具有人工內(nèi)共生生物的宿主細胞的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明大體上涉及包含單細胞生物體的真核細胞，所述單細胞生物體是通過人類干預引入所述真核細胞中且通過至少五次細胞分裂轉(zhuǎn)移到所述真核細胞的子代細胞中；以及將所述單細胞生物體引入真核細胞中的方法。本發(fā)明提供單細胞生物體，其將在子代細胞中維持的表型引入真核細胞中。本發(fā)明另外提供含有趨磁細菌的真核細胞。
【專利說明】具有人工內(nèi)共生生物的宿主細胞
[0001] 相關(guān)申請案的奪叉參考
[0002] 本發(fā)明主張2012年1月13日申請的標題為"具有人工內(nèi)共生生物的宿主細胞 (HOST CELLS WITH ARTIFICIAL END0SYMBI0NTS)"的美國專利申請案第 13/374, 799號的優(yōu) 先權(quán)益，其全部揭示內(nèi)容出于所有目的全文以引用方式并入本文中。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明大體上涉及內(nèi)共生、人工內(nèi)共生生物和趨磁細菌領(lǐng)域。具體來說，本發(fā)明提 供單細胞生物體（例如包括趨磁細菌的人工內(nèi)共生生物）、用作那些單細胞生物體的宿主 的真核細胞以及將所述單細胞生物體引入所述真核細胞中的方法。

【背景技術(shù)】
[0004] 線粒體、葉綠體和其它膜結(jié)合細胞器增加真核細胞的可遺傳功能性，例如光合作 用。相信所述細胞器（通過其退化環(huán)狀DNA所鑒別）可以內(nèi)共生方式取得。
[0005] 細菌與眾多種各種真核細胞中不存在的功能性共存。例如，在1975年，布萊克莫 爾（Blakemore)鑒別沿地磁場定向并浮動的趨磁細菌（MTB)。（布萊克莫爾，R.趨磁細菌 (Magnetotactic bacteria.)科學（Science)24:377-379(1975)(其出于所有目的全文以 引用方式并入））。這些趨磁細菌產(chǎn)生稱為磁小體的磁性結(jié)構(gòu)，其由脂質(zhì)膜包封的磁鐵礦 (Fe 304)或硫復鐵礦（Fe3S4)組成。（同一文獻）。自從首次發(fā)現(xiàn)MTB物種起，已鑒別大量MTB 物種。（同一文獻）。
[0006] 趨磁細菌已用于選擇性結(jié)合到并分離物質(zhì)。（美國專利第4, 677, 067號（其出 于所有目的全文以引用方式并入））。另外，已嘗試通過外部標簽為細胞增加磁性功能 性。（斯維斯頓，八.工（5?^81:〇11，八.]\)、程，〇(〇16叩，〇、宋，!1.11.(5〇〇叩，!1.11.)、歐文，0· J. (Irvine, D. J.)、科恩，R. J. (Cohen, R. J.)、魯布納，M. F. (Rubner, M. F.)用多層貼片對活 細胞進行表面功能化（Surface Functionalization of Living Cells with Multilayer Patches).納米快報（Nano Lett. )8 (12) :4446-53 (2008)(其出于所有目的全文以引用方 式并入））。細菌磁鐵礦也已通過細胞融合引入紅血細胞中（松永，T. (Matsunaga，T.)、 神谷，S. (Kamiya, S.) (1988)，渥美，K. (Atsumi, Κ·)、小谷，M. (Kotani, Μ·)、上野，S. (Ueno, S.)、卡蒂拉 T. (Katila Τ·)、威廉姆森，S. J. (Williamsen, S. J.)(編輯）第 6 屆國際 生物磁學會議（6th International Conference on Biomagnetisms) (1987).東京電機大 學出版社（Tokyo Denki University Press),東京，第50-51頁（其出于所有目的全文以 引用方式并入）），且MTB已通過吞噬作用引入粒細胞和單核細胞中。（松永，T.、橋本，K. (Hashimoto, K.)、中村，N. (Nakamura, N.)、中村，K.、橋本，S.白血球?qū)毦盆F礦的吞噬 作用（Phagocytosis of bacterial magnetite by leucocytes).應用微生物學和生物技 術(shù)（Applied Microbiology and Biotechnology)31(4):401_405(1989)(其出于所有目的 全文以引用方式并入））。然而，這些改變都不可遺傳給子代細胞。
[0007] 本發(fā)明的目標是提供含有單細胞生物體的真核細胞，所述單細胞生物體是通過人 類干預引入真核細胞中，其經(jīng)過至少五次細胞分裂轉(zhuǎn)移到真核細胞的子代細胞中且其在子 代細胞中維持足夠拷貝數(shù)，從而使得在子代細胞中維持通過單細胞生物體引入的所需功能 性。本發(fā)明的另一目標是提供含有可遺傳給子代細胞的人工內(nèi)共生生物的真核宿主細胞。 本發(fā)明的另一目標是提供將人工內(nèi)共生生物引入真核宿主細胞的胞質(zhì)溶膠中的方法。本發(fā) 明的另一目標是提供具有可遺傳磁性表型的真核細胞。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明涉及包含單細胞生物體（例如人工內(nèi)共生生物）的真核細胞和將所述單細 胞生物體引入真核細胞中的方法。在一個實施例中，單細胞生物體為真核細胞提供所需功 能性。在一個實施例中，單細胞生物體是可遺傳給子代細胞的人工內(nèi)共生生物。在另一實 施例中，人工內(nèi)共生生物是趨磁細菌。在一個實施例中，趨磁細菌為真核細胞提供磁性功能 性。本發(fā)明人工內(nèi)共生生物可通過使至少一個基因發(fā)生缺失、添加和/或突變來修飾，人工 內(nèi)共生生物藉此獲得可用于內(nèi)共生或向生體性的性狀。人工內(nèi)共生生物中要發(fā)生突變、添 加和/或缺失的基因可為編碼鞭毛組合件的組份的基因和編碼用于合成必需高分子（例如 氨基酸、核苷酸、維生素和輔因子）的酶的基因。在某些實施例中，MTB可經(jīng)進一步修飾以 表達抗生素抗性基因或其它可選擇標記。
[0009] 在一些實施例中，本發(fā)明真核細胞是哺乳動物，例如小鼠、大鼠、兔子、倉鼠、人類、 豬、?；蛉Ｔ诹硪粚嵤├?，將人工內(nèi)共生生物從宿主細胞傳遞到子代宿主細胞中。在另 一實施例中，所述方法進一步包含使真核細胞中的至少一個基因發(fā)生缺失、插入和/或突 變。
[0010] 可通過所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的多種方法將本發(fā)明單細胞生物體引入真核細胞 中，所述方法包括（但不限于）微注射、天然吞噬作用、誘導吞噬作用、巨胞飲作用、其它細 胞內(nèi)化過程、脂質(zhì)體融合、紅細胞血影融合或電穿孔。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1顯示在gfp+AMB的最高約108MTB/mL的對數(shù)級濃度中用?\脈沖序列生成的正 反差，所述gfp+AMB使用1. 5Τ儀器懸浮于瓊脂塞中以優(yōu)化并表征成像性質(zhì)。
[0012] 圖2顯示在2細胞胚胎期其兩個細胞中的一個已經(jīng)gfp+AMB微注射的囊胚期小鼠 胚胎。胚胎是用Leica SP2 A0BS光譜型共焦倒置顯微鏡來成像，周圍是用于活細胞成像的 環(huán)境控制室，且使用20X的0.7NA物鏡和3X光學變焦。圖A顯示微分干涉差（DIC)圖像 且圖B顯示同一圖像的灰度熒光捕獲。
