類動物和/或人）。在某些實施方案中，患者為人。人包括 出生前和出生后形式。
[0065] 藥學上可接受的：如本文所使用的短語"藥學上可接受的"是指在合理醫(yī)學判斷范 圍內(nèi)、適用于與人類和動物接觸而沒有過量毒性、刺激、過敏反應或其它問題或并發(fā)癥、與 合理的利益/風險比相稱的物質(zhì)。
[0066] 多肽：如本文所使用，"多肽"，一般來說，是通過肽鍵來彼此連接的至少兩個氨基 酸的串。在一些實施方案中，多肽可包括至少3-5氨基酸，各自經(jīng)由至少一個肽鍵來連接至 其它氨基酸。本領域普通技術人員將了解多肽有時包括"非天然"氨基酸或仍然能夠任選 地合并至多肽鏈中的其它實體。
[0067] 蛋白質(zhì)：如本文所使用，術語"治療性蛋白"的"蛋白質(zhì)"是指多肽（即，通過肽鍵 來彼此連接的至少兩個氨基酸的串）。蛋白質(zhì)可包括除了氨基酸以外的部分（例如，可為糖 蛋白、蛋白聚糖等）和/或可另外加工或修飾。本領域普通技術人員將了解"蛋白質(zhì)"可為 如由細胞產(chǎn)生的完整多肽鏈（具有或不具有信號序列），或可為其特征部分。本領域普通 技術人員將了解蛋白質(zhì)有時可包括一條以上多肽鏈，例如由一個或多個二硫鍵連接或通過 其它方式相聯(lián)。多肽可含有1-氨基酸、d-氨基酸或兩者并且可含有在本領域中已知的各 種氨基酸修飾或類似物中的任何一種。有用修飾包括例如末端乙?；?、酰胺化、甲基化等。 在一些實施方案中，蛋白質(zhì)可包括天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其組合。術語 "肽"一般用于意指具有小于約100個氨基酸、小于約50個氨基酸、小于20個氨基酸或小于 10個氨基酸的長度的多肽。在一些實施方案中，蛋白質(zhì)是抗體、抗體片段、其生物活性部分 和/或其特征部分。
[0068] 受試者：如本文所使用，術語"受試者"是指人或任何非人類動物（例如，小鼠、大 鼠、兔、犬、貓、牛、豬、綿羊、馬或靈長類動物）。人包括出生前和出生后形式。在許多實施方 案中，受試者是人類。受試者可為患者，是指送至醫(yī)療服務提供者以診斷或治療疾病的人。 術語"受試者"在本文中可與"個體"或"患者"互換使用。受試者可罹患或易患疾病或病癥 但是可顯示或可不顯示疾病或病癥的癥狀。
[0069] 治療有效量：如本文所使用，術語治療劑的"治療有效量"意指在施用至遭受或易 患疾病、病癥和/或疾患的受試者時足以治療、診斷、預防疾病、病癥和/或疾患的癥狀和/ 或延遲其發(fā)作的量。本領域普通技術人員將認識到治療有效量通常經(jīng)由包括至少一個單位 劑量的給藥方案來施用。
[0070] 治療：如本文所使用，術語"治療（treatment)"（還有"治療（treat)"或"治療 (treating)"）是指任何施用物質(zhì)（例如，提供的組合物）部分或完全減輕、改善、緩解、抑 制、延遲特定疾病、病癥和/或疾患（例如，流感）的發(fā)作，減少其嚴重性，和/或減少其一 個或多個癥狀、特征和/或病因的發(fā)生。這類治療可針對不展現(xiàn)相關疾病、病癥和/或疾患 的病征的受試者和/或只表現(xiàn)疾病、病癥和/或疾患的早期病征的受試者?；蛘呋蛄硗?，這 類治療可針對表現(xiàn)相關疾病、病癥和/或疾患的一個或多個確立病征的受試者。在一些實 施方案中，治療可針對已經(jīng)診斷為患有相關疾病、病癥和/或疾患的受試者。在一些實施方 案中，治療可針對受試者已知具有與患上相關疾病、病癥和/或疾患的風險增加統(tǒng)計相關 聯(lián)的一個或多個易感性因素。
[0071] 詳述
