具有藥理學(xué)活性的納米構(gòu)建物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及在細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中轉(zhuǎn)運(yùn)活性物質(zhì)的方法和工具。具體地，本發(fā)明涉及的工具，其能夠在細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中直接轉(zhuǎn)運(yùn)與蛋白質(zhì)系統(tǒng)相互作用的物質(zhì)，如位于胞質(zhì)溶膠內(nèi)的核酸或活化T細(xì)胞的核因子(NFATs)家族。具體地，本發(fā)明涉及用于治療炎性疾病的納米構(gòu)建物，它們的制備方法，以及含有它們的組合物。
【專利說明】具有藥理學(xué)活性的納米構(gòu)建物
[0001] 設(shè)姐
[0002] 本發(fā)明涉及在細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中轉(zhuǎn)運(yùn)活性物質(zhì)的方法和工具。具體地，本發(fā)明涉及 的工具，其能夠在細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中直接轉(zhuǎn)運(yùn)與蛋白質(zhì)系統(tǒng)相互作用的物質(zhì)，如位于胞質(zhì)溶 膠內(nèi)的核酸或活化T細(xì)胞的核因子（NFAT)家族。具體地，本發(fā)明涉及用于治療炎性疾病的 納米構(gòu)建物，它們的制備方法，以及含有它們的組合物。 現(xiàn)有技術(shù)
[0003] 胞質(zhì)溶膠
[0004] 胞質(zhì)溶膠是細(xì)胞器的胞質(zhì)中，由礦物鹽，有機(jī)分子，大分子和蛋白質(zhì)的溶液形成的 可溶部分。對于細(xì)胞和生命體的生理學(xué)特性至關(guān)重要的生物化學(xué)反應(yīng)一般發(fā)生在該細(xì)胞隔 室內(nèi)。發(fā)生在此細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的反應(yīng)包括來自Ca 2+/鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸酶鈣依賴磷酸 酶（Cn)蛋白質(zhì)的NFAT蛋白的去磷酸化反應(yīng)。
[0005] NFAT
[0006] NFAT 蛋白是指由成員 NFATl (NFATc2)、NFAT2 (NFATcl)、NFAT3(NFATc4)和 NFAT4(NFATc3)，以及它們的各種同種型構(gòu)成的轉(zhuǎn)錄因子家族的成員。NFAT家族的蛋白在進(jìn) 化學(xué)上與轉(zhuǎn)錄因子的REL-NF- κ B家族相連。NFAT蛋白最初鑒定為能夠調(diào)節(jié)T細(xì)胞的IL-2 產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子，雖然此后鑒定到NFAT關(guān)于適應(yīng)性免疫的各種功能，包括B和T-細(xì)胞的分 化和活化。
[0007] NFAT是在嗜中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞（DC)中對凝乳聚糖（Curdian)起反 應(yīng)而被激活，但也在DC中對LPS起反應(yīng)而被激活和在巨噬細(xì)胞中由TNF α調(diào)節(jié)。
[0008] 同種型1-4的活性受鈣依賴磷酸酶（Cn)控制，其是Ca2+/鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸酶， 一旦被激活，會(huì)增加細(xì)胞內(nèi)Ca 2+濃度并使得存在于NFAT的N-末端的磷酸化基序脫磷酸化， 表達(dá)用于確定NFAT的核輸入的核序列。NFAT蛋白與統(tǒng)稱為NFATn的伴侶蛋白相互作用以 產(chǎn)生活性NFAT轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物和在隨后的分析中，控制細(xì)胞因子的產(chǎn)生。
[0009] 慢性和炎性自身免疫性疾病以及與移植排斥相關(guān)的問題通常使用免疫抑制藥物 治療，包括環(huán)孢菌素 A(CSA)和FK506,它們是活化的免疫細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子基因轉(zhuǎn)錄的強(qiáng)效 抑制劑。環(huán)孢素 A和FK506抑制Cn的活性。然而，它們有很明顯的副作用。環(huán)孢素導(dǎo)致小 血管的血管病變，尤其是腎臟內(nèi)，并因高血壓和高血脂導(dǎo)致大血管的血管病變，而FK506可 導(dǎo)致腎毒性，神經(jīng)毒性，糖尿病和高血壓。這些藥物的高水平毒性的原因在于Cn的普遍表 達(dá)，并且Cn不僅控制NFAT，還控制其它轉(zhuǎn)錄因子的活化。
[0010]因此需要新的，毒性較低的免疫抑制藥物，能同時(shí)特異性抑制NFAT前體，抑制免 疫反應(yīng)激活所需的關(guān)鍵炎性分子的表達(dá)。
[0011] VIVIT
[0012] 具有序列為Pro-X-Ile-X-Ile-Thr(PxIxIT)的肽，從在NFAT蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的隱 藏的Cn-結(jié)合基序衍生而來，與NFAT競爭結(jié)合Cn，從而在酶的測定中顯示破壞NFAT的結(jié) 合和脫磷酸化。特別是，已經(jīng)證明16聚體形式的寡肽纈氨酸-異亮氨酸-纈氨酸-異亮 氨酸-蘇氨酸（VIVIT)對Cn的親和力增加并能有效抑制NFAT和其活性，但不抑制NF- K B 轉(zhuǎn)錄因子的活性，由各自的報(bào)道基因的激活所指示（Aramburu等，Science，1999)。因此， VIVIT肽比CsA和FK506更具選擇性，其同時(shí)抑制這兩種轉(zhuǎn)錄因子的活化。實(shí)際上，專利申 請W02008156363描述了包含VIVIT序列的各種構(gòu)建物以便用于炎癥的一般治療。
[0013] 但是，眾所周知的是，肽材料無法獨(dú)立通過細(xì)胞膜，來直接轉(zhuǎn)移進(jìn)胞質(zhì)溶膠，并且 在任何情況下，有眾所周知的體內(nèi)穩(wěn)定性問題，這限制了這類材料的使用。在本申請的 實(shí)驗(yàn)部分報(bào)道的結(jié)果已證實(shí)，包含VIVIT序列的肽不能到達(dá)目標(biāo)Cn蛋白所位于的細(xì)胞 胞質(zhì)溶膠，其量足以有效地作為炎性過程的抑制劑（塞伯等，細(xì)胞通訊和信號傳導(dǎo)（Cell communication and signaling) ：CCS,2009)〇
[0014] 納米粒子。具有納米級尺寸范圍的固體粒子構(gòu)成一個(gè)有效的載體系統(tǒng)用于活性分 子的運(yùn)輸是已知的。一旦結(jié)合到納米粒子，這類分子被保護(hù)免受體內(nèi)降解，可在細(xì)胞內(nèi)運(yùn)輸 和釋放。
[0015] 治療/診斷領(lǐng)域中使用的多數(shù)納米粒子可分為兩大類：即含有有機(jī)分子作為主要 成分的粒子，和那些使用無機(jī)元素，通常是金屬，作為核的粒子。屬于后一組的粒子具有許 多優(yōu)點(diǎn)，包括：1)利用所述晶核，以便獲得相關(guān)物理性質(zhì)的可能性，2)所述無機(jī)核能夠有效 控制最終納米構(gòu)建物的尺寸和形態(tài)特征。
[0016] 大多數(shù)無機(jī)商業(yè)納米粒子共享相同的基本結(jié)構(gòu)：球形，立方體或各向異性形態(tài)的 中心核，這決定了物理特性（包括粒子的熒光，光學(xué)，磁性電子性質(zhì)），以及它們表面上的保 護(hù)性有機(jī)涂層。這種涂層保護(hù)核免于體內(nèi)生理降解，并允許與具有用于結(jié)合的官能團(tuán)的有 機(jī)（生物）分子形成靜電或共價(jià)鍵。
[0017] 由可以用作生物活性物質(zhì)的載體的納米粒子所造成的問題在于以下事實(shí)：這種納 米構(gòu)建物經(jīng)由內(nèi)體途徑內(nèi)在化進(jìn)入細(xì)胞和引導(dǎo)至脂質(zhì)體降解途徑。在這個(gè)意義上，生物活 性物質(zhì)被降解，因此無法以藥理活性量達(dá)到胞質(zhì)溶膠。
[0018] 國際專利申請W02005065081描述了也可用作活性分子載體的、包含兩性涂層的 磁性納米粒子的制備。該文件描述了在腫瘤的診斷方法或治療性治療中使用這種納米粒 子。然而，該文作者未對此類粒子的靶細(xì)胞作任何評估。