[0013] 圖3顯示如通過共焦顯微術(shù)所測量，4個小鼠胚胎的總胚胎GFP熒光隨時間的變 化。來自2細胞期的每一胚胎的兩個細胞中的一個已經(jīng)gfp+AMB微注射，且每一胚胎的總 GFP熒光是在8細胞期在微注射后24小時開始測量。

【具體實施方式】
[0014] 本發(fā)明是以實例性方式而不是限制性方式來闡釋。應注意，在本揭示內(nèi)容中提到 "一（an) "或"一（one) "或"一些"實施例時，不一定是指同一實施例，且所有所述說法意指 至少一。
[0015] 本發(fā)明涉及含有單細胞生物體的真核細胞（例如在宿主細胞的胞質(zhì)溶膠中含有 人工內(nèi)共生生物的宿主細胞）和將單細胞生物體引入真核細胞中的方法。在一個實施例 中，單細胞生物體是經(jīng)遺傳改變的人工內(nèi)共生生物。在一些實施例中，單細胞生物體是趨磁 細菌（MTB)。
[0016] 定義
[0017] 如本文所用術(shù)語"AMB"是指趨磁螺菌（Magnetospirillum magneticum)菌株 ΑΜΒ-1〇
[0018] 如本文所用術(shù)語"人工內(nèi)共生生物"是指通過人類干預引入或已引入真核細胞的 胞質(zhì)溶膠中的單細胞生物體，其經(jīng)過至少五次細胞分裂已轉(zhuǎn)移到或可轉(zhuǎn)移到真核細胞的子 代細胞中，且其在子代細胞中維持足夠拷貝數(shù)以使得在子代細胞中維持通過人工內(nèi)共生生 物引入的表型。
[0019] 如本文所用術(shù)語"細胞生命周期"是指涉及真核細胞的生長、復制和分裂的系列事 件。將其分為5個時期，稱為G。（其中細胞休眠）、Gi和G 2 (其中細胞大小增加）、S(其中細 胞使其DNA加倍）和Μ(其中細胞經(jīng)歷有絲分裂和分裂）。
[0020] 如本文所用術(shù)語"胞質(zhì)溶膠"是指細胞質(zhì)中不在細胞的膜結(jié)合子結(jié)構(gòu)內(nèi)的部分。
[0021] 如本文所用術(shù)語"子代細胞"是指通過細胞分裂形成的細胞。
[0022] 如本文所用術(shù)語"必需分子"是指宿主細胞生長或存活所需的分子。
[0023] 如本文所用術(shù)語"遺傳修飾"是指改變細胞的DNA以使得改變細胞的所需性質(zhì)或 特征。
[0024] 如本文所用術(shù)語"宿主細胞"是指其中可留存人工內(nèi)共生生物的真核細胞。
[0025] 如本文所用術(shù)語"脂質(zhì)體介導的"是指由包封在一或多個脂質(zhì)層中的水性核組成 的人工微型囊泡，其用于將人工內(nèi)共生生物輸送到宿主細胞。
[0026] 如本文所用術(shù)語"磁小體"是指由鞘或膜包封的呈個別顆?；虺暑w粒鏈形式的磁 鐵礦（即，F(xiàn)e 304)或硫復鐵礦（Fe3S4)顆粒。
[0027] 如本文所用術(shù)語"趨磁細菌"或"MTB"是指具有編碼磁小體的基因的細菌。
[0028] 如本文所用術(shù)語"哺乳動物"是指溫血脊椎動物，其都具有毛發(fā)且給其幼體哺乳。
[0029] 如本文所用術(shù)語"微注射"是指將人工內(nèi)共生生物注射到宿主細胞中。
[0030] 如本文所用術(shù)語"加標簽的人工內(nèi)共生生物"是指在內(nèi)共生生物表面上具有配體 的人工內(nèi)共生生物。
[0031] 如本文所用術(shù)語"親代細胞"是指分裂形成兩個或更多個子代細胞的細胞。
[0032] 如本文所用術(shù)語"受體介導的"是指宿主細胞表面上與人工內(nèi)共生生物或加標簽 的人工內(nèi)共生生物結(jié)合，之后內(nèi)化所述人工內(nèi)共生生物的分子結(jié)構(gòu)或位點。
[0033] 人工內(nèi)共牛牛物
[0034] 本發(fā)明單細胞生物體包括能在真核細胞中存活并維持拷貝數(shù)，以使得在子代細胞 中維持通過單細胞生物體引入的表型的細菌。在一些實施例中，單細胞生物體在沒有進一 步人類干預的情況下不殺滅真核宿主細胞。在一些實施例中，單細胞生物體具有真核細胞 在引入所述單細胞生物體后獲得的功能性。在一些實施例中，單細胞生物體的功能性是磁 性、產(chǎn)生養(yǎng)分、脫鹽、光合作用或?qū)揽镰h(huán)境挑戰(zhàn)的耐受性。磁性包括抗磁性和順磁性。在一 些實施例中，真核細胞將功能性維持至少48小時。在一些實施例中，單細胞生物體可在真 核子代細胞中經(jīng)過至少3次細胞分裂、或至少4次分裂、或至少5次分裂、或至少6、7、8、9、 10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次細胞分裂穩(wěn)定維持表型。在另一實施例中，單細 胞生物體可在真核子代細胞中經(jīng)過3-5次分裂、或5-10次分裂、或10-15次分裂、或15-20 次分裂穩(wěn)定維持表型。
[0035] 在本發(fā)明實施例中，本發(fā)明單細胞生物體經(jīng)遺傳修飾。用于對細菌進行遺傳修飾 的方法為業(yè)內(nèi)所熟知。通常，將對細菌進行遺傳修飾以改良其在真核宿主細胞中的存活，和 /或降低單細胞生物體對真核細胞的毒性，和/或為真核細胞提供有用表型。在一個實施例 中，單細胞生物體的鞭毛蛋白質(zhì)經(jīng)修飾以使得單細胞生物體不再于真核宿主細胞中表達鞭 毛蛋白質(zhì)。在另一實施例中，單細胞生物體經(jīng)修飾以使得其可不再合成必需分子，而優(yōu)選地 由真核宿主細胞提供。在實施例中，單細胞生物體經(jīng)遺傳修飾以使得其細胞周期與真核宿 主細胞的細胞周期協(xié)調(diào)，從而使得單細胞生物體可將拷貝數(shù)維持在足夠水平以將表型傳遞 到子代細胞。
[0036] 本發(fā)明實施例包括單細胞生物體，其為蛋白菌（Proteobacteria)。本發(fā) 明實施例包括單細胞生物體，其為α-蛋白菌。在當前基于16S rRNA的分類方案 中，α-蛋白菌公認為蛋白菌門內(nèi)的一綱，且被細分為7個主要亞群或目（柄桿菌目 (Caulobacterales)、根瘤菌目（Rhizobiales)、紅細菌目（Rhodobacterales)、紅螺菌目 (Rhodospirillales)、立克次體目（Rickettsiales)、鞘脂單胞菌目（Sphingomonadales) 和短小盒菌目（Parvularculales))。（古普塔，R. S. (Gupta, R. S. ) α蛋白菌和其主 群的系統(tǒng)發(fā)育基因組學和標志蛋白質(zhì)（Phylogenomics and signature proteins for the alpha Proteobacteria and its main groups)生物醫(yī)學中心微生物學（BMC Microbiology)，7:106 (2007)(其出于所有目的全文以引用方式并入））。
[0037] 已對包括α-蛋白菌內(nèi)的所有主群的大量α-蛋白菌基因組進行測序，從而提供 可用于鑒別α-蛋白菌內(nèi)作為不同高級分類群（例如科、目等）的特色性特征的獨特基因 或蛋白質(zhì)集合的信息（同一文獻（其出于所有目的全文以引用方式并入））。