[0072] 本發(fā)明尤其提供基于肺部遞送來全身遞送mRNA和/或它的蛋白質(zhì)產(chǎn)物的方法和 組合物。在一些實施方案中，本發(fā)明提供將包含mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物施用至受 試者的肺，以將所述mRNA和/或蛋白質(zhì)遞送至非肺細胞和組織的方法。在一些實施方案中， 遞送編碼單一蛋白質(zhì)的mRNA。在一些實施方案中，遞送編碼一種或多種蛋白質(zhì)的一個或多 個mRNA種類。在一些實施方案中，所述mRNA使用單一脂質(zhì)載體媒介物（例如脂質(zhì)體或脂 質(zhì)衍生納米顆粒）來遞送。在一些實施方案中，所述mRNA使用一種或多種脂質(zhì)載體媒介物 來遞送。
[0073] 本發(fā)明的各種方面在以下章節(jié)中更詳細地描述。章節(jié)的使用不意欲限制本發(fā)明。 每個章節(jié)可適用于本發(fā)明的任何方面。在本申請中，除非另外陳述，否則使用"或"意指"和 /或"。
[0074] mRNA 和 mRNA 合成
[0075] 根據(jù)本發(fā)明的mRNA可根據(jù)各種已知方法中的任何一種來合成。舉例來說，根據(jù)本 發(fā)明的mRNA可經(jīng)由體外轉(zhuǎn)錄（IVT)來合成。簡單地說，IVT通常用含有啟動子的線性或環(huán) 狀DNA模板、核糖核苷三磷酸的匯集物、可包括DTT和鎂離子的緩沖系統(tǒng)，和適當?shù)腞NA聚 合酶（例如，T3、T7或SP6RNA聚合酶）、DNA酶I、焦磷酸酶和/或RNA酶抑制劑來進行。確 切條件將根據(jù)具體應用而變化。
[0076] 在一些實施方案中，為了制備根據(jù)本發(fā)明的mRNA，在體外轉(zhuǎn)錄DNA模板。合適的 DNA模板通常具有用于體外轉(zhuǎn)錄的啟動子（例如T3、T7或SP6啟動子），隨后是用于所需 mRNA的所需核苷酸序列以及終止信號。
[0077] 可使用標準方法確定根據(jù)本發(fā)明的所需mRNA序列并將其并入DNA模板中。舉例 來說，從所需氨基酸序列開始，虛擬逆翻譯基于簡并遺傳密碼來進行。然后，最佳化算法可 用于選擇合適密碼子。典型地，一方面，G/C含量可被優(yōu)化以獲得最高可能G/C含量，另一 方面，根據(jù)密碼子使用，最好可能考慮到tRNA頻率。經(jīng)優(yōu)化的RNA序列可被確立并例如借 助于適當顯示設備來顯示并且與原始（野生型）序列比較。還可分析次級結構以計算穩(wěn)定 和去穩(wěn)定性質(zhì)或相應地RNA區(qū)域。
[0078] 根據(jù)本發(fā)明的mRNA可被合成為未修飾或經(jīng)修飾的mRNA。在一些實施方案中，所述 mRNA可包括一種或多種化學或結構修飾以消除所述mRNA與toll樣受體TLR3、TLR7、TLR8 及類視黃醇可誘導基因 I(RIG-I)相互作用以減少免疫原性以及改進所述mRNA穩(wěn)定性。
[0079] 舉例來說，在某些實施方案中，所述mRNA可按美國專利公布2009/0286852(以引 用方式并入本文）的描述來修飾，以包括一個或多個假尿苷殘基。Kormann等人，Nature Biotechnology 29(2):154-157(2011)描述了尿苷和胞苷替換成2-硫代尿苷和5-甲基胞 苷以協(xié)同降低mRNA結合至模式識別受體TLR3、TLR7、TLR8和RIG-I并且增加所述mRNA的 穩(wěn)定性。參見EP2459231。在其它實施方案中，所述mRNA可被修飾以減少免疫原性，如歐洲 申請EP10742089(以引用方式并入本文）所描述的那樣。