[0019] 本發(fā)明的目的是避免現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)中的上述缺點(diǎn)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0020] 本發(fā)明是基于此意外發(fā)現(xiàn)：包含兩性聚合物基涂層的納米粒子能夠在細(xì)胞胞質(zhì)溶 膠中直接運(yùn)輸和釋放活性分子。該分子然后還可從胞質(zhì)溶膠擴(kuò)散到細(xì)胞核中。不希望將 本發(fā)明的范圍限制到具體的科學(xué)理論，但該結(jié)果可能至少部分是因納米構(gòu)建物（下文稱為 MYTS)直接通過細(xì)胞膜的能力和部分是因避開傳統(tǒng)內(nèi)涵體系統(tǒng)以及由此的溶酶體降解途徑 的能力而現(xiàn)的。
[0021] 因此，本發(fā)明涉及一種將分子輸送到細(xì)胞胞質(zhì)溶膠內(nèi)的方法，包括下列步驟：
[0022] a)預(yù)先準(zhǔn)備一納米構(gòu)建物（MYTS)，其包含無機(jī)納米粒子，所述無機(jī)納米粒子具有 兩性聚合物基涂層和通過所述兩性涂層結(jié)合到所述粒子的活性分子；
[0023] b)使得所述細(xì)胞接觸所述納米構(gòu)建物。
[0024] 本發(fā)明的第二個(gè)目的是納米構(gòu)建物，其包括無機(jī)納米粒子，所述無機(jī)納米粒子具 有兩性聚合物基涂層和通過所述兩性涂層結(jié)合到所述粒子的藥理學(xué)活性分子，用于與定位 于細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的分子事件和/或過程相關(guān)的疾病的治療。
[0025] 本發(fā)明的第三個(gè)目的是一種藥物組合物，其包含上述納米構(gòu)建物和/或一種或多 種藥學(xué)上可接受賦形劑，用于疾病或炎性狀態(tài)的治療。
[0026] 本發(fā)明的第四個(gè)目的是納米構(gòu)建物的制備方法，包括以下步驟：
[0027] a)預(yù)先準(zhǔn)備具有連接體活化的兩性聚合物外涂層的無機(jī)納米粒子的溶液/懸浮 液；
[0028] b)將一種或多種活性分子加入所述溶液/懸浮液，使其與所述連接體反應(yīng)。
[0029] 在方法、納米構(gòu)建物和藥物組合物的具體實(shí)施例中，活性分子是含有VIVIT肽或 由VIVIT肽組成的肽。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0030] 圖1顯示了暴露于所述MTYS納米構(gòu)建物后的DC的TEM分析。源自小鼠骨髓的DC 與納米構(gòu)建物共培養(yǎng)五小時(shí)，并然后通過TEM進(jìn)行分析。黑色箭頭表示核內(nèi)體內(nèi)的MYTS，灰 色箭頭表示從內(nèi)涵體逃脫和進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)的MYTS。
[0031] 圖2顯示了源自骨髓的DC中MYTS-VIVIT納米構(gòu)建物對NFAT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的抑制。DC 細(xì)胞用所示量的MYTS-VIVIT預(yù)處理2小時(shí)，或不處理，然后用LPS活化18小時(shí)。上清液中 IL-2和TNF α的量分別用ELISA法測定。
[0032] 圖3顯示了 NFAT途徑在中性粒細(xì)胞中活躍。通過IL-2/GFP作遺傳學(xué)修飾的小鼠 用MYTS-VIVIT處理，或不處理，兩小時(shí)后靜脈內(nèi)注射LPS。條形代表LPS處理后三小時(shí)的 GFP+Ly6G+脾嗜中性粒細(xì)胞的百分比。在該小鼠模型中，GFP插入到IL-2的第二外顯子，因 此與IL-2具有相同的調(diào)節(jié)作用。
[0033] 圖4顯示了在對LPS起反應(yīng)的爪水腫形成中該NFAT途徑的抑制。將動(dòng)物用納米 構(gòu)建物（MYTS-VIVIT)或FK-506作預(yù)處理（約2小時(shí)），或者不處理，并然后用LPS作局部 處理。水腫測定在圖中表示的時(shí)間點(diǎn)測定。
[0034] 圖5顯不了關(guān)節(jié)炎發(fā)展的抑制。圖5A :小鼠在_1，0,+1，+3,+6,+9,和+12天靜脈 注射納米構(gòu)建物（MYTS-VIVIT)或納米偶聯(lián)物MYTS-VEET(類似于VIVIT的肽，其中序列已 被修飾，從而失去對Cn的特異性），或者不注射。第0天表示誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的過程的開始。表 明關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重性的臨床點(diǎn)（clinical point)在標(biāo)明的天數(shù)進(jìn)行評估。在圖5B中，照片顯 示了第七天，處理過的小鼠和未處理小鼠的關(guān)節(jié)炎。
[0035] 圖6顯示了皮膚移植排斥的抑制。雄性小鼠的皮膚移植到雌性小鼠。然后小鼠 在-1，0, +1，+3, +6, +9,和+15天靜脈注射納米構(gòu)建物（MYTS-VIVIT或MYTS-VEET)，或不注 射。此外，在接下來的20天小鼠不作處理。雄到雄的方框表示未處理對照，顯示從雄性小鼠 到雄性小鼠的皮膚移植?？梢钥吹?，移植物被明確接受。雄到雌的方框表示從雄性小鼠到雌 性小鼠的皮膚移植，沒有使用納米構(gòu)建物處理。排異的瘢痕在第30天清晰可見。排異也可 在MYTS-VEET納米構(gòu)建物對照處理的雄到雌（雄性到雌性）方框中看到。反之亦然，在代 表用MYTS-VIVIT處理的（雄到雌+MYTS-VIVIT M)從雄性到雌性移植的方框中，移植物的 接受清晰可見。下方的條形圖表示實(shí)驗(yàn)的定量結(jié)果。概括地說，用MYTS-VIVIT納米構(gòu)建物 處理的80%的情況接受了該移植物，而在未處理的情況下為100%排異以及用MYTS-VEET 納米構(gòu)建物對照處理是80 %排異。
[0036] 圖7顯示了根據(jù)實(shí)施例中詳細(xì)描述的【具體實(shí)施方式】，制備MYTS-VIVIT納米構(gòu)建 物的方法的示意圖。
[0037] 圖8顯示了對LPS起反應(yīng)，用具有序列SEQ ID NO :1的肽轉(zhuǎn)導(dǎo)或未轉(zhuǎn)導(dǎo)的樹突細(xì) 胞的細(xì)胞因子產(chǎn)生情況。與GFP蛋白融合的具有序列SEQ ID NO :1的肽轉(zhuǎn)導(dǎo)的DC和未轉(zhuǎn) 導(dǎo)的DC用LPS刺激（100毫微克/毫升）18小時(shí)。然后通過ELISA測定評估IL-2 (NFAT依 賴性，頂部方框）和TNF- α (不依賴NFAT，底部方框）的產(chǎn)生。應(yīng)該注意的是具有序列SEQ ID NO :1的肽的表達(dá)降低了 IL-2的產(chǎn)生。
[0038] 圖9顯示了具有序列SEQ ID NO :1的未修飾的肽或與含11-精氨酸尾的相同肽無 法滲透入DC的胞質(zhì)溶膠和阻斷NFAT的活性。源自骨髓的DC先用具有序列SEQ ID NO :1 的肽（25UM)或用綴合有11-精氨酸尾的肽（25UM)進(jìn)行預(yù)處理，或者不處理，然后用IOOng/ ml的LPS刺激18小時(shí)。通過ELISA測定法評估上清液里IL-2 (頂部方框）和TNF- α (底 部方框）的釋放。應(yīng)該注意的是，無論是未修飾的肽，還是用11-精氨酸尾修飾的肽都不能 抑制NFAT的活性。
[0039] 圖10顯示了包含在脂質(zhì)體中具有序列SEQ ID NO :1的肽不能滲透到DC的胞質(zhì)溶 膠和抑制NFAT的活性。源自骨髓的DC用包含在脂質(zhì)體中的基于磷脂的肽進(jìn)行預(yù)處理，或者 不處理，然后用l〇〇ng/ml的LPS刺激18小時(shí)。通過ELISA測定法評估上清液里IL-2 (頂部 方框）和TNF-α (底部方框）的釋放。應(yīng)該注意的是，包含在脂質(zhì)體中的肽不能抑制NFAT 的活性。