[0038] 本發(fā)明實施例包括單細胞生物體，其為趨磁細菌（"ΜΤΒ"）。自從在1975年布 萊克莫爾首次發(fā)現(xiàn)ΜΤΒ物種（布萊克莫爾，R.趨磁細菌（Magnetotactic bacteria).科 學24:377-379(1975)(其出于所有目的全文以引用方式并入））起，大量MTB物種為所 屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知，且其代表一群微生物（費夫雷，D. (Faivre，D.)和斯科勒，D. (Schiller, D.)趨磁細菌和磁小體（Magnetotactic bacteria and magnetosome).化學 評論（Chemistry Reviews) 108:4875-4898(2008)(其出于所有目的全文以引用方式并 入））。已在蛋白菌和硝化螺旋菌（Nitrospira)門的不同亞群中鑒別出MTB，且大部分種 系型集合在 α _蛋白囷中。目如，依照16S rRNA序列相似性指定為α -蛋白囷的可培養(yǎng) ΜΤΒ菌株包括最初由布萊克莫爾在1975年分離的菌株，即向磁磁螺菌（Magnetospirillum magnetotactium,曾為向磁水生螺菌（Aquasprillium magnetotactium))、格瑞菲斯 瓦爾德磁螺菌（M. gryphiswaldense)、趨磁螺菌菌株AMB-1 ( "AMB"）、多形磁螺菌 (M. polymorphum)、磁螺菌 MSM-4 和 MSM-6、海洋趨磁球菌（Magnetococcus marinus)、海 洋弧菌（vibrio)菌株MV-1及MV-2、海洋螺旋菌（spirillum)菌株MMS-1和趨磁球菌 (Magnetococcus)菌株MC-1以及其它菌株。多種MTB可以純培養(yǎng)物獲得，包括AMB。AMB在 純培養(yǎng)物中的加倍時間為約8小時，且接近典型哺乳動物細胞。
[0039] 標準MTB生長培養(yǎng)基使用琥珀酸作為主要碳源，但MTB可以延胡索酸鹽、酒石酸 鹽、蘋果酸鹽、乳酸鹽、丙酮酸鹽、草乙酸鹽、丙二酸鹽、P-羥基丁酸鹽和馬來酸鹽作為唯一 碳源來生長。這些代謝物存在于真核細胞內(nèi)部。已鑒別微量需氧、兼性厭氧和專性厭氧MTB 菌株。由于諸如肌紅蛋白等蛋白質(zhì)的隔離和在特定細胞位置（例如線粒體）中的集中，真 核細胞的胞質(zhì)溶膠中的氧濃度低，因此在真核細胞中已存在MTB生長所需的微量需氧或兼 性厭氧環(huán)境。
[0040] MTB還可依照其合成的磁性顆粒（磁鐵礦（Fe304)或硫復鐵礦（Fe3S 4))來歸類。磁 鐵礦產(chǎn)生者是微量需氧或兼性厭氧的，需要一定氧源用于磁小體合成，且最適生長溫度接 近生理溫度。
[0041] 在一些實施例中，本發(fā)明單細胞生物體經(jīng)遺傳修飾。已研發(fā)出分子生物學工 具用于MTB的基因操作，最廣泛地用于AMB和格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌菌株MSR-1 (綜 述于朱格勒，C. (Jogler，C.)和斯蒂勒，D. (Schtiler，D.)，細菌中的磁感受和磁小體 (Magnetoreception and Magnetosomes in Bacteria)，紐約，施普林格（Springer)，2007， 第134-138頁（其出于所有目的全文以引用方式并入）中）。由于AMB的基因組是任何MTB 中首先測序的，所以除非另外指定，否則本文中的所有MTB基因參照是指這個基因組。兩種 其它磁螺菌（Magnetospirillum)菌株和趨磁球菌菌株MC-1的基因組最近也已測序。不管 這些菌株或其它MTB菌株的基因當前可培養(yǎng)或不可培養(yǎng)，經(jīng)測序或未經(jīng)測序，已知或未知， 都可用于本發(fā)明中。
[0042] MTB中負責形成磁小體的基因簇集于基因組島中，稱為磁小體島（MAI)。在格瑞菲 斯瓦爾德磁螺菌中，130kb MAI -般結(jié)構(gòu)化為4個多順反子操縱子：mamAB操縱子具有17個 經(jīng)鑒別0RF，其遍布16. 4kb ;mamGFDC操縱子具有4個經(jīng)鑒別0RF，其在ofinamAB上游2. lkb 和15kb ;_s6操縱子具有6個經(jīng)鑒別0RF，其在mamGFDC上游3. 6kb和368bp ;mamXY操縱 子具有4個經(jīng)鑒別0RF，其位于mamAB下游約30kb ;以及單順反子mamW基因。在MAI中已 鑒別以下蛋白質(zhì)：Mam W、Mgl457、Mgl458、Mgl459、Mms6、Mgl462、MamG、MamF、MamD、MamC、 MamH、Mam 1、MamE、Mam J、MamK、MamL、MamM、MamN、MamO、MamP、MamA、MamQ、MamR、MamB、MamS、 MamT、MamU和Mgl505,其中多者在磁小體形成中具有特定功能。在MAI外的4個基因與磁 小體形成有關(guān)：mamY、mtxA、mmsF和mamX。已在其它MTB中發(fā)現(xiàn)保守MAI，且基因組組織和 大小有一些差異。
[0043] 在一些實施例中，對單細胞生物體進行遺傳修飾。所述修飾可為定向修飾、隨機誘 變或其組合。天然內(nèi)共生生物是新穎代謝能力的供體且從宿主取得營養(yǎng)需求。
[0044] 共生生物對宿主的天然定殖發(fā)生于7個時期中：1)傳播，2)進入，3)反擊宿主防 御，4)定位，5)為宿主提供優(yōu)點，6)在宿主環(huán)境中存活，和7)調(diào)節(jié)。
[0045] 在一些實施例中，可在單細胞生物體與真核細胞之間建立相互營養(yǎng)依賴性（向生 體性）。在一個實施例中，單細胞生物體包含編碼用于合成必需分子的酶的基因的至少一 個缺失，其中所述必需分子是由真核宿主細胞產(chǎn)生。必需分子可包括（但不限于）氨基酸、 維生素、輔因子和核苷酸。例如，向生體性可通過敲除單細胞生物體制備氨基酸的能力來達 成，所述氨基酸隨后將從宿主取得。甘氨酸是合理選擇，因為其在哺乳動物細胞中非常豐富 且為細菌氨基酸生源的最終產(chǎn)物；存在至少22種其它可能性。絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶在用于 產(chǎn)生氨基酸的3-磷酸甘油酸生物合成路徑的末端將絲氨酸轉(zhuǎn)化為甘氨酸。在一個實施例 中，單細胞生物體是AMB，其中基因 amb2339(其編碼絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶）經(jīng)遺傳修飾。所 屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知多種用于使基因突變或敲除基因的方法，包括體外誘變、通過基 因（或操縱子，因為細菌中的大多數(shù)基因簇集于操縱子中）的同源重組或缺失將DNA靶向 插入到所關(guān)注基因中、或使用內(nèi)切核酸酶（前提是基因組中存在僅在靶附近的適宜位點）。
[0046] 在另一實施例中，單細胞生物體對宿主細胞的營養(yǎng)依賴性還可通過消除單細胞生 物體合成各種代謝物、輔因子、維生素、核苷酸或其它必需分子的能力來建立。