[0080] 在其它實施方案中，所述mRNA的修飾可包含例如RNA的核苷酸的修飾。因此，根 據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的mRNA可包含例如骨架修飾、糖修飾或堿基修飾。在一些實施方案中， 編碼目的蛋白質(zhì)的mRNA可從天然存在的核苷酸和/或核苷酸類似物（經(jīng)修飾的核苷酸） 合成，所述核苷酸包括但不限于，嘌呤（腺嘌呤（A)、鳥嘌呤（G))或嘧啶（胸腺嘧啶（T)、 胞嘧啶（C)、尿嘧啶（U))和作為經(jīng)修飾的核苷酸類似物或嘌呤和嘧啶的衍生物，如例如 1-甲基-腺嘌呤，2-甲基-腺嘌呤，2-甲硫基-N-6-異戊烯基-腺嘌呤，N6-甲基-腺嘌 呤，N6-異戊烯基-腺嘌呤，2-硫代-胞嘧啶，3-甲基-胞嘧啶，4-乙?；?胞嘧啶，5-甲 基-胞嘧啶，2, 6-二氨基嘌呤，1-甲基-鳥嘌呤，2-甲基-鳥嘌呤，2, 2-二甲基-鳥嘌呤， 7-甲基-鳥嘌呤，肌苷，1-甲基-肌苷，假尿嘧啶（5-尿嘧啶），二氫-尿嘧啶，2-硫代-尿 嘧啶，4-硫代-尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-2-硫代-尿嘧啶，5-(羧基羥甲基）-尿嘧啶， 5-氟-尿嘧啶，5-溴-尿嘧啶，5-羧甲基氨甲基-尿嘧啶，5-甲基-2-硫代-尿嘧啶，5-甲 基-尿嘧啶，N-尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯，5-甲基氨甲基-尿嘧啶，5-甲氧基氨甲基-2-硫 代-尿嘧啶，5'-甲氧羰基甲基-尿嘧啶，5-甲氧基-尿嘧啶，尿嘧啶-5-羥基乙酸甲酯， 尿嘧啶-5-羥基乙酸（v)，l-甲基-假尿嘧啶，辮苷，.β.-D-甘露糖基-辮苷，懷丁氧苷 (wybutoxosine)和氨基磷酸酯，硫代磷酸酯，肽核苷酸，甲基膦酸酯，7-脫氮鳥苷，5-甲基 胞嘧啶和肌苷。這類類似物的制備為本領域技術人員經(jīng)由以下文獻已知，例如美國專利 No. 4, 373, 071、美國專利 No. 4, 401，796、美國專利 No. 4, 415, 732、美國專利 No. 4, 458, 066、 美國專利No. 4, 500, 707、美國專利No. 4, 668, 777、美國專利No. 4, 973, 679、美國專利 No. 5, 047, 524、美國專利 No. 5, 132, 418、美國專利 No. 5, 153, 319、美國專利 No. 5, 262, 530 和5, 700, 642,其公開內(nèi)容以引用方式以它的全部范圍包含在本文中。參見G. Tavernier等 人，J. Controlled Release 150:238-247(2011)和 WO 2010/053572,其以引用方式并入本 文。還參見US 2009/0286852,其在Μ 55和68-75提供了經(jīng)修飾的核苷的廣泛列表，和WO 2008/052770(以引用方式并入本文），其描述了增加 mRNA穩(wěn)定性和蛋白質(zhì)產(chǎn)生的許多mRNA 修飾。
[0081] 在一些實施方案中，mRNA可含有RNA骨架修飾。典型地，骨架修飾是RNA中所包 含的核苷酸的骨架的磷酸酯被化學修飾的修飾。示例性骨架修飾通常包括但不限于來自由 以下組成的組的修飾：甲基膦酸酯、甲基氨基磷酸酯、氨基磷酸酯、硫代磷酸酯（例如胞苷 5'-0-(1-硫代磷酸酯））、硼烷磷酸酯、帶正電荷的胍鑰基等，這意味著磷酸二酯鍵由其它 陰離子、陽離子或中性基團來替換。
[0082] 在一些實施方案中，mRNA可含有糖修飾。典型糖修飾是它含有的核苷酸的糖的化 學修飾，包括但不限于，選自由以下組成的組的糖修飾：2' -脫氧-2' -氟-寡核糖核苷酸 (2' -氟-2' -脫氧胞苷5' -三磷酸，2' -氟-2' -脫氧尿苷5' -三磷酸），2' -脫氧-2' -脫 胺-寡核糖核苷酸（2' -氨基-2' -脫氧胞苷5' -三磷酸，2' -氨基-2' -脫氧尿苷5' -三磷 酸），2' -0-烷基寡核糖核苷酸，2' -脫氧-2' -C-烷基寡核糖核苷酸（2' -0-甲基胞苷5' -三 磷酸，2' -甲基尿苷5' -三磷酸），2' -C-烷基寡核糖核苷酸，及其異構體（2' -阿糖胞苷 5' -三磷酸，2' -阿糖尿苷5' -三磷酸），或疊氮三磷酸（2' -疊氮-2' -脫氧胞苷5' -三磷 酸，2' -疊氮-2' -脫氧尿苷5' -三磷酸）。