[0040] 圖11.⑷由測量直徑約為8納米的磁性結(jié)晶磁鐵礦核心形成納米粒子。N-磷酰 基甲基亞氨基二乙酸（PMIDA)用于在氧化鐵引入有機(jī)化合物的固定的位點(diǎn)，利用膦酸基對 納米粒子上表面FeOH的親和力。兩個(gè)羧酸基團(tuán)通過與N-羥基琥珀酰亞胺酯（NHS)激活來 與雙官能二氨基連接體2, 2-(亞乙二氧基）二（乙胺）（EDBE)縮合轉(zhuǎn)化成氨基。然后，兩 個(gè)氨基通過加入N-琥珀酰亞胺-3-[2-吡啶基硫]丙酸酯（SPDP試劑）轉(zhuǎn)化為對硫醇有反 應(yīng)活性的吡啶基硫代丙酸酯（PDP)的基團(tuán)。最后，通過納米偶聯(lián)物與MYTS-VIVIT納米構(gòu)建 物中所用相同的肽（序列SEQ ID NO :1)反應(yīng)，得到最終納米構(gòu)建物。（B)源自骨髓的DC 用直接結(jié)合于磁性納米粒子的肽（對應(yīng)于使得肽為25 μ M的使用濃度）進(jìn)行預(yù)處理，或者 不處理，然后用100納克/毫升的LPS刺激18小時(shí)。然后通過ELISA測定評估上清液里 IL_2(頂部方框）和TNF-α (底部方框）的釋放。應(yīng)該注意的是，直接結(jié)合于納米粒子的肽 不能抑制NFAT的活性。
[0041] 圖12顯示了 MYTS-恩夫韋地（enfuvirtide)納米構(gòu)建物的胞衆(zhòng)內(nèi)化和定位。在 此處示出的圖像中，可以清楚地看到標(biāo)記有熒光探針的抗逆轉(zhuǎn)錄病毒藥物的定位在神經(jīng)元 的胞液中，所述神經(jīng)元從MYTS-恩夫韋地處理的小鼠腦提取物冷凍切片得到。對應(yīng)于神經(jīng) 元的熒光斑點(diǎn)只有在偶聯(lián)到MYTS的恩夫韋地存在（第3行的底部，熒光信道）的情況下可 以清楚地看到，而熒光的痕跡不能在對照和從用未與納米粒子偶聯(lián)的標(biāo)記藥物處理的小鼠 中提取的樣品中看到（分別為第1和2行）
[0042] 圖13顯示了暴露于MTYS -聚乙二醇納米構(gòu)建物后DC的TEM分析。實(shí)驗(yàn)證明了 MYTS聚乙二醇（PMpk= 2000道爾頓）在胞質(zhì)溶膠中的定位。在圖像中，可以看出偶聯(lián)于 PEG2cicici的納米構(gòu)建物從核內(nèi)體泄漏，而核內(nèi)體本身是完整的。
[0043] 圖14顯示了根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施例，借助EDBE-PDP連接體將納米構(gòu)建物偶 聯(lián)綴合到具有序列SEQ ID NO :1的狀的方法的不意圖。
[0044] 圖15顯示了高濃度的標(biāo)記有熒光基團(tuán)的納米粒子和未標(biāo)記納米粒子（分別是 MYTS-FITC和MYTS)的分散體以基質(zhì)乳膏的約兩倍量摻入，然后以連續(xù)稀釋度加入剩余基 質(zhì)乳膏，混合直至完全均勻化。上述制劑然后連續(xù)三天用于C57BL/6小鼠預(yù)先剃毛（面積 測量1平方厘米）的皮膚上。處死老鼠并從處理皮膚區(qū)域制備單細(xì)胞懸液。然后通過FACS 方法分析細(xì)胞，以確定在造血來源（CD45+)，或非造血來源（CD45-)的細(xì)胞中攝取。從圖中 可以看出，納米粒子是由這兩組細(xì)胞吸收。
[0045] 發(fā)明詳沐
[0046] 本發(fā)明基于以下幾個(gè)方面，在下面詳細(xì)描述。
[0047] 無機(jī)納米粒子
[0048] 在無機(jī)基質(zhì)上形成的納米粒子共享相同的基本結(jié)構(gòu)：決定物理性質(zhì)（包括粒子的 熒光和光學(xué)，磁學(xué)和電學(xué)特性）的中心核和任選的表面上的保護(hù)性有機(jī)涂層。所述有機(jī)涂 層，例如增加納米粒子在懸浮液中的溶解度的疏水表面活性劑，優(yōu)選是長鏈形式，選自例如 油酸，油胺和三辛基膦。
[0049] 本發(fā)明的無機(jī)納米粒子通常具有結(jié)晶或非結(jié)晶型的金屬或金屬氧化物核。合適的 金屬包括，例如，金，銀，鐵，猛，銅，鎳，鉬和鈕。與此相反，金屬氧化物的例子包括Y -Fe2O3， Fe3O4, MnFe2O4, CoFe2O4, ΜηΟ,量子點(diǎn)（例如 CdSe, CdS，CdSe/ZnS 等），TiO2, SiO2，和 CeO20
[0050] 通常使用5和50納米之間的納米粒子。
[0051 ] 可以在本發(fā)明中使用的納米粒子實(shí)例描述于，例如，在J. Park等.（Nat. Mater. 2004, 3, 891-895)，L. Polito 等·（J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 12712-12724)， Μ· Brust 等·（J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994,801-802)，C. Β· Murray 等·（J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1994, 801-802)，或者是市售的，例如，從：美國亞利桑那州菲替維爾的AC 診斷公司（AC Diagnostics);美國德克薩斯州休斯頓的SS納米材料公司（SkySpring Nanomaterials, Inc.);美國密蘇里州圣路易斯的S-A公司（Sigma-Aldrich);英國佩斯利 的生命科技有限公司（Life Technologies Ltd);和加拿大安大略省密西沙加的mk納米公 司（mkNANO)〇
[0052] 涂覆有兩件聚合物的納米粒子
[0053] 本發(fā)明的方法設(shè)想使用包含無機(jī)納米粒子或如上述形成的納米粒子的納米構(gòu)建 物，具有由兩性聚合物形成的外涂層。
[0054] 用于制備具有兩性聚合物的外涂層的無機(jī)納米粒子的方法的例子在專利申請 W02005065081中有詳細(xì)的描述，該申請通過引用的方式整體并入本文。這種方法設(shè)想通過 使用封蓋配體和兩性嵌段共聚物形成兩性涂層。兩性涂層通常通過嵌段共聚物形成。
[0055] 示例性的，但非限制性的，在專利申請W02005065081第10頁第21-30行和第11 頁1-3行提供了封蓋配體列表。
[0056] 示例性的，但非限制性的，專利申請W02005065081的第11-23頁提供了兩性嵌段 共聚物列表。
[0057] 在一個(gè)實(shí)施例中，兩性涂層是由聚（異丁烯-馬來酸酐）和十二烷基胺（PM)縮 合得到的，如在C. -A. J. Lin等的Small 2008, 3, 334-341中的描述。
[0058] 通討所沭兩件涂層結(jié)合到納米粒子的分子
[0059] 本發(fā)明的納米構(gòu)建物還包括通過兩性涂層結(jié)合到納米粒子的活性分子。
[0060] 所述分子可以是對定位于胞質(zhì)溶膠的一種或多種目標(biāo)分子具有親和力的任何分 子。"對一種或多種目標(biāo)分子具有親和力的任何分子"的表述是指分子能夠與胞質(zhì)環(huán)境中的 革巴分子相互作用。
[0061] 該分子選自，但不限于：肽，蛋白質(zhì)（例如單克隆或多克隆抗體），糖，合成聚合物， 多核苷酸，脂肪酸，有機(jī)小分子，或其組合。
[0062] 單詞"多核苷酸"包括DNA，RNA，siRNA和miRNA，無論是病毒，細(xì)菌，植物或動(dòng)物 (例如哺乳動(dòng)物）來源的，是否是合成的，單鏈或雙鏈，包括天然或非天然或化學(xué)修飾的核 苷酸。此外，該分子還可包括標(biāo)記分子，例如標(biāo)記有放射性或熒光基團(tuán)的分子。
[0063] 該活性分子可以是選自下組的肽，但不僅限于：4^71-1111-561-1^11-116-!^8-Ser-Leu-Ile-Glu-Glu-Ser-Gln-Asn-Gln-Gln-Glu-Lys-Asn-Glu-Gln-Glu-Leu-Leu-Glu-Leu-Asp-Lys-Trp-Ala-Ser-Leu-Trp-Asn-Trp-Phe-NH2(SEQ ID NO:6 的恩夫韋地），促進(jìn) 核內(nèi)物質(zhì)滲透的肽（核定位序列），或包含序列Val-Ile-Val-Ile-Thr (V-I-V-I-T，SEQ ID NO:5)的肽。
[0064] 包含共有氨基酸序列Val-Ile-Val-Ile-Thr，從NFAT蛋白質(zhì)中發(fā)現(xiàn)的Cn-結(jié)合基 序衍生的肽適合于選擇性抑制屬于NFAT家族的蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號途徑。這些肽的例子是具 有SEQ ID N0:l，2,3,4,5的序列的肽。
[0065] 選擇性抑制屬于NFAT家族的蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路的其它肽可以由本領(lǐng)域技術(shù)人 員通過使用酶測定進(jìn)行選擇，如J. Aramburu等Science 1999, 285, 2129-1133描述的。
[0066] 活性分子可以通過本領(lǐng)域中已知的任何類型的化學(xué)鍵，直接結(jié)合到兩性涂層，例 如通過存在于兩性聚合物的羧基，或間接地結(jié)合，例如通過連接體。