[0047] 在本發(fā)明的一些實施例中，MTB在與運動性和/或分泌相關(guān)的基因中具有突變和/ 或缺失。MTB有鞭毛，且在本發(fā)明的一些實施例中，MTB在至少一個編碼與鞭毛相關(guān)的分子 機構(gòu)的基因中具有缺失和/或突變，從而使得磁性細菌不產(chǎn)生功能性鞭毛。另外，多種MTB 分泌對宿主有害或引發(fā)宿主的免疫反應的各種化合物，例如氧肟酸鹽和兒茶酚鐵載體。在 AMB、4559 0RF的已測序基因組中，83個基因與細胞運動性和分泌有關(guān)。已知鞭毛組合件可 由以下的基因產(chǎn)物組成：amb0498、amb0500、amb0501、amb0502、amb0503、amb0504、amb0505、 amb0610> amb0614> amb0615> amb0616> amb0617> amb0618> amb0619> amb0628> ambl289> ambl389、amb2558、amb2559、amb2578、amb2579、amb2856、amb3493、amb3494 amb3495、 amb3496、amb3498、amb3824和amb3827。鞭毛受趨化機構(gòu)控制，所述機構(gòu)由至少以下的基 因產(chǎn)物組成：amb0322、amb0323、amb0324、amb0325、amb0326、ambl806、ambl963、ambI966、 amb2333、amb2635、amb2640、amb2648、amb2652、amb2826、amb2932、amb3002、amb3003、 amb3004、amb3007、amb3102、amb3329、amb3501、amb3502、amb3654、amb3879 和 amh3880。
[0048] 在一個實施例中，將編碼抗生素抗性的基因插入單細胞生物體的基因組中。在含 有抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)的真核細胞的存活將需要所述單細胞生物體。新霉素（neomycin) 抗性是由兩種氨基葡糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因中的任一種來賦予，所述基因還提供針對遺傳霉 素（G418,用于真核生物的常用抗生素）的抗性。潮霉素 B(Hygromycin B)抗性是由通過磷 酸化使潮霉素 B失活的激酶來賦予。嘌呤霉素（puromycin)是用于哺乳動物細胞培養(yǎng)的常 用抗生素且其抗性是由編碼嘌呤霉素 N-乙酰基轉(zhuǎn)移酶的pac基因來賦予。抗生素濃度的 外部控制使得可在細胞內(nèi)調(diào)節(jié)單細胞生物體的拷貝數(shù)。還可采用其中通過對外部因素的化 學修飾來實現(xiàn)對此因素的抗性或耐受性的任何其它系統(tǒng)。對真核細胞的間接營養(yǎng)優(yōu)點可通 過使用MTB和磁性培養(yǎng)方法來建立。在此實施例中，建立磁場以賦予含有MTB的真核細胞 優(yōu)點。這可通過提供附著到培養(yǎng)基質(zhì)的方式或到達所需生長或培養(yǎng)基因子的通路來實現(xiàn)。
[0049] 在另一實施例中，在MTB基因組中進行遺傳修飾以增強抵抗具體宿主細胞類型的 宿主防御機制的細胞內(nèi)穩(wěn)定性。多種真核生物內(nèi)共生生物和內(nèi)寄生物（例如昆蟲的蛋白菌 內(nèi)共生生物，例如巴克納氏菌屬（Buchnera)、威格爾斯沃斯氏菌屬（Wigglesworthia)和沃 爾巴克體屬（Wolbachia);厭氧纖毛蟲的產(chǎn)甲燒內(nèi)共生生物；娃藻棒桿藻屬（Rhopalodia) 的固氮共生生物；無腸管蟲（奧萊沃斯懦蟲（Olavius)或英納氏蟲（Inanidrillus))的 化能合成內(nèi)共生生物聚生體、海綿的藍藻內(nèi)共生生物、棘皮動物門（Echinodermata)的所 有5個現(xiàn)存綱的內(nèi)共生生物、植物的根瘤菌（Rhizobia)內(nèi)共生生物、各種內(nèi)共生藻類、 阿米巴原蟲（Ameoba proteus)的軍團病桿菌（Legionella)樣X細菌內(nèi)共生生物、多種 沙門菌（Salmonella sp·)、結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis)、嗜肺軍團病 桿菌（Legionella pneumophila)等）留存于通常稱作共生體的膜結(jié)合液泡中，同時一 些物種（例如布洛克曼尼亞菌（Blochmannia)、立克次體屬（rickettsia)、志賀氏菌屬 (Shigella)、腸侵襲性大腸桿菌（Escherichia coli)和利斯特菌屬（Listeria))具有棲息 在胞質(zhì)溶膠中的能力。通過吞噬作用獲得的多種細胞內(nèi)細菌采用Dot-Icm IV型分泌系統(tǒng) 來躲避內(nèi)吞路徑并存留于宿主細胞中。此系統(tǒng)已在嗜肺軍團病桿菌中充分研究且由以下 蛋白質(zhì)組成：DotA 到 DotP、DotU、DotV、IcmF、IcmQ 到 IcmT、IcmV、IcmW 和 IcmX。在線蟲的 發(fā)光內(nèi)共生生物發(fā)冷光桿菌（Photorhabdus luminescens)中，顯不編碼RTX樣毒素、蛋白 酶、III型分泌系統(tǒng)和鐵攝取系統(tǒng)的基因支持細胞內(nèi)穩(wěn)定性和復制。基因 bacA和調(diào)節(jié)系統(tǒng) BvrRS是維持根瘤菌與植物之間的共生以及牛型布魯桿菌（Brucella ahortus)在哺乳動 物細胞中的存活所必需的。PrfA調(diào)節(jié)子使得一些利斯特菌能逃脫吞噬體并棲息在胞質(zhì)溶膠 中。細胞內(nèi)MTB的所需細胞位置（例如，共生體或胞質(zhì)溶膠）將指示在宿主環(huán)境中存活和 增殖需要在MTB中表達（直接來自基因組或通過穩(wěn)定載體）哪種基因。內(nèi)源性質(zhì)粒pMGT 在MTB中非常穩(wěn)定且多種其它廣泛載體（那些0flncQ、IncP、pBBRl等）能在MTB中穩(wěn)定復 制。
[0050] 在另一實施例中，單細胞生物體通過基因（例如抑菌基因、鐵載體基因、代謝需求 基因、自殺基因、生命周期調(diào)節(jié)基因、轉(zhuǎn)運蛋白基因）中的敲擊進行遺傳修飾，并逃脫吞噬 體基因。在另一實施例中，對單細胞生物體進行隨機突變，隨后進行篩選以促進在宿主細胞 內(nèi)的整合。隨機突變可通過用誘變化合物處理、暴露于UV光或所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其 它方法來達成。
[0051] 在另一實施例中，使用來自各種寄生物或內(nèi)共生生物的基因進行轉(zhuǎn)基因修飾以反 擊真核細胞防御。在另一實施例中，通過平衡宿主機制（養(yǎng)分可用性、繁殖控制等）的內(nèi)在 使用與抗生素濃度來調(diào)節(jié)真核宿主細胞中的單細胞生物體群體。
[0052] 在另一實施例中，天然內(nèi)共生生物或細胞內(nèi)寄生物經(jīng)遺傳修飾以產(chǎn)生磁小體。昆 蟲的內(nèi)共生生物（例如巴克納氏菌、威格爾斯沃斯氏菌和沃爾巴克體屬）；厭氧纖毛蟲的產(chǎn) 甲烷內(nèi)共生生物；硅藻棒桿藻屬中的固氮共生生物；無腸管蟲（奧萊沃斯蠕蟲或英納氏蟲） 的化能合成內(nèi)共生生物聚生體、海綿的藍藻內(nèi)共生生物、棘皮動物門的所有5個現(xiàn)存綱的 內(nèi)共生生物、植物的根瘤菌內(nèi)共生生物、各種內(nèi)共生藻類、阿米巴原蟲的軍團病桿菌樣X細 菌內(nèi)共生生物、多種沙門菌、結(jié)核分枝桿菌、嗜肺軍團病桿菌屬于α -蛋白菌且可經(jīng)遺傳改 造以產(chǎn)生磁小體。在另一實施例中，已存在的細胞器可經(jīng)遺傳修飾以表達一或多個磁小體 基因以產(chǎn)生人工內(nèi)共生生物。例如，線粒體、質(zhì)體、氫化酶體、頂質(zhì)體（apicoplast)或其它 具有其自身遺傳物質(zhì)的細胞器可經(jīng)遺傳改變。
[0053] 在優(yōu)選實施例中，單細胞生物體是MTB，其可經(jīng)或不經(jīng)遺傳改變，從而在培養(yǎng)真核 細胞時產(chǎn)生磁性顆粒。