[0083] 在一些實施方案中，mRNA可含有核苷酸的堿基的修飾（堿基修飾）。含有堿基修 飾的經(jīng)修飾的核苷酸也稱為堿基修飾的核苷酸。這類堿基修飾的核苷酸的實例包括但不限 于2-氨基-6-氯嘌呤核苷5' -三磷酸，2-氨基腺苷5' -三磷酸，2-硫代胞苷5' -三磷酸， 2-硫代尿苷5' -三磷酸，4-硫代尿苷5' -三磷酸，5-氨基烯丙基胞苷5' -三磷酸，5-氨基烯 丙基尿苷5' -三磷酸，5-溴胞苷5' -三磷酸，5-溴尿苷5' -三磷酸，5-碘胞苷5' -三磷酸， 5-碘尿苷5' -三磷酸，5-甲基胞苷5' -三磷酸，5-甲基尿苷5' -三磷酸，6-氮雜胞苷5' -三 磷酸，6-氮雜尿苷5' -三磷酸，6-氯嘌呤核苷5' -三磷酸，7-脫氮腺苷5' -三磷酸，7-脫氮 鳥苷5' -三磷酸，8-氮雜腺苷5' -三磷酸，8-疊氮腺苷5' -三磷酸，苯并咪唑核苷5' -三磷 酸，Nl-甲基腺苷5' -三磷酸，Nl-甲基鳥苷5' -三磷酸，N6-甲基腺苷5' -三磷酸，06-甲 基鳥苷5' -三磷酸，假尿苷5' -三磷酸，嘌呤霉素5' -三磷酸或黃苷5' -三磷酸。
[0084] 在某些實施方案中，可對所述mRNA的3'端和5'端的之一或兩者進行穩(wěn)定修飾并 且所述穩(wěn)定修飾包括例如末端封端、聚腺苷酸尾、替換不穩(wěn)定的非編碼序列（如富含腺苷 酸尿苷酸元件（ARE)或添加來自穩(wěn)定mRNA的3'或5'未翻譯序列（如例如，β-球蛋白、 肌動蛋白、GAPDH、微管蛋白、組蛋白或檸檬酸循環(huán)酶mRNA)。穩(wěn)定修飾還可在mRNA內(nèi)進行， 并且包括例如密碼子優(yōu)化和/或Kozak序列的修飾和/或并入經(jīng)修飾的核苷（如例如，吡 咯并嘧啶、C5-碘尿苷、2-氨基腺苷和2-硫代胸苷）。在某些實施方案中，用于本發(fā)明方法 和組合物中的經(jīng)修飾的mRNA包括來自CMV即刻早期I(IEl)基因的5'未翻譯序列：
[0085] XCAGAUCGCCUGGAGACGCCAUCCACGCUGUUUUGACCUCCAUAGAAGACACCGGGACCGAUCCAGCCU CCGCGGCCGGGAACGGUGCAUUGGAACGCGGAUUCCCCGUGCCAAGAGUGACUCACCGUCCUUGACACG，其中如 果X存在，那么它是GGA (SEQ ID NO: 1)，或與SEQ ID NO: 1至少90%或至少95%相同的序 列，或和/或來自人生長激素（hGH)基因的3'未翻譯序列：
[0086] CGGGUGGCAUCCC腳GACCCCUCCCCAGUGCCUCUCCUGGCCCUGGAAGUUGCCACUCCA⑶GCCCA CCAGCCUUGUCCUAAUAAAAUUAAGUUGCAUC(SEQIDN0:2)，或與SEQIDN0:2至少90%或至少 95 %相同的序列，以改進核酸酶抗性和/或改進mRNA的半衰期。除了增加 mRNA多核苷酸序 列的穩(wěn)定性以外，意外地發(fā)現(xiàn)包含CMV即刻早期I (IEl)基因的未翻譯序列和/或來自hGH 基因的未翻譯序列進一步增強mRNA的翻譯。
[0087] 典型地，mRNA合成包括將"帽"添加在N-末端（5'）端，以及將"尾"添加在C-末 端（3'）端。帽的存在對于在大多數(shù)真核細胞中發(fā)現(xiàn)的核酸酶提供抗性是至關重要的。"尾" 的存在用來保護mRNA免于外切核酸酶降解。
[0088] 因此，在一些實施方案中，本發(fā)明的mRNA包括5'帽結構。通常如下添加5'帽：首 先，RNA末端磷酸酶從5'核苷酸移除一個末端磷酸基團，留下兩個末端磷酸；然后經(jīng)由鳥苷 酸轉(zhuǎn)移酶將鳥苷三磷酸（GTP)添加至末端磷酸，產(chǎn)生5' 5' 5三磷酸鍵；并且然后，通過甲 基轉(zhuǎn)移酶將鳥嘌呤的7-氮甲基化。帽結構的實例包括但不限于m7G(5'）ppp(5'（A，G(5'） ppp (5,）A 和 G (5,）ppp (5,）G。