[0067] 連接體可與所述活性分子具有可逆鍵，如二硫鍵，或不可逆鍵。
[0068] 合適的連接體的實(shí)例是2, 2-(亞乙二氧基）二（乙胺）（EDBE)，聚乙二醇，異雙功 能PEG，二氨基PEG，乙二胺，以及固相合成通用的其他同雙功能或異雙功能間隔件。
[0069] 圖14顯示通過EDBE-PDP連接體將肽偶聯(lián)到納米構(gòu)建物的一般反應(yīng)方案。
[0070] 牛物相容件化合物
[0071] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，除了上述的分子，設(shè)計(jì)用以調(diào)節(jié)本發(fā)明構(gòu)建物的生物 利用度和/或生物相容性的生物相容性化合物也可存在于納米構(gòu)建物的兩性涂層的表面。 這樣的化合物通過所述兩性涂層結(jié)合到納米粒子。
[0072] 該化合物使用合適的連接體優(yōu)選偶聯(lián)于兩性涂層，如以上段落中描述。生物相容 性化合物的一個(gè)例子是聚乙二醇，而偶聯(lián)的一個(gè)例子是通過根據(jù)圖14所示相同的反應(yīng)方 案和試劑，利用EDBE連接體。
[0073] 所沭方法的步驟b)
[0074] 上述納米構(gòu)建物可在有待用于所述方法的步驟b)的溶液或懸浮液中以所需濃度 制備。
[0075] 這樣的步驟包括使得上述納米構(gòu)建物，例如，在溶液中或懸浮液中，與動(dòng)物（例如 哺乳動(dòng)物，優(yōu)選人）的真核細(xì)胞接觸。所述真核細(xì)胞可以選自免疫系統(tǒng)的細(xì)胞，例如DC，嗜 中性粒細(xì)胞或巨噬細(xì)胞，淋巴細(xì)胞，神經(jīng)系統(tǒng)的細(xì)胞，例如神經(jīng)元，腫瘤細(xì)胞，和內(nèi)皮細(xì)胞。
[0076] 在用于治療宙位于朐質(zhì)溶膠內(nèi)的蛋白功能改奪相關(guān)疾病的納米構(gòu)律物
[0077] 本發(fā)明還涉及上述納米構(gòu)建物，其中所述分子是具有藥理學(xué)活性的分子，用于治 療定位于細(xì)胞胞質(zhì)溶膠的分子事件或過程相關(guān)疾病的治療。
[0078] 所述分子可以是具有藥理學(xué)活性的、連接到與它相互作用的定位于細(xì)胞胞質(zhì)溶膠 的治療靶點(diǎn)的任何分子。示范性的，而不是限制性的列表，包括具有抗病毒活性的分子，如 恩夫韋地，具有抗炎活性的分子，如能選擇性抑制屬于NFAT家族的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路 的肽，姜黃素，抗體，抗腫瘤藥物，用于基因治療的寡核苷酸，和具有抗炎活性的其它分子。
[0079] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施例中，所述具有藥理學(xué)活性的分子是包含氨基酸序列 Val lie Val lie Thr(VIVIT)或由氨基酸序列 Val lie Val lie Thr(VIVIT)構(gòu)成的肽。
[0080] 特別地，所述納米構(gòu)建物能夠用于治療與屬于NFAT家族的蛋白的功能障礙和/或 失調(diào)相關(guān)的疾病，如炎性疾病。這些疾病包括但不限于：類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，抗炎性腸病，同 種異體或異種移植排斥反應(yīng)，敗血病，再生障礙性貧血，銀肩病，水腫，紅斑性狼瘡，I型糖尿 病，哮喘，肺纖維化，硬皮病，皮肌炎，干燥綜合征，川崎病，橋本氏甲狀腺炎，自身免疫性溶 血性貧血，特發(fā)性血小板減少癥，慢性腎小球腎炎，多發(fā)性硬化癥，囊腫性纖維化，慢性復(fù)發(fā) 性肝炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化，過敏性鼻炎，過敏性結(jié)膜炎，特應(yīng)性皮炎，克羅恩病，潰瘍性 結(jié)腸炎，結(jié)腸炎/炎癥性腸綜合征，自身免疫性甲狀腺炎，獲得性免疫缺陷性疾病，阿爾茨 海默氏病，帕金森氏病，腫瘤。
[0081] 藥物組合物
[0082] 本發(fā)明還涉及一種藥物組合物，其包含上述的納米構(gòu)建物和/或一種或多種藥學(xué) 上可接受的賦形劑，用于炎性狀態(tài)的治療。
[0083] 術(shù)語"藥學(xué)上可接受的賦形劑"是指適合在藥物組合物中使用的賦形劑，佐劑，載 體，溶劑，稀釋劑，活性劑，等滲劑，增稠劑或乳化劑，防腐劑，固體粘合劑，潤滑劑等。《雷明 頓的藥物科學(xué)》（Remington' s Pharmaceutical Sciences)，第十六版，E.W. Martin(賓夕 法尼亞州伊斯頓馬克出版公司-Mack Publishing Co. ,Easton, Pa.，1980)，描述了可用于 藥學(xué)上可接受的組合物的制劑中的各種賦形劑和用于制備它們的技術(shù)。
[0084] 可以用作藥學(xué)上可接受的賦形劑的材料的一些例子包括，但不限于，離子交換劑， 鋁，硬脂酸鋁，卵磷脂，血清蛋白，如人血清白蛋白，緩沖物質(zhì)（磷酸鹽，山梨酸或山梨酸 鉀），植物的飽和脂肪酸，水，鹽或電解質(zhì)，如硫酸魚精蛋白，磷酸氫二鈉，氯化鈉，鋅鹽，膠 體二氧化硅，三硅酸鎂，聚乙烯吡咯烷酮，聚丙烯酸酯，蠟，脂肪組織，糖甘油酯的局部混合 物如乳糖，葡萄糖和蔗糖；酰胺，如玉米淀粉和馬鈴薯淀粉；纖維素及其衍生物，例如羧甲 基纖維素鈉，乙基纖維素和醋酸纖維素；黃蓍粉；麥芽；明膠；滑石粉；賦形劑，例如可可脂 和蠟為栓劑，油，例如花生油，棉籽油，吉拉索爾油，芝麻油，橄欖油，玉米油和大豆油；二醇， 如丙二醇或聚乙二醇；酯，如油酸乙酯和月桂酸乙酯，緩沖劑，如氫氧化鎂和氫氧化鋁，海藻 酸，無熱原水，等滲鹽溶液，林格氏溶液；含磷酸鹽和其它非毒性相容的潤滑劑的乙醇和生 理鹽水緩沖溶液，如月桂基硫酸鈉和硬脂酸鎂，如著色劑，放松劑，包衣劑，甜味劑，調(diào)味劑 和芳香劑，防腐劑和抗氧化劑也可以存在于根據(jù)制備制劑的人的判斷的組合物中。
[0085] 此處描述的藥物組合物還可以包含至少一種不同于納米粒子的活性成分并已知 可用于炎性疾病的治療，如皮質(zhì)類固醇藥物，例如強(qiáng)的松和地塞米松，細(xì)胞毒性藥物，如硫 唑嘌呤和環(huán)磷酰胺，及其衍生物從用于治療細(xì)菌或真菌，如雷帕霉素，F(xiàn)K506,和環(huán)孢素。
[0086] 組合物中其它一種或多種活性成分的濃度可以由在本領(lǐng)域技術(shù)人員在通常使用 的濃度的基礎(chǔ)上，很容易地確定。
[0087] 該組合物可以口服，腸胃外，靜脈內(nèi)，通過氣霧劑，直腸，經(jīng)皮，皮下，腦池內(nèi)，肌內(nèi)， 陰道，腹膜內(nèi)，局部，舌下和鼻內(nèi)給予和適合本發(fā)明目的的本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的所有給藥 方法給予。
[0088] 用于口服給藥的組合物可采取液體溶液或懸浮液或粉末的形式。該組合物可以以 單劑量的形式呈現(xiàn)，以方便給藥。
[0089] 用于口服給藥的固體劑型包括膠囊劑，片劑，丸劑，粉劑和粒子劑。在這樣的固體 形式中，將一種或多種活性成分與至少一種藥學(xué)上可接受的惰性賦形劑或載體混合，例如 檸檬酸鈉或磷酸鈣和/或填充劑或增量劑（如酰胺，乳糖，蔗糖，葡萄糖，甘露醇和硅酸）； 粘合劑（如羧甲基纖維素，藻酸鹽，明膠，聚乙烯吡咯烷酮，蔗糖）；濕潤劑（例如甘油）； 崩解劑（如瓊脂，碳酸鈣，馬鈴薯淀粉或木薯淀粉，海藻酸，某些硅酸鹽和碳酸鈉）；阻燃劑 (例如石蠟）；吸光度加速器（如季銨化合物）；加濕劑（如二十六烷酸和甘油單硬脂酸 酯）；吸收劑（如高嶺土和膨潤土ARGILE);潤滑劑（如滑石，硬脂酸媽，硬脂酸鎂，固體聚乙 二醇，十二烷基硫酸鈉）和其混合物。
[0090] 在膠囊，片劑和丸劑的情況下，該劑型還可以包含緩沖劑。
[0091] 上面指出的固體組合物也可使用賦形劑如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等 用于填充硬或軟明膠的膠囊中。片劑，錠劑，膠囊，丸劑和顆粒劑的固體劑型可以用包衣，例 如腸溶包衣和具有在藥物制劑領(lǐng)域中公知的其它包衣劑制備。它們可任選地配制以只在或 優(yōu)選在腸道的某些部分釋放一種或多種活性成分，任選地以延遲方式。
[0092] 適于口服給藥的液體形式包括，但不限于，藥學(xué)上可接受的乳劑，凝膠劑，微乳劑， 溶液，懸浮液，糖漿和酏劑，并且可含有在本領(lǐng)域中常用的稀釋劑?？诜囊后w形式可以包 括有緩沖劑，懸浮劑和分散劑，乳化劑，溶劑，著色劑，芳香劑等的合適的水性或非水性載 體。