[0054] 直核細朐
[0055] 本發(fā)明提供在真核細胞中包含可遺傳單細胞生物體的真核細胞以及將所述單細 胞生物體引入宿主細胞中的方法。
[0056] 在一些實施例中，真核細胞是植物細胞。在一些實施例中，真核細胞是單子葉 植物或雙子葉植物的細胞，所述植物包括（但不限于）玉米、小麥、大麥、裸麥、燕麥、水 稻、大豆、花生、豌豆、扁豆和紫花苜猜、棉花、油菜籽、蕓苔、胡椒、向日葵、土豆、煙草、番 茄、茄子、桉樹、樹、觀賞植物、多年生草或飼料作物。在其它實施例中，真核細胞是藻類細 胞，包括（但不限于）以下屬的藻類：小球藻屬（Chlorella)、衣藻屬（Chlamydomonas)、 柵藻屬（Scenedesmus)、等鞭金藻屬（Isochrysis)、杜氏藻屬（Dunaliella)、扁藻屬 (Tetraselmis)、微擬球藻屬（Nannochloropsis)或原囊藻屬（Prototheca)。在一些實施 例中，真核細胞是真菌細胞，包括（但不限于）以下屬的真菌：酵母菌屬（Saccharomyces)、 克魯維酵母屬（Klyuveromyces)、假絲酵母屬（Candida)、畢赤酵母屬（Pichia)、德巴利酵 母屬（Debaromyces)、漢遜酵母屬（Hansenula)、子囊菌酵母屬（Yarrowia)、接合酵母屬 (Zygosaccharomyces)或裂殖酵母屬（Schizosaccharomyces) 〇
[0057] 在一些實施例中，本發(fā)明真核細胞是動物細胞。在一些實施例中，真核細胞是 哺乳動物細胞，例如小鼠、大鼠、兔子、倉鼠、人類、豬、?；蛉Ｐ∈蟪Ｒ?guī)用作其它哺乳動 物、最特別是人類的模型。（例如，參見漢納，J. (Hanna，J.)、韋尼希，M. (Wernig，M.)、 麻庫拉基，S. (Markoulaki, S.)、孫，C (Sun, C)、梅斯內(nèi)，A. (Meissner, A.)、卡薩迪，J. Ρ· (Cassady, J. Ρ·)、比爾德，C(Beard, C)、布蘭布林克，Τ· (Brambrink, Τ·)、吳，L. (Wu, L.)、 湯斯，T. M. (Townes, T. Μ.)、耶尼施，R. (Jaenisch, R.)用從自體皮膚生成的iPS細胞 治療鎌狀細胞貧血小鼠模型（Treatment of sickle cell anemia mouse model with iPS cells generated from autologous skin).科學 318:1920-1923(2007);霍爾茨 曼，D. M. (Holtzman, D. Μ·)、貝爾斯，K. R. (Bales, K. R.)、吳，S.、巴特，P. (Bhat, Ρ·)、 帕薩達尼安，M. (Parsadanian, Μ·)、費根，A. (Fagan, A.)、常，L. K. (Chang, L. Κ·)、 孫，Y.、保羅，S.M. (Paul，S.M.)在小鼠阿爾茨海默氏病模型中人類載脂蛋白E的表 達減少淀粉樣蛋白-β 沉積(Expression of human apolipoprotein E reduces amyloid-β deposition in a mouse model of Alzheimer's disease).臨床石開究雜志 (J. Clin. Invest.) 103(6) :R15-R21 (1999);沃倫，R. S. (Warren, R. S.)、袁，H. (Yuan, Η·)、 毛特利，MR. (Matli，MR.)、吉勒特，N. A. (Gi 1 lett，Ν· A.)、法拉拉，N. (Ferrara, Ν·)在小 鼠實驗性肝轉(zhuǎn)移模型中通過血管內(nèi)皮生長因子調(diào)節(jié)人類結(jié)腸癌腫瘤發(fā)生（Regulation by vascular endothelial growth factor of human colon cancer tumorigenesis in a mouse model of experimental liver metastasis).臨床研究雜志 95:1789-1797(1995) (這三個出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入））。
[0058] 在一些實施例中，真核細胞是人類癌細胞。多種人類癌細胞系為所屬領(lǐng)域一般技 術(shù)人員所熟知，包括常見的上皮腫瘤細胞系，例如Coco-2、MDA-MB231和MCF7 ;非上皮腫瘤 細胞系，例如HT-1080和HL60、NCI60細胞系譜（例如，參見休梅克，R. (Shoemaker, R.)， NCI60 人類腫瘤細胞系抗癌藥物篩選（The NCI60 human tumor cell line anticancer drug screen).自然綜述·癌癥（Nature Reviews Cancer)6, 813-823(2006)(其出于所有 目的全文以引用方式并入））。另外，所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員可熟練從原發(fā)性人類腫瘤獲得 癌細胞。
[0059] 在其它實施例中，真核細胞是干細胞。所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員熟悉多種干細胞類 型，包括胚胎干細胞、誘導多能干細胞、造血干細胞、神經(jīng)干細胞、表皮神經(jīng)嵴干細胞、乳腺 干細胞、腸干細胞、間質(zhì)干細胞、嗅覺成體干細胞和睪丸細胞。
[0060] 在實施例中，真核細胞是在人類宿主的循環(huán)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的細胞。例如，紅血細胞、 血小板、漿細胞、T細胞、天然殺傷細胞或諸如此類和其前體細胞。作為一組，這些細胞定義 為本發(fā)明的循環(huán)宿主細胞。本發(fā)明可與這些循環(huán)細胞中的任一者一起使用。在實施例中， 真核宿主細胞是T細胞。在另一實施例中，真核細胞是B細胞。在實施例中，真核細胞是嗜 中性粒細胞。在實施例中，真核細胞是巨核細胞。
[0061] 在另一實施例中，至少一個來自真核細胞的基因經(jīng)遺傳改變。在一些實施例中， 可使用所屬領(lǐng)域一般技術(shù)人員已知的專用于目標宿主細胞類型的適宜分子生物學技術(shù)通 過真核細胞的遺傳修飾在人工內(nèi)共生生物與真核細胞之間建立相互營養(yǎng)依賴性（向生體 性），從而產(chǎn)生真核細胞針對某一必需高分子對單細胞生物體的依賴性，由此建立針對向生 體性的環(huán)境壓力。在另一實施例中，可通過遺傳改變真核細胞以消除單細胞生物體合成各 種代謝物、輔因子、維生素、核苷酸或其它必需分子的能力來建立單細胞生物體對真核細胞 的營養(yǎng)依賴性。在所述實施例中，可由單細胞生物體提供必需分子。在另一實施例中，編碼 絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶（其在用于氨基酸產(chǎn)生的3-磷酸甘油酸生物合成路徑末端將絲氨酸 轉(zhuǎn)化為甘氨酸）的真核細胞基因可經(jīng)修飾。
[0062] 將單細朐牛物體引入直核細朐中的方法