[0089] 在一些實施方案中，本發(fā)明的mRNA包括3'聚（A)尾結構。mRNA的3'末端上的 聚-A尾通常包括約10至300個腺苷核苷酸（例如，約10至200個腺苷核苷酸，約10至150 個腺苷核苷酸，約10至100個腺苷核苷酸，約20至70個腺苷核苷酸，或約20至60個腺苷 核苷酸）。在一些實施方案中，本發(fā)明的mRNA包括3'聚（C)尾結構。mRNA的3'末端上的 合適聚-C尾通常包括約10至200個胞嘧啶核苷酸（例如，約10至150個胞嘧啶核苷酸， 約10至100個胞嘧啶核苷酸，約20至70個胞嘧啶核苷酸，約20至60個胞嘧啶核苷酸，或 約10至40個胞嘧啶核苷酸）。可將聚-C尾添加至聚-A尾或可用其替換聚-A尾。
[0090] 在一些實施方案中，本發(fā)明的mRNA包括5'和/或3'未翻譯區(qū)域。在一些實施方 案中，5'未翻譯區(qū)域包括影響mRNA穩(wěn)定性或翻譯的一個或多個元件，例如，鐵反應元件。在 一些實施方案中，5'未翻譯區(qū)域可為約50至500個核苷酸之間的長度。
[0091] 在一些實施方案中，3'未翻譯區(qū)域包括多聚腺苷酸化信號、影響mRNA在細胞中的 位置穩(wěn)定性的蛋白質(zhì)的結合位點，或miRNA的一個或多個結合位點中的一個或多個。在一 些實施方案中，3'未翻譯區(qū)域可為50至500個核苷酸之間的長度或更長。
[0092] 由mRNA編碼的蛋白質(zhì)
[0093] 用于本發(fā)明的組合物和方法的mRNA可用于表達全長、截短、原生或經(jīng)修飾的蛋白 質(zhì)以遞送至非肺組織和細胞。在一些實施方案中，所述mRNA包括編碼蛋白質(zhì)（即治療性蛋 白）的至少一個mRNA種類。在一些實施方案中，所述mRNA包括多個編碼一種或多種基因產(chǎn) 物的mRNA種類。在一些實施方案中，所述mRNA包括至少兩個mRNA種類，其各自編碼不同基 因產(chǎn)物。在一些實施方案中，所述mRNA編碼全長蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA編 碼截短型的天然存在的全長蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA以單一轉(zhuǎn)錄物的形式從 不同基因產(chǎn)物編碼一種或多種截短蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA編碼嵌合體蛋白 質(zhì)，其中在表達期間，并非天然地與原生蛋白質(zhì)相關聯(lián)的一條或多條蛋白質(zhì)序列通過所得 嵌合體蛋白質(zhì)中的肽鍵來連接。在一些實施方案中，所述mRNA可用于以等于或大于原生蛋 白質(zhì)水平的水平來表達包含細胞活性的部分或全長蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA 可用于以等于或小于原生蛋白質(zhì)水平的水平來表達具有細胞活性的部分或全長蛋白質(zhì)。
[0094] 在一些實施方案中，所述mRNA編碼胞內(nèi)蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA 編碼胞質(zhì)蛋白。在一些實施方案中，所述mRNA編碼與肌動蛋白細胞骨架相關聯(lián)的蛋白質(zhì)。 在一些實施方案中，所述mRNA編碼與質(zhì)膜相關聯(lián)的蛋白質(zhì)。在一些具體實施方案中，所述 mRNA編碼跨膜蛋白質(zhì)。在一些具體實施方案中，所述mRNA編碼離子通道蛋白質(zhì)。在一些 實施方案中，所述mRNA編碼核周蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA編碼核蛋白質(zhì)。在 一些具體實施方案中，所述mRNA編碼轉(zhuǎn)錄因子。