[0093] 例如，它們可包括水或其它溶劑，增溶劑和乳化劑，例如乙醇，異丙醇，碳酸乙酯， 乙酸乙酯，芐醇，苯甲酸芐酯，丙二醇，1，3-丁二醇，二甲替甲酰胺，油（特別是棉籽油，花生 油，玉米油，胚芽油，橄欖油，蓖麻油和芝麻油），甘油，四氫糠醇，聚乙二醇和脫水山梨醇的 脂肪酸酯及其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物還可以包括佐劑，如濕潤劑，乳化劑和 懸浮劑，甜味劑，調(diào)味劑和芳香劑。
[0094] 液體形式還可以是可注射的溶液，例如無菌可注射水或油性懸浮液，并且可以根 據(jù)已知技術(shù)使用合適的分散劑，潤濕劑和懸浮劑進(jìn)行配制。所述無菌可注射制劑還可以是 無菌可注射溶液，懸浮液或乳液中的無毒的腸胃外可接受的稀釋劑或溶劑，例如1，3- 丁二 醇配制的溶液。可以使用的可接受的媒介物和溶劑，包括水，林格氏溶液，U.S.P.和等滲氯 化鈉溶液。此外，無菌不揮發(fā)油通常用作溶劑或懸浮介質(zhì)。此外，脂肪酸如油酸用于可注射 的溶液。
[0095] 防腐劑和其他添加劑，例如抗微生物添加劑，抗氧化劑，螯合劑和惰性氣體也可以 有（Mack (1982)雷明頓藥物科學(xué)，第16版）。
[0096] 所述可注射制劑可以這樣進(jìn)行滅菌，例如通過過濾器過濾捕獲細(xì)菌，或通過摻入 無菌固體組合物形式的滅菌劑，該滅菌劑在使用前可溶解或分散于無菌水或其它無菌可注 射介質(zhì)中。
[0097] 本發(fā)明的組合物還可以以軟膏劑，糊劑，洗劑，凝膠，粉劑，溶液，噴霧劑，吸入劑， 眼或滴耳劑或貼劑的形式配制用于局部給藥。所述活性成分（或組分）在無菌條件下與藥 學(xué)上可接受的載體和任何防腐劑或視需要而定混合緩沖必要的。經(jīng)皮貼劑可以用來提供這 里所描述的組合物的控制釋放。吸收增強(qiáng)劑也可以用于通過皮膚以增加化合物的流動(dòng)。釋 放的速率可以通過提供用于控制速度的膜或通過將化合物在聚合物基質(zhì)或凝膠分散進(jìn)行 控制。
[0098] 劑量可以根據(jù)年齡和患者的病理學(xué)或疾病的性質(zhì)和嚴(yán)重程度，以及該方法和給藥 類型的一般條件而變化。劑量因此必須考慮到待治療病癥的特定情況。待治療病癥的嚴(yán)重 程度，患者的年齡，體重和具體患者的一般身體狀況，以及患者正在使用的其它藥物，這是 本領(lǐng)域技術(shù)人員眾所周知的。此外，很顯然，所說的有效量可根據(jù)需要按照所治療的患者和 /或根據(jù)開出本發(fā)明化合物的處方的醫(yī)生評估來降低或增加。
[0099] 術(shù)語"單位劑型"是指用于人類受試者的含有單一劑量的離散物理單元，每個(gè)單次 劑量含有計(jì)算的預(yù)定量的活性物質(zhì)以產(chǎn)生所希望的治療效果，與合適的藥物賦形劑混合。 單次劑量的典型形式包括管形瓶，注射器，液體組合物的單劑量瓶，或丸劑，片劑，膠囊或類 似的固體組合物的情況。
[0100] 該納米構(gòu)建物可以以藥物形式以傳統(tǒng)的或修飾的（延長，延遲或重復(fù)）釋放，胃腸 外大體積釋放，胃腸外小體積釋放，單劑量釋放或多劑量釋放來給予。
[0101] 含有納米構(gòu)建物的藥物產(chǎn)品還可以通過口服、乳房內(nèi)，和皮膚給藥為獸醫(yī)使用。
[0102] 最后，各種制劑的納米構(gòu)建物也可用于研宄目的。
[0103] 典型地，固體形式的組合物每單位劑量可含有的納米構(gòu)建物的量為50至1000毫 克，優(yōu)選從200至500毫克，液體形式的組合物中可含有的納米構(gòu)建物的量為每毫升10至 200毫克組合物，優(yōu)選每毫升40-100毫克組合物。
[0104] 制各方法
[0105] 本發(fā)明還涉及一種制備本文所述的納米構(gòu)建物的方法，包含以下步驟：
[0106] a)預(yù)先準(zhǔn)備具有由連接體活化的兩性聚合物的外涂層的無機(jī)納米粒子的溶液/ 懸浮液；
[0107] b)將一種或多種活性分子加入所述溶液/懸浮液，使這些分子與所述連接體反 應(yīng)。
[0108] 該方法的不同步驟詳細(xì)描述如下：
[0109] 在步驟a)中，預(yù)先準(zhǔn)備無機(jī)納米粒子或復(fù)合物（帶有第一有機(jī)涂層的無機(jī)核）的 溶液/懸浮液，如上所述。
[0110] 隨后的兩性涂層優(yōu)選地由聚（異丁烯-交替-馬來酸酐）和十二烷基胺的縮合獲 得。
[0111] 由此得到的構(gòu)建物與偶聯(lián)連接體活化，如2, 2-(亞乙二氧基）二（乙胺）（EDBE)。
[0112] 在步驟b)中，一種或多種活性分子加入所述活化的溶液/懸浮液，使其按照在圖 14中詳細(xì)示出的反應(yīng)方案反應(yīng)。
[0113] 偶聯(lián)的該活性分子優(yōu)選是能夠選擇性抑制屬于NFAT家族的蛋白的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路 的肽。
[0114] 在該方法的各步驟之間還設(shè)置有一個(gè)或多個(gè)洗滌和/或濃縮的步驟。進(jìn)行洗滌和 濃縮的步驟對本領(lǐng)域技術(shù)人員是熟知的。
[0115] 本發(fā)明已經(jīng)在此參照其某些實(shí)施例描述。據(jù)了解，基于相同的發(fā)明構(gòu)思的其他實(shí) 施方式也可能存在，而不偏離權(quán)利要求書所規(guī)定的保護(hù)范圍。 實(shí)施例
[0116] L 1制各與VIVIT肽偶聯(lián)的納米構(gòu)律物的方法
[0117] 市售的無機(jī)納米粒子（例如AC診斷公司）涂覆有長鏈?zhǔn)杷员砻婊钚詣ɡ?涂布有油酸或油胺的磁鐵礦），其具有在3至50納米之間的均勻尺寸，給所述無機(jī)納米粒子 涂覆兩性聚合物，如在C.-A J. Lin等在Small 2008, 3, 334-341，中所述，由聚（異丁烯-馬 來酸酐）和十二烷胺的縮合獲得。PM以0.5M的濃度溶于氯仿，并添加（110 μ 1)至納米粒 子的分散體中，也在氯仿中（在1. 〇毫升中10毫克的初始濃度），然后將混合物均質(zhì)化，溶 劑然后減壓蒸發(fā)。將所得固體再懸浮于PH 12的硼酸鈉緩沖液，以得到穩(wěn)定和均勻的納米 粒子（MYTS)分散體，必要時(shí)使用超聲（超聲波儀）。所述MYTS被濃縮并用蒸餾水洗滌兩 次，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。含MYTS的溶液與0. 05Μ(3 μ 1)的2, 2-(亞乙二氧基）-雙 (乙胺）（EDBE)在0· IM (8 μ 1)的1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC) 的存在下反應(yīng)至少1. 5小時(shí)。多次洗滌之后，所述納米粒子在N-琥珀酰亞胺基-3-[2-吡 啶二硫]丙酸酯（STOP)的存在（300 μ1，10π^/πι1的濃度）下攪拌4小時(shí)，然后將混合物濃 縮并洗滌兩次，得到 MFN1。最后，具有序列 NH2-CGGGKMAGPVIVITGPHEE-COOH(SEQ ID ΝΟ:1) 的肽（13 μ 1，lmg/ml的濃度）和PEG-SH(具有約500Da分子量，10 μ 1，濃度為10mg/ml)加 入到該混合物中。該混合物在環(huán)境溫度下攪拌2小時(shí)后，然后濃縮納米粒子（MYTS)的懸浮 液。肽的偶聯(lián)過程示于圖1中。
[0118] 為確定布置在MYTS納米粒子上的肽/PEG的量，上清液經(jīng)過紫外分析，并且在 343nm讀取的吸光度來確定釋放的吡啶-2-硫酮濃度。被肽和PEG官能化的納米粒子然后 用水洗滌兩次，通過UV測量值與校準(zhǔn)線進(jìn)行比較來確定最終濃度。
[0119] L 2制各與抗病毒劑恩夫韋地偶聯(lián)的納米構(gòu)律物的方法
[0120] 市售的無機(jī)納米粒子（例如AC診斷公司）涂覆有一個(gè)長鏈?zhǔn)杷员砻婊钚詣ɡ?如涂布有油酸或油胺的磁鐵礦），其具有在3至50納米之間的均勻的尺寸，給所述無機(jī)納米 粒子涂覆兩性聚合物，如在C. -A J. Lin等在Smal 12008, 3, 334-341，C-A中所述的，由聚（異 丁烯-馬來酸酐）和十二烷胺的縮合獲得。PM以0.5M的濃度溶于氯仿，并添加（110 μ 1) 至納米粒子的分散體中，也在氯仿中（在1. 0毫升中10毫克的初始濃度），然后將混合物 均質(zhì)化，溶劑然后減壓蒸發(fā)。將所得固體再懸浮于ΡΗ12的硼酸鈉緩沖液，以得到穩(wěn)定和均 勻的納米粒子（MYTS)分散體，必要時(shí)使用超聲（超聲波儀）。所述MYTS被濃縮并用蒸餾 水洗滌兩次，本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。含MYTS的溶液與0. 05Μ(3 μ 1)的2, 2-(亞乙二氧 基）-雙（乙胺）（EDBE)在0· IM (8 μ 1)的1-乙基-3- (3-二甲氨基丙基）碳化二亞胺鹽酸 鹽（EDC)的存在下反應(yīng)至少1.5小時(shí)。多次洗滌后，所述納米構(gòu)建物用恩夫韋地（SEQ ID NO:6) (5 μ g溶解在水中，濃度為lmg/ml)處理2小時(shí)，然后混合物濃縮并用水洗絳兩次。