[0063] 可通過多種所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法將本發(fā)明單細胞生物體引入真核細胞 中，所述方法包括（但不限于）微注射、天然吞噬作用、誘導吞噬作用、巨胞飲作用、其它細 胞攝取過程、脂質(zhì)體融合、紅細胞血影融合、電穿孔、受體介導方法和諸如此類。（參見微注 射和細胞器移植技術(shù)（Microinjection and Organelle Transplantation Techniques)， 塞利斯（Celis)等人編輯；學術(shù)出版社（Academic Press):紐約，1986和其中的參考文獻， (出于所有目的全文以引用方式并入））。
[0064] 在一個實施例中，通過微注射到宿主細胞細胞質(zhì)中將單細胞生物體引入宿主細胞 中。多種微注射技術(shù)為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員已知。微注射是最有效的可用轉(zhuǎn)移技術(shù)（基本 上100% )且沒有細胞類型限制（同一文獻；習，Z. (Xi，Z.)和多布森，S. (Dobson，S.)通 過使用胚胎細胞質(zhì)和胚胎勻楽的微注射表征沃爾巴克體屬轉(zhuǎn)染效率（Characterization of Wolbachia transfection efficiency by using microinjection of embryonic cytoplasm and embryo homogenate).應用與環(huán)境微生物學（Appl Environ. Microbiol.) 71 (6):3199-3204(2005);戈茨，M. (Goetz，M·)、布博特，A. (Bubert，A·)、王，G. (Wang，G·)、 奇科-卡萊羅，I. (Chico-Calero, I.)、巴斯克斯-博蘭，J. A. (Vazquez-Boland，J. A.)、貝 克，M. (Beck，M.)、斯萊惠斯，J. (Slaghuis，J.)、紹洛伊，A. A. (Szalay，A. A.)、格貝爾，W. (Goebel，W.)細菌在哺乳動物宿主細胞的胞質(zhì)溶膠中的微注射和生長（Microinjection and growth of bacteria in the cytosol of mammalian host cells).美國國家科學院 院刊（Proc.Natl.Acad Set USA)98:12221-12226(2001)(這三個出版物中的每一者出于所 有目的全文以引用方式并入））。
[0065] 已顯示天然吞嗤細胞可吸收細菌，包括MTB(伯德特，D. L. (Burdette，D. L.)、 希曼，J. (Seemann，J.)、奧思，K. (Orth，K.)弧菌VopQ誘導非PI3激酶依賴性自體吞 嗤并拮抗吞嗤作用（Vibrio VopQ induces PI3_kinase independent autophagy and antagonizes phagocytosis).分子微生物學（Molecular microbiology) 73:639 (2009); 威德曼，A. (Wiedemann，A.)、安德爾，S. (Linder，S.)、格拉西，G. (Grassi，G.)、艾伯 特，M. (Albert，M.)、奧滕里特，L (Autenrieth，L)、愛普費貝徹，M. (Aepfelbacher，M.) 小腸結(jié)腸炎耶爾森菌玻璃酸酶在巨噬細胞中通過β?整聯(lián)蛋白、CDC42H和WASp 角蟲 發(fā)吞嗤 作用(Yersinia enterocolitica invasin triggers phagocytosis viaP 1 integrins，CDC42Hs and WASp in macrophages).細胞微生物學（Cellular Microbiology)3:693(2001);哈克姆，D.J.(Hackam，D.J·)、羅特施泰因，0· D. (Rotstein，0· D.)、施賴伯，A. (Schreiber，A.)、張，W. (Zhang，W.)、格林斯坦，S. (Grinsteir^S.)巨噬細胞中的Fcy受體起始鈣信號傳導和吞噬作用需要Rho (Rho is required for the initiation of calcium signaling and phagocytosis by Fey receptors in macrophages).實驗醫(yī)學雜志（J. of Exp. Med) 186(6) :955-966(1997); 松永，T.、橋本，K.、中村，N.、中村，K.、橋本，S.白血球?qū)毦盆F礦的吞噬作用 (Phagocytosis of bacterial magnetite by leucocytes).應用微生物學和生物技術(shù) 31(4):401-405(1989)(這四個出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入））。
[0066] 這種方法可放大，但可能受限于特定細胞類型（例如，巨噬細胞）。然而，最新 研究已顯示，可誘導非吞噬細胞類型在與以下多種因子共培養(yǎng)時內(nèi)吞細菌：培養(yǎng)基和化學 因子、生物因子（例如，桿狀病毒、蛋白質(zhì)因子、遺傳敲入等）。（例如，參見薩爾米寧，M. (Salminen，M.)、艾潤妮，K. J. (Airenne，K. J.)、瑞南科斯基，R. (Rinnankoski，R.)、瑞瑪 麗，J. (Reimari，J.)、瓦利樂托，0. (Valilehto, 0.)、瑞尼，J. (Rinne，J.)、蘇伊卡寧，S. (Suikkanen，S.)、庫科寧，S. (Kukkonen，S.)、伊拉-赫圖亞拉，S. (Yla-Herttuala，S.)、 庫魯馬，M. S. (Kulomaa，M. S.)、維希寧-蘭塔，M. (Vihinen-Ranta，Μ.)在人類肝細胞中 通過微管崩解來改良桿狀病毒的入核和轉(zhuǎn)基因表達（Improvement in nuclear entry and transgene expression of baculoviruses by disintegration of microtubules in human hepatocytes).病毒學雜志（J. Virol) 79 (5) :2720-2728 (2005);莫達斯立，K. R. (Modalsli，K. R.)、米卡爾森，S. (Mikalsen，S.)、布克霍姆，G. (Bukholm，G.)、德格爾，M. (Degre，M.)用柯薩奇B1病毒RNA對HEp-2細胞進行微注射僅在用UV滅活病毒預刺激后 增強弗氏志賀菌的侵襲力（Microinjection of HEp-2 cells with coxsackie B1 virus RNA enhances invasiveness of Shigella flexneri only after prestimulation with UV-inactivated virus) .APMIS 101:602-606(1993);海沃德，R.D. (Hayward，R.D.)和科 洛納基斯，V. (KOT〇nakiS，V.)通過侵襲性沙門菌的SipC蛋白質(zhì)使肌動蛋白直接成核和 束結(jié)（Direct nucleation and bundling of actin by the SipC protein of invasive Salmonella).歐洲分子生物學學會雜志（The ΕΜΒ0 Journal) 18:4926-4934(1999);吉 田，S. (Yoshida，S.)、片山，E. (Katayama，Ε·)、桑江，A. (Kuwae，A.)