在一些實施方案中，所述mRNA編碼伴侶蛋 白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA編碼胞內(nèi)酶（例如，編碼與尿素循環(huán)或溶酶體貯積代 謝障礙相關的酶的mRNA)。在一些實施方案中，所述mRNA編碼涉及細胞代謝、DNA修復、轉(zhuǎn) 錄和/或翻譯的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA編碼胞外蛋白質(zhì)。在一些實施方案 中，所述mRNA編碼與胞外基質(zhì)相關聯(lián)的蛋白質(zhì)。在一些實施方案中，所述mRNA編碼分泌蛋 白。在具體實施方案中，用于本發(fā)明組合物和方法中的mRNA可用于表達由一種或多種靶細 胞排泄或分泌至周圍胞外液中的功能性蛋白質(zhì)或酶（例如，編碼激素和神經(jīng)遞質(zhì)的mRNA)
[0095] 在一些實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法提供編碼分泌蛋白的mRNA的遞送。在 一些實施方案中，本發(fā)明的組合物和方法提供編碼表1列出的一種或多種分泌蛋白的mRNA 的遞送；因此，本發(fā)明的組合物可包含編碼表1列出的蛋白質(zhì)的mRNA(或其同源物，如下論 述）連同在本文中闡明的其它組分，并且本發(fā)明方法可包括制備和/或施用組合物包含編 碼表1列出的蛋白質(zhì)的mRNA(或其同源物，如下論述）連同在本文中闡明的其它組分。
[0096] 表L分泌蛋白
[0097]
【權利要求】
1. 一種將信使RNA(mRNA)遞送至非肺細胞或組織的方法，其包括向所述肺部施用包含 編碼蛋白質(zhì)的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物，其中向所述肺部施用導致將所述mRNA和 /或所述蛋白質(zhì)遞送至非肺細胞或組織。
2. 如權利要求1所述的方法，其中所述組合物通過氣溶膠化、吸入、霧化或滴注來施用 至所述肺。
3. 如權利要求1或2所述的方法，其中所述組合物通過氣管內(nèi)氣溶膠化來施用至所述
4. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述非肺細胞選自由以下組成的組：肝 細胞、上皮細胞、造血細胞、上皮細胞、內(nèi)皮細胞、骨細胞、干細胞、間質(zhì)細胞、神經(jīng)細胞、心臟 細胞、脂肪細胞、血管平滑肌細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞、β細胞、垂體細胞、滑液襯里細 胞、卵巢細胞、睪丸細胞、成纖維細胞、B細胞、T細胞、網(wǎng)織紅細胞、白細胞、粒細胞、巨噬細 胞、嗜中性粒細胞、抗原呈遞細胞（樹突狀細胞）、成纖維細胞、腫瘤細胞及其組合。
5. 如權利要求4所述的方法，其中所述非肺細胞是肝細胞。
6. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述非肺組織選自由以下組成的組： 心、肝、脾、腎、骨骼肌、淋巴節(jié)、皮膚、大腦、腦脊液、血漿及其組合。
7. 如權利要求6所述的方法，其中所述非肺組織是肝。
8. 如權利要求6所述的方法，其中所述非肺組織是心。
9. 如權利要求6所述的方法，其中所述非肺組織是脾。
10. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述mRNA編碼胞質(zhì)蛋白。
11. 如權利要求10所述的方法，其中所述胞質(zhì)蛋白選自由以下組成的組：酶、轉(zhuǎn)錄因 子、伴侶蛋白及其組合。
12. 如權利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述mRNA編碼分泌蛋白。
13. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述mRNA編碼治療性蛋白。