[0121] L 3制各與有機(jī)熒光閉偶聯(lián)的納米構(gòu)律物的方法
[0122] 將I. OM的熒光胺溶液（DMSO中0. 5ml)加入到0. 5M的PMA的CHCl3 (5ml)溶液中。 混合物在攪拌下反應(yīng)一夜，得到MYTS的溶液。該溶液（63 μ 1)加入MYTS的溶液（CHCl3中， 4.6mg)，然后將混合物均質(zhì)化，溶劑減壓蒸發(fā)。加入硼酸鈉緩沖溶液（SBB，pH12，10ml)以及 通過在3500rpm離心（1小時(shí)），在Amicon管中濃縮納米粒子懸浮液（截止IOOkDa)。熒光 納米粒子洗滌兩次，用SBB稀釋，并濃縮（在3500rpm下每個(gè)離心循環(huán)持續(xù)約20分鐘）至 達(dá)到200 μ 1的終體積。
[0123] L 4制各含有與有機(jī)熒光閉偶聯(lián)，或未偶聯(lián)的納米構(gòu)律物的Α/0乳霜的方法
[0124] 120 μ I MYTS或MYTS-FITC的納米粒子（40微克/毫升，H2O)的懸浮液與大約60 毫克的連續(xù)親脂相的商業(yè)基質(zhì)乳霜（例如埃塞克斯，先靈葆雅S.p.A)混合，然后通過漸進(jìn) 方案評估最多總計(jì)600毫克乳霜。
[0125] 2.牛物樽塑實(shí)駘
[0126] 2. 1驗(yàn)證納米構(gòu)建物擴(kuò)散入DC的胞質(zhì)空間的能力的實(shí)驗(yàn)
[0127] 為了評估本發(fā)明的納米構(gòu)建物是否能夠到達(dá)細(xì)胞胞質(zhì)溶膠，用DC進(jìn)行了測試。特 別是，源自小鼠骨髓的DC與如實(shí)施例1中所述的制備的納米構(gòu)建物在體外溫育5小時(shí)，通 過TEM(代表透射電子顯微鏡）方法測量它們擴(kuò)散到胞質(zhì)空間的能力。觀察到的是，部分 直接穿透細(xì)胞膜，部分逃避核內(nèi)體所致的逃逸隔室化作用，所述納米構(gòu)建物能擴(kuò)散入胞質(zhì) 空間（圖1)。目標(biāo)Cn蛋白基本上定位在胞質(zhì)溶膠，因此到達(dá)胞質(zhì)溶膠的能力是具有序列 VIVIT到靶蛋白的肽的主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)所必需的。
[0128] 2. 2抑制NFAT的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路
[0129] 制備如實(shí)施例1中所述的納米構(gòu)建物，抑制NFAT的體外轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路。
[0130] 為了評估納米構(gòu)建物是否能夠抑制NFAT的轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路，進(jìn)行了下面的體外實(shí) 驗(yàn)。暴露于LPS之后，源自骨髓的DC能產(chǎn)生各種炎性細(xì)胞因子，包括IL-2和TNFa。IL-2 嚴(yán)格依賴于即41'，而了即€[的產(chǎn)生依賴于即-108而不依賴于即41'。因此11^-2和了即€[分 別是NFAT和NF- κ B活化途徑的有效標(biāo)記物。與如實(shí)施例1中所述獲得的納米構(gòu)建物預(yù)處 理2小時(shí)后，來源于骨髓的DC用LPS刺激以及釋放的細(xì)胞因子量用ELISA法在18小時(shí)后 測定。如圖2所示，納米構(gòu)建物完全阻斷IL-2,但不阻斷TNFa的產(chǎn)生，這表明這些納米粒 子能夠在體外選擇性地有效抑制先天免疫系統(tǒng)的細(xì)胞內(nèi)的NFAT轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路。
[0131] 2. 3抑制NFAT的體內(nèi)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
[0132] 突變小鼠（從羅納德Η.施瓦茨的實(shí)驗(yàn)室獲得，美國國立衛(wèi)生研宄院，貝塞斯達(dá)） 用于本實(shí)驗(yàn)。在該小鼠模型中，將GFP蛋白插入基因 IL-2的第二外顯子，并因此具有與IL-2 相同的調(diào)節(jié)作用。如前所述，IL-2是NFAT活化的標(biāo)志物。如果用LPS處理針對IL-2/GFP 作遺傳學(xué)修飾的小鼠，處理后兩小時(shí)可在脾臟轉(zhuǎn)檢測到顯著百分比的GFP+嗜中性粒細(xì)胞 (Ly6G+細(xì)胞）。為了驗(yàn)證本發(fā)明的納米構(gòu)建物是否能夠抑制NFAT在體內(nèi)的信號通路，在注 射LPSl前兩小時(shí)對突變體小鼠靜脈注射如實(shí)施例1制備的納米構(gòu)建物。如圖3所示，納米 構(gòu)建物的預(yù)處理對嗜中性粒細(xì)胞以NFAT依賴性方式產(chǎn)生GFP的能力有很大影響，這表明該 納米構(gòu)建物能夠在體內(nèi)抑制NFAT的傳導(dǎo)信號通路。
[0133] 2. 4在體內(nèi)抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥模型中NFAT依賴性的水腫形成
[0134] 水腫形成是炎癥過程產(chǎn)生的第一步驟之一，并且是炎癥介質(zhì)的局部積累的必需過 程。局部腫脹也與引流淋巴結(jié)處的游離抗原轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)。存在于炎癥組織中的抗原在兩個(gè)連 續(xù)階段被運(yùn)送到淋巴結(jié)。在到達(dá)的第一階段，游離形式的抗原進(jìn)入傳入淋巴管，并到達(dá)引流 淋巴結(jié)。在之后發(fā)生的第二階段，抗原被運(yùn)送附著于DC。水腫形成引起的間質(zhì)壓力增加促 使部分細(xì)胞間液進(jìn)入傳入淋巴管并促進(jìn)游離抗原進(jìn)入傳入淋巴管本身和游離抗原到達(dá)引 流淋巴結(jié)。
[0135] 在以前的研宄中，已經(jīng)表明暴露于LPS后由DC表達(dá)的基因 Ptgesl是由NFAT調(diào)節(jié)。 Ptgesl是一種被稱為微粒體前列腺素 IE合酶I (mPGES-1)的蛋白質(zhì)。mPGES-1連同環(huán)氧合 酶-2 (COX-2)和磷脂酶A2 (cPLA2)合力調(diào)整導(dǎo)致PGE2產(chǎn)生的生物合成過程，PGE2是參與 許多生理和病理生理反應(yīng)調(diào)節(jié)的更加靈活的前列腺素之一，包括通過血管擴(kuò)張?jiān)谘装Y過程 中形成局部水腫。本發(fā)明人觀察到LPS誘導(dǎo)的水腫形成是DC-和NFAT依賴性。因此，由于 對暴露于LPS后經(jīng)NFAT的水形成具有調(diào)節(jié)作用以及PGE 2的產(chǎn)生，DS調(diào)節(jié)游離抗原到達(dá) 引流淋巴結(jié)。因此，NFAT/mPGES-1通路代表了抗炎治療的可能靶點(diǎn)。
[0136] 為了評估本發(fā)明的納米粒子是否能在體內(nèi)抑制LPS誘導(dǎo)的水腫形成，在對小鼠爪 子注射LPS前2小時(shí)，用實(shí)施例1的納米構(gòu)建物或FK506作為對照作皮下預(yù)處理，或者不處 理。如圖4所示，由LPS誘導(dǎo)的NFAT依賴性的水腫形成被本發(fā)明的納米構(gòu)建物顯著抑制， 確認(rèn)這些納米粒子可以在體內(nèi)有效地抑制Cn介導(dǎo)的NFAT活化。
[0137] 2. 5在IL/LPS類型的抗膠原抗體誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型中抑制炎性關(guān)節(jié)炎的發(fā) 展