、三室，H. (Mimuro, Η·)、 鈴木，T. (Suzuki，T.)、笹川，C. (Sasakawa，C.)志賀菌遞送效應子蛋白以觸發(fā)宿主微管 去穩(wěn)定，此促進Racl活性和有效細菌內(nèi)化（Shigella deliver an effector protein to trigger host microtubule destabilization, which promotes Racl activity and efficient bacterial internalization).歐洲分子生物學學會雜志 21:2923-2935 (2002); 比吉爾迪夫（Bigildeev)等人，實驗血液學雜志（J.Exp Hematol.),39:187(2011);芬 利，B.B. (Finlay，B.B.)和法寇，S. (Falkow，S.)重新審視微生物致病性的共同主題 (Common themes in microbial pathogenicity revisited).微生物學與分子生物學評論 (Microbiol，and Mol. Biol. Rev.) 61:136-169 (1997)(這六個出版物中的每一者出于所有 目的全文以引用方式并入）。
[0067] 相關(guān)過程巨胞飲作用或"胞飲"是多種細菌和病毒用于細胞內(nèi)進入的方法（張 (2004)，分子成像和對比劑數(shù)據(jù)庫（Molecular Imaging and Contrast Agent Database， MICAD)[在線數(shù)據(jù)庫];貝塞斯達（Bethesda)(MD):國家醫(yī)學圖書館（National Library of Medicine，美國），NCBI ;2004-2011(這兩個出版物中的每一者出于所有目的全文以引 用方式并入））。有多種方案可用于誘導細胞吸收細菌。已將若干種試劑（例如核酸、蛋 白質(zhì)、藥物和細胞器）囊封于脂質(zhì)體中并遞送到細胞（本哈伊姆，N. (Ben-Haim，N.)、布 羅，P. (Broz，P.)、馬希，S. (Marsch, S.)、邁耶，W. (Meier, W.)、亨齊克，P. (Hunziker，P.) 人工細胞器基于功能化聚合物囊泡的細胞特異性整合（Cell-specific integration of artificial organelles based on functionalized polymer vesicles).納米快報 8 (5) : 1368-1373 (2008);李安，W. (Lian, W.)、常，C、陳，Y. (Chen, Υ·)、達奧，R. (Dao, R.)、 羅，Y. (Luo, Y.)、錢，J. (Chien，J.)、謝，S. (Hsieh，S.)、林，C. (Lin, C.)細胞內(nèi)遞送可無 需載劑顆粒通過用加速分子或細菌轟擊細胞或組織來實現(xiàn)（Intracellular delivery can be achieved by bombarding cells or tissues with accelerated molecules or bacteria without the need for carrier particles).實驗細胞石開究（Experimental Cell Research)313(l) :53-64(2007);邢，B.C. (Heng，B.C.)和曹，T. (Cao，T.)免疫脂質(zhì) 體介導遞送新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶用于分化/定型干細胞后代的譜系特異性選擇：相對于用 標記基因轉(zhuǎn)染、突光活化和磁性親和性細胞分選的潛在優(yōu)點（Immunoliposome-mediated delivery of neomycin phosphotransferase for the lineage-specific selection of differentiated/committed stem cell progenies:Potential advantages over transfection with marker genes, fluorescence-activated and magnetic affinity cell-sorting).醫(yī)學假說（Med. Hypotheses)65(2):334-336(2005);波特里庫斯 (Potrykus) (1990)Ciba 基金會專題論文集（Ciba Found Symp)，第 154 卷：198(這四個出 版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入））。這種方法便宜、相對簡單且可放 大。另外，脂質(zhì)體攝取可通過操作培育條件、改變脂質(zhì)體電荷、受體介導和增強磁性來促 進。（參見例如潘（Pan)等人，國際制藥學雜志（Int.J.Pharm. )358:263(2008);薩博路 基，Μ. N. (Sarbolouki，Μ. N.)和托利亞特，T. (Toliat，T.)含有甲氨蝶呤鈉的穩(wěn)定化MLV和 REV脂質(zhì)體（水性和凍干）的儲存穩(wěn)定性（Storage stability of stabilized MLV and REV liposomes containing sodium methotrexate (acqueous & lyophilized)).醫(yī)藥科 學技術(shù)雜志（J. Pharm. Sci. Techno.)，52 (10) : 23-27 (1998);埃洛薩，B. (Elorza, B.)、埃洛 薩，M. A.、賽恩斯，M. C. (Sainz, M. C.)、昌特雷斯，J. R. (Chantres, J. R.)比較三種脂質(zhì)體 制劑的粒徑和囊封參數(shù)（Comparison of particle size and encapsulation parameters of three liposomal preparations).微囊法雜志（J.Microencapsul. ) 10(2) :237_248 (1993);邁哈利，0· (Mykhaylyk, 0·)、桑切斯-安特克拉，Y. (Sdinchez-Antequera, Y.)、 弗拉司寇，D. (Vlaskou, D.)、哈默施密德，E. (Hammerschmid, E.)、安東，M. (Anton, M.)、 賽爾菲替，〇· (Zelphati, 0·)和普蘭克，C. (Plank, C.)脂質(zhì)體磁性轉(zhuǎn)染（Liposomal Magnetofection).分子生物學方法（Methods Mol Bio.)，605:487-525(2010)(這四個出版 物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入））。