14. 如權利要求13所述的方法，其中所述治療性蛋白選自由以下組成的組：α半乳糖 苷酶、促紅細胞生成素 、α 1-抗胰蛋白酶、羧肽酶N、a -L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸酯-2-硫 酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、溶酶體酸脂肪酶、芳基硫酸 酯酶-A α -氨基葡糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖胺-4-硫 酸酯酶、β -葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖醛酸酶、葡糖 腦苷酯酶、乙酰肝素磺酰胺酶、透明質(zhì)酸酶、半乳糖腦苷酯酶、人生長激素、鳥氨酸轉(zhuǎn)氨甲酰 酶（OTC)、氨基甲酰磷酸合成酶-I (CPSl)、精氨琥珀酸合成酶-I (ASSl)、精氨琥珀酸裂解酶 (ASL)、精氨酸酶-I (ARGl)、囊性纖維化跨膜傳導調(diào)控蛋白（CFTR)、因子VII、因子VIII、因 子IX、乙酰肝素-N-硫酸酯酶及其組合。
15. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中在施用至所述肺之后至少約1天，所述 蛋白質(zhì)可在所述非肺細胞或組織中檢測到。
16. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中在施用至所述肺之后至少約2天，所述 蛋白質(zhì)可在所述非肺細胞或組織中檢測到。
17. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述mRNA以每劑量大于約0. 5mg/kg mRNA的量來遞送。
18. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述脂質(zhì)載體媒介物是脂質(zhì)體。
19. 如權利要求18所述的方法，其中所述脂質(zhì)體包括一種或多種陽離子脂質(zhì)、一種或 多種非陽離子脂質(zhì)、一種或多種基于膽固醇的脂質(zhì)及一種或多種PEG-修飾的脂質(zhì)。
20. 如權利要求19所述的方法，其中所述一種或多種陽離子脂質(zhì)選自由以下組成 的組：C12-200、HGT4003、HGT5000、HGT5001、ICE、DLinKC2-DMA、DODAP、DODMA、DLinDMA、 CLinDMA、及其組合。
21. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述組合物還包含一種或多種肺部表 面活性劑。
22. 如前述權利要求中任一項所述的方法，其中所述組合物被配制成可吸入的顆粒。
23. 如權利要求22所述的方法，其中所述可吸入的顆粒的尺寸為小于約500 μm。
24. 如權利要求1-21中任一項所述的方法，其中所述組合物被配制成可霧化脂質(zhì)。
25. 如權利要求1-21中任一項所述的方法，其中所述組合物被配制成干粉。
26. -種將治療性蛋白遞送至受試者的非肺細胞或組織的方法，其包括向所述肺部施 用包含編碼治療性蛋白的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物，使得所述治療性蛋白被遞送 至非肺細胞或組織。
27. -種在受試者的非肺細胞中誘導治療性蛋白的產(chǎn)生的方法，其包括向所述肺部施 用包含編碼治療性蛋白的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物。
28. -種治療疾病或病癥的方法，其包括 向所述肺部施用包含編碼治療性蛋白的mRNA和脂質(zhì)載體媒介物的組合物， 其中施用至所述肺部導致將所述治療性蛋白遞送至受所述疾病或病癥影響的非肺細 胞或組織。