[0138] 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（AR)是一種慢性，令人衰弱的全身性自身免疫疾病，其特征是伴有 多關(guān)節(jié)滑膜炎的滑液和間葉組織的免疫炎癥反應(yīng)。隨著時(shí)間的推移，這會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)和關(guān)節(jié) 周圍結(jié)構(gòu)的進(jìn)行性破壞。NFAT在發(fā)炎關(guān)節(jié)的造血和間充質(zhì)細(xì)胞中實(shí)質(zhì)性活躍，最近已表明， NFATc2和c3同種型在關(guān)節(jié)炎小鼠模型中滑膜炎的對稱性和強(qiáng)度調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用，其中所 述炎性過程不依賴于淋巴細(xì)胞（適應(yīng)性免疫）。這表明NFAT分子在和類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的發(fā)病 機(jī)理相關(guān)的先天免疫中是一個(gè)全新的角色。為了驗(yàn)證本發(fā)明的納米構(gòu)建物是否能夠抑制炎 性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展，使用IL/LPS類型的抗膠原抗體誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎模型。特別是，6只C57BL6 小鼠用實(shí)施例1的納米構(gòu)建物在第 _1，〇，+1，3,6,9,+12天進(jìn)彳丁處理。如圖5所不，納米構(gòu) 建物非常有效地抑制關(guān)節(jié)炎發(fā)展。
[0139] 2. 6皮膚移植排斥反應(yīng)的抑制作用
[0140] 為了驗(yàn)證本發(fā)明的納米構(gòu)建物是否能夠抑制移植排斥，使用了皮膚移植模型。通 常情況下，雌性小鼠中的雄性小鼠皮膚移植物在大約三周內(nèi)在90-100 %的小鼠中發(fā)生排 斥。因此對雌性小鼠進(jìn)行雄性皮膚條的移植，并在移植的前一天開始，每三天用實(shí)施例1的 納米構(gòu)建物處理。每天檢查移植物狀態(tài)。四周后，用承載了 VIVIT肽的納米構(gòu)建物處理的 90%的雌性小鼠接受了皮膚移植物，用對照納米構(gòu)建物處理的小鼠80%排斥了移植物（圖 6)。該實(shí)驗(yàn)表明，VIVIT納米構(gòu)建物能有效地抑制體內(nèi)針對次要組織相容性抗原的免疫應(yīng) 答。
[0141] 2. 7抑制體外NFAT轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路的對比實(shí)驗(yàn)
[0142] 如果用LPS刺激，DC以NFAT依賴性方式產(chǎn)生IL-2。為了評估VIVIT肽的功效， 通過使用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，用編碼與綠色熒光蛋白融合的VIVIT肽的序列轉(zhuǎn)導(dǎo)源自骨髓的 DC0
[0143] 如圖8所示，在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的VIVIT肽能夠完全阻斷IL-2的表達(dá)，而它無法阻斷 TNF- α的表達(dá)，一種由樹突狀細(xì)胞對LPS起反應(yīng)以不依賴于NFAT的方式產(chǎn)生的細(xì)胞因子。
[0144] 為通過可以在體內(nèi)使用并且不需要細(xì)胞感染或轉(zhuǎn)染的方式而藥理學(xué)阻斷先天免 疫細(xì)胞中的NFAT功能，我們分析了各種可能的遞送系統(tǒng)，以便確定能夠?qū)IVIT肽傳送到 細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的系統(tǒng)，其中NFAT的活性必須被阻斷。
[0145] 由于DC是吞噬細(xì)胞，我們首先使用非修飾的肽，假設(shè)它一旦進(jìn)入核內(nèi)體隔室，可 能達(dá)到細(xì)胞胞質(zhì)溶膠。然后我們將DC與VIVIT肽共培養(yǎng)，通過測定LPS刺激后的IL-2產(chǎn) 生來分析NFAT的抑制情況。如圖9所示，游離、未修飾的VIVIT肽不能干擾NFAT的活性。 然后評估修飾的VIVIT肽，其附著疏水性11-精氨酸尾。事實(shí)上，在文獻(xiàn)中已描述，這種修 飾可以允許進(jìn)入細(xì)胞。然而，此修飾也沒有產(chǎn)生期望的結(jié)果，也沒能觀察到對LPS在DC內(nèi) 誘導(dǎo)的NFAT通路有任何抑制作用（圖9)。
[0146] 使用從包含有VIVIT序列的脂質(zhì)體制品得到的磷脂基脂質(zhì)體。這樣的制品在LPS 刺激之前與DC孵育。但是，即使是這樣的系統(tǒng)也沒有被證明能有效抑制細(xì)胞內(nèi)NFAT的功 能（圖10)。此外，還有不可能確定活性成分負(fù)載的進(jìn)一步缺點(diǎn)，這將會(huì)導(dǎo)致每個(gè)制品的結(jié) 果不一致。
[0147] 由于脂質(zhì)體的制劑沒有在DC中的VIVIT肽轉(zhuǎn)運(yùn)中表現(xiàn)出任何功效水平，我們分析 了作為新傳遞系統(tǒng)的磁性納米粒子。然后如圖IlA所示，用連接體將VIVIT肽偶聯(lián)至納米 粒子，以形成測量直徑約8nm結(jié)晶磁鐵礦的磁性核。如之前脂質(zhì)體制劑所描述的，直接與 VIVIT肽偶聯(lián)的納米粒子先與DC -起溫育，再用LPS刺激。在這種情況下，也沒能觀察到 DCS中由LPS誘導(dǎo)的NFAT途徑有任何抑制作用（圖11B)。
[0148] 2. 8驗(yàn)證偶聯(lián)到PEG的納米構(gòu)建物擴(kuò)散到樹突狀細(xì)胞的胞質(zhì)空間能力的實(shí)驗(yàn)
[0149] 5000000個(gè)來源于骨髓的DC鋪在100毫米平板中的完全培養(yǎng)基中，并與MYTS納米 粒子（25微克/毫升）孵育5小時(shí)。然后分離DC，用PBS洗絳，并用2. 5%戊二醛固定。然 后在1. 5%的四氧化鋨中后固定細(xì)胞，然后以升序規(guī)模的酒精脫水并浸入環(huán)氧樹脂。
[0150] 該樣品通過切片機(jī)切割并用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色。然后將切片用TEM(圖 13)進(jìn)行測定。
[0151] 2. 9驗(yàn)證偶聯(lián)到抗病毒劑恩夫韋地的納米構(gòu)建物擴(kuò)散到神經(jīng)元細(xì)胞的胞質(zhì)空間能 力的實(shí)驗(yàn)
[0152] Balb/c裸鼠靜脈注射只含有熒光染料AlexaFlu〇r660 (AF660)標(biāo)記的抗逆轉(zhuǎn)錄病 毒藥物恩夫韋地（已知通過血腦屏障滲透性很差）的溶液，或偶聯(lián)至納米粒子（MYTS)的 恩夫韋地（仍標(biāo)記AF660)。1小時(shí)后，在此期間，小鼠保持仰臥睡眠并在頭骨放有磁鐵，將 從MYTS/恩夫韋地或游離恩夫韋地處理的小鼠分離的腦樣品冰凍切片。然后，用熒光探針 NeuroTrace(染色Nissi物質(zhì)，其含有豐富的神經(jīng)元細(xì)胞，并由與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)的核糖體RNA 形成）染色神經(jīng)元。神經(jīng)細(xì)胞的細(xì)胞核也用DAPI標(biāo)記，通過共聚焦顯微鏡觀察與納米粒子 偶聯(lián)或不偶聯(lián)的藥物相關(guān)AF660信號。結(jié)果顯示僅在藥物偶聯(lián)于MYTS納米粒子的情況下， 熒光藥物在神經(jīng)元中積累（圖12)。
[0153] 2. 10驗(yàn)證體內(nèi)含有偶聯(lián)到熒光分子的納米構(gòu)建物的乳霜通過皮膚擴(kuò)散能力的實(shí) 驗(yàn)
[0154] 將含有高濃度的標(biāo)記或未標(biāo)記熒光團(tuán)的納米粒子的分散體（分別為MYTS-FITC和 MYTS)以基質(zhì)乳霜約兩倍的量摻入和然后以連續(xù)稀釋加入基質(zhì)乳霜的其余部分，混合直至 完全同質(zhì)化。然后連續(xù)三天將上述制劑施加在C57BL/6小鼠預(yù)先剃毛的皮膚上（面積為1 平方厘米）。處死小鼠，從治療的皮膚區(qū)域制得單細(xì)胞懸液。然后用FACS分析細(xì)胞，以確定 在造血來源（CD45+)的細(xì)胞，而非（CD45-)的細(xì)胞中的攝取。從圖中可以看出，納米粒子被 這兩組細(xì)胞吸收。
[0155] 序列詳沐
[0156] 序列表
[0157]

【權(quán)利要求】
1. 在細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中轉(zhuǎn)運(yùn)活性分子的方法，包括如下步驟： a) 預(yù)先準(zhǔn)備一包含無機(jī)納米粒子的納米構(gòu)建物（MYTS)，所述無機(jī)納米粒子具有兩性 聚合物基涂層和通過所述兩性涂層結(jié)合到所述粒子的活性分子； b) 將所述細(xì)胞接觸所述納米構(gòu)建物。