29. 如權利要求28所述的方法，其中所述疾病或病癥選自表4。
30. -種用于肺部遞送信使RNA (mRNA)的組合物，其包含編碼蛋白質(zhì)的mRNA和脂質(zhì)載 體媒介物，其中所述組合物被配制成一旦施用至所述肺部，它導致將所述mRNA和/或所述 蛋白質(zhì)遞送至非肺細胞或組織。
31. -種能夠誘導非肺細胞產(chǎn)生蛋白質(zhì)的組合物，其包含編碼蛋白質(zhì)的mRNA和脂質(zhì)載 體媒介物，其中所述組合物被配制用于肺部遞送。
32. 如權利要求30或31所述的組合物，其中所述脂質(zhì)載體媒介物是脂質(zhì)體。
33. 如權利要求32所述的組合物，其中所述脂質(zhì)體包括一種或多種陽離子脂質(zhì)、一種 或多種非陽離子脂質(zhì)、一種或多種基于膽固醇的脂質(zhì)及一種或多種PEG-修飾的脂質(zhì)。
34. 如權利要求33所述的組合物，其中所述一種或多種陽離子脂質(zhì)選自由以下組成 的組：C12-200、HGT4003、HGT5000、HGT5001、ICE、DLinKC2-DMA、DODAP、DODMA、DLinDMA、 CLinDMA、及其組合。
35. 如權利要求30-34中任一項所述的組合物，其中所述組合物還包含一種或多種肺 部表面活性劑。
36. 如權利要求30-34中任一項所述的組合物，其中所述組合物被配制成可吸入的顆 粒。
37. 如權利要求36所述的組合物，其中所述可吸入的顆粒的尺寸小于約500 μ m。
38. 如權利要求30-34中任一項所述的組合物，其中所述組合物被配制成可霧化脂質(zhì)。
39. 如權利要求30-34中任一項所述的組合物，其中所述組合物被配制成干粉供吸入。
40. 如權利要求30-39中任一項所述的組合物，其中所述mRNA編碼胞質(zhì)蛋白。
41. 如權利要求40所述的組合物，其中所述胞質(zhì)蛋白選自由以下組成的組：酶、轉(zhuǎn)錄因 子、伴侶蛋白及其組合。
42. 如權利要求30-39中任一項所述的組合物，其中所述mRNA編碼分泌蛋白。
43. 如權利要求30-42中任一項所述的組合物，其中所述mRNA編碼治療性蛋白。
44. 如權利要求43所述的組合物，其中所述治療性蛋白選自由以下組成的組：α半 乳糖苷酶、促紅細胞生成素、α?-抗胰蛋白酶、羧肽酶N、a-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖酸 酯-2-硫酸酯酶、N-乙酰葡糖胺-1-磷酸轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、溶酶體酸脂肪酶、 芳基硫酸酯酶-A α -氨基葡糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、N-乙酰半乳糖 胺-4-硫酸酯酶、β -葡萄糖苷酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、β -半乳糖苷酶、β -葡糖醛 酸酶、葡糖腦苷酯酶、乙酰肝素磺酰胺酶、透明質(zhì)酸酶、半乳糖腦苷酯酶、人生長激素、鳥氨 酸轉(zhuǎn)氨甲酰酶（OTC)、氨基甲酰磷酸合成酶-I (CPSl)、精氨琥珀酸合成酶-I (ASSl)、精氨琥 珀酸裂解酶（ASL)、精氨酸酶-I (ARGl)、囊性纖維化跨膜傳導調(diào)控蛋白（CFTR)、因子VII、因 子VIII、因子IX、乙酰肝素-N-硫酸酯酶及其組合。
【文檔編號】A61K48/00GK104519915SQ201380039829
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年6月7日 優(yōu)先權日:2012年6月8日
【發(fā)明者】M·哈特萊因, B·C·吉爾德, F·德羅莎, C·魯?shù)婪? C·普蘭克 申請人:夏爾人類遺傳性治療公司, 埃澤瑞斯公司