2. 如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述無機(jī)納米粒子是金屬或金屬氧化物。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述納米構(gòu)建物由Au、Ag、Fe、Mn組成，或由 γ -Fe203、Fe304、MnFe20 4、CoFe204、MnO、Ti02、Si02、CeO 2或選自 CdSe、CdS、CdSe/ZnS 的量子 點(diǎn)組成。
4. 如權(quán)利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述兩性聚合物由嵌段共聚物組成。
5. 如權(quán)利要求1-4任一所述的方法，其特征在于，所述兩性聚合物由聚（異丁烯-交 替-馬來酸酐）和十二烷基胺（PM)縮合得到。
6. 如權(quán)利要求1-5任一所述的方法，其特征在于，所述活性分子還通過連接體，經(jīng)由可 逆或不可逆的鍵結(jié)合到兩性涂層。
7. 如權(quán)利要求1-6任一所述的方法，其特征在于，所述連接體是可逆的，并且包括二硫 鍵。
8. 如權(quán)利要求1-7任一所述的方法，其特征在于，所述活性分子選自下組：寡肽或多 肽、糖、寡糖或多糖、DNA、RNA、siRNA、miRNA序列、合成聚合物或藥理學(xué)活性分子。
9. 如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述活性分子是選自下組的肽：SEQ ID NO: 6 (恩夫韋地），有利于物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的肽（核定位序列），或包含序列SEQ ID NO :5的肽。
10. 如權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，所述活性物質(zhì)是具有序列SEQ ID NO: 1、2、 3、4、5的肽。
11. 一種包含無機(jī)納米粒子的納米構(gòu)建物，所述無機(jī)納米粒子具有兩性聚合物基的外 涂層和通過所述兩性涂層結(jié)合到所述納米粒子的具有藥理學(xué)活性的分子，用于治療與定位 于細(xì)胞胞質(zhì)溶膠中的分子事件或過程的相關(guān)疾病。
12. 如權(quán)利要求11所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述的無機(jī)納米粒子是金屬或金 屬氧化物。
13. 如權(quán)利要求11或12所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述納米粒子由Au、Ag、Fe、 皿11組成，或由丫-卩620 3、卩6304、]\^^204、&^6 204、]\1110、1102、5102、〇60 2或選自〇(156、〇(15、〇(156/ ZnS的量子點(diǎn)組成。
14. 如權(quán)利要求11-13所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述兩性聚合物由嵌段共聚物 組成。
15. 如權(quán)利要求14所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述兩性聚合物由聚（異丁烯-交 替-馬來酸酐）和十二烷基胺（PM)縮合得到。
16. 如權(quán)利要求11-15任一所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述活性分子還通過連接 體，經(jīng)由可逆或不可逆的鍵結(jié)合到兩性涂層。
17. 如權(quán)利要求11-16任一所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述連接體是可逆的，并 且包括^硫鍵。
18. 如權(quán)利要求11-17任一所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述活性分子選自下組： 寡肽或多肽、糖、寡糖或多糖、DNA、RNA、siRNA、miRNA序列、或合成聚合物或藥理學(xué)活性分 子。
19. 如權(quán)利要求11-18任一所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述活性分子是選自下組 的肽：SEQ ID NO :6 (恩夫韋地），有利于物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞核的肽（核定位序列），或包含序列 SEQ ID NO : 5 的肽。
20. 如權(quán)利要求19所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述活性物質(zhì)是具有序列SEQ ID N0:l、2、3、4、5 的肽。
21. 如權(quán)利要求11-20任一所述的納米構(gòu)建物，包含第二生物相容性化合物，通過所述 兩性聚合物結(jié)合到所述納米粒子。
22. 如權(quán)利要求11-21任一所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述納米粒子的尺寸包括 在5至100納米之間。
23. 如權(quán)利要求11-22任一所述的納米構(gòu)建物，用于治療定位于細(xì)胞胞質(zhì)溶膠或細(xì)胞 核的蛋白功能改變的相關(guān)疾病。
24. 如權(quán)利要求19或20所述的納米構(gòu)建物，用于治療以便選擇性抑制屬于NFAT家族 的蛋白質(zhì)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。
25. 如權(quán)利要求24所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述的疾病是炎性狀態(tài)。
26. 如權(quán)利要求25所述的納米構(gòu)建物，其特征在于，所述的疾病選自下組：類風(fēng)濕關(guān) 節(jié)炎，炎性腸病，同種異體或異種移植排斥反應(yīng)，敗血病，再生障礙性貧血，銀肩病，水腫，紅 斑性狼瘡，I型糖尿病，哮喘，肺纖維化，硬皮病，皮肌炎，干燥綜合征，川崎病，橋本氏甲狀 腺炎，自身免疫性溶血性貧血，特發(fā)性血小板減少，慢性腎小球腎炎，多發(fā)性硬化，囊性纖維 化，慢性復(fù)發(fā)性肝炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化，過敏性鼻炎，過敏性結(jié)膜炎，特應(yīng)性皮炎，克羅 恩病，潰瘍性結(jié)腸炎，結(jié)腸炎/炎癥性腸綜合征，自身免疫性甲狀腺炎，獲得性免疫缺陷性 疾病，阿爾茨海默氏病，帕金森病，腫瘤。
27. -種藥物組合物，含有如權(quán)利要求11至25任一項(xiàng)所述的納米構(gòu)建物和一種或多種 賦形劑，用于治療疾病或炎性狀態(tài)。
28. 如權(quán)利要求27所述的組合物，其特征在于，所述疾病選自下組：類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，炎 性腸病，同種異體或異種移植排斥反應(yīng)，敗血病，再生障礙性貧血，銀肩病，水腫，紅斑性狼 瘡，I型糖尿病，哮喘，肺纖維化，硬皮病，皮肌炎，干燥綜合征，川崎病，橋本氏甲狀腺炎，自 身免疫性溶血性貧血，特發(fā)性血小板減少，慢性腎小球腎炎，多發(fā)性硬化，囊性纖維化，慢性 復(fù)發(fā)性肝炎，原發(fā)性膽汁性肝硬化，過敏性鼻炎，過敏性結(jié)膜炎，特應(yīng)性皮炎，克羅恩病，潰 瘍性結(jié)腸炎，結(jié)腸炎/炎癥性腸綜合征，自身免疫性甲狀腺炎，獲得性免疫缺陷性疾病，阿 爾茨海默氏病，帕金森病，腫瘤。
29. 如權(quán)利要求27或28任一所述的藥物組合物，適合于口服，靜脈內(nèi)，肌內(nèi)，皮下，經(jīng) 皮，鼻，陰道，直腸或腹膜內(nèi)給藥。
30. -種制備如權(quán)利要求19至26任一所述的納米構(gòu)建物的方法，包括以下步驟： a) 預(yù)先準(zhǔn)備具有由連接體活化的兩性聚合物的外涂層的無機(jī)納米粒子的溶液/懸浮 液； b) 將一種或多種活性分子加入所述溶液/懸浮液，使其與所述連接體反應(yīng)。
31. 如權(quán)利要求30所述的方法，其特征在于，所述的兩性聚合物由連接體激活，從而產(chǎn) 生可逆或不可逆的鍵。
32.如權(quán)利要求31所述的方法，其特征在于，所述可逆鍵是根據(jù)圖14的方案獲得的。
【文檔編號】A61K49/18GK104519914SQ201380038523
【公開日】2015年4月15日 申請日期:2013年7月19日 優(yōu)先權(quán)日:2012年7月19日
【發(fā)明者】F·格蘭馳, D·普羅斯佩里, I·扎諾尼, F·R·M·科西, M·科隆博 申請人:米蘭比可卡大學(xué), 米蘭大學(xué)