[0068] 紅細胞介導的轉(zhuǎn)移類似于脂質(zhì)體融合且已顯示在所測試的所有細胞類型中具有 高效率和功效（微注射和細胞器移植技術(shù)；塞利斯等人編輯；學術(shù)出版社：紐約，1986 (其 出于所有目的全文以引用方式并入））。通常，紅細胞是通過滲透沖擊方法或電穿孔方 法來加載（舍恩，P. (Schoen, P.)、寇恩，A. (Chonn, A.)、卡利斯，P. R. (Cullis, P. R.)、 威斯卡特，J. (Wilschut，J.)和斯楚惹，P. (Schuerrer，P.)在陽離子脂質(zhì)囊泡中復原 的融合蛋白血凝素介導的基因轉(zhuǎn)移（Gene transfer mediated by fusion protein hemagglutinin reconstituted in cationic lipid vesicles).基 因療法(Gene 11^四口7)6:823-832(1999);李，1^!1.(1^，1^!〇、亨森，]\11^〇16118611，]\11^)、趙，￥· L. (Zhao，Y.L.)、惠，S.W. (Hui，S.W.)團粒中不均勻大小的哺乳動物細胞之間的電融合： 在藥物遞送和雜交瘤形成中的潛在應用（Electrofusion between heterogeneous-sized mammalian cells in a pellet:potential applications in drug delivery and hybridoma formation).生物物理學雜志（Biophysical Journal)71:479_486(1996);卡拉 瑟斯，A. (Carruthers, A.)和梅爾基奧爾，D. L. (Melchior, D. L.)復原人類紅細胞糖轉(zhuǎn)運蛋 白的快速方法（A rapid method of reconstituting human erythrocyte sugar transport proteins).生物化學（Biochem. )23:2712-2718(1984)(這三個出版物中的每一者出于所 有目的全文以引用方式并入）。或者，紅細胞可通過用單細胞生物體加載造血祖細胞且誘導 其分化并擴增為含有單細胞生物體的紅細胞間接加載。
[0069] 電穿孔是將因子遞送到細胞中的常用便宜方法。（波特里庫斯，I.用于植物和細 胞培養(yǎng)的基因轉(zhuǎn)移方法（Gene transfer methods for plants and cell cultures) .Ciba 基金會專題論文集154, 198-208 ;討論208-112(1990);沃班克，S. (Wolbank，S.)等人，標 記人類脂肪源干細胞用于非侵入性體內(nèi)細胞追蹤（Labeling of human adipose-derived stem cells for non-invasive in vivo cell tracking).細胞組織庫（Cell Tissue Bank)8, 163-177(2007)(這兩個出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入））。 [0070] 在另一實施例中，使用天然內(nèi)吞細菌的真核細胞（例如，中國倉鼠卵巢（CH0))。在 一個實施例中，將經(jīng)修飾單細胞細菌直接添加到CH0培養(yǎng)物中。通過標準程序在含有10% 胎牛血清培養(yǎng)基的漢姆氏（Ham's) F-12培養(yǎng)基中培養(yǎng)CH0細胞，之后用MTB感染。在感染 后，用呈蘋果酸鐵或？冗13的額外鐵（40到80 μ M)增加培養(yǎng)基。多種其它細胞類型通過胞 吞作用或或更特定來說吞噬作用內(nèi)化細菌；內(nèi)共生生物或寄生物具有其自身的細胞進入方 法且這些天然過程可用于內(nèi)化人工內(nèi)共生生物，從而生成所謂的共生體。在另一實施例中， 可使用微注射、細胞器移植和嵌合體技術(shù)將來自一種細胞的共生體移植到另一細胞類型中 (即，不能胞吞人工內(nèi)共生生物的細胞類型）。在典型培養(yǎng)基中以用于特定細胞類型的典型 技術(shù)培養(yǎng)這些宿主細胞。
[0071] 在一個實施例中，通過脂質(zhì)體介導過程將單細胞生物體引入宿主細胞中。已 將大于ΜΤΒ的線粒體和葉綠體在囊封到脂質(zhì)體中的時候有效引入真核細胞中。（博 尼特，Η.Τ. (Bonnett，H.T.)植物（Planta) 131,229 (1976);翟理斯，K. (Giles，K.); 沃恩，V. (Vaughan, V.);蘭徹，J. (Ranch, J.);埃默里，J. (Emery, J.)脂質(zhì)體介導的 植物原生質(zhì)體攝取葉綠體（Liposome-mediated uptake of chloroplasts by plant protoplasts).體外細胞和發(fā)育生物學-植物（In Vitro Cellular&Developmental Biology-Plant) 16 (7) 581-584(這兩個出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式 并入））?？墒褂枚喾N脂質(zhì)體融合方案和試劑且所屬領(lǐng)域技術(shù)人員不經(jīng)過多實驗即可使 用。（例如，參見本哈伊姆，N.、布羅，P.、馬希，S.、邁耶，W.、亨齊克，P.人工細胞器基 于功能化聚合物囊泡的細胞特異性整合.納米快報8(5) :1368-1373(2008);李安，W.、 常，C、陳，Y.、達奧，R.、羅，Y.、錢，J.、謝，S.、林，C.細胞內(nèi)遞送可無需載劑顆粒通過用 加速分子或細菌轟擊細胞或組織來實現(xiàn).實驗細胞研究313 (1) : 53-64 (2007);邢，B. C.和 曹，T.免疫脂質(zhì)體介導遞送新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶用于分化/定型干細胞后代的譜系特異性 選擇：相對于用標記基因轉(zhuǎn)染、熒光活化和磁性親和性細胞分選的潛在優(yōu)點.醫(yī)學假說 65(2):334-336(2005);波特里庫斯（1990) Ciba基金會專題論文集第154卷：198(這四個 出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入））。
[0072] 根本根據(jù)下文的實驗詳情可更好地理解本文揭示的發(fā)明。然而，所屬領(lǐng)域技術(shù)人 員將容易地了解到，所討論的特定方法和結(jié)果只是闡釋本發(fā)明，其在下文權(quán)利要求書中有 更詳細的描述。
[0073] 實例
[0074] 實例1.將gfplMB微灃射到鼠類細朐中
[0075] A. gfp+AMB 的構(gòu)筑.
[0076] 將eGFP (-個包括gfp基因上游的夏因-達爾加諾（Shine-Dalgarno)序列 且一個不含夏因-達爾加諾）序列的表達載體克隆到隱藏廣泛宿主載體PBBR1MCS-2 中（科瓦奇，Μ. E. (Kovach，Μ. E.)等人廣泛宿主克隆載體pBBRIMCS的四種新衍生物，其 攜載不同抗生素抗性盒（Four new derivatives of the broad-host-range cloning vector pBBRIMCS, carrying different antibiotic-resistance cassettes).基因 (Gene) 166, 175-176,（1995)(其出于所有目的全文以引用方式并入））。用此構(gòu)筑體轉(zhuǎn)化 AMB(ATCC 700264)(松永，T.等人兼性厭氧趨磁細菌磁螺菌菌株AMB-1的完整基因組序列 (Complete genome sequence of the facultative anaerobic magnetotactic bacterium Magnetospirillum sp. strain AMB_1).DNA 研究（DNA Res. )12，157_166 (2005);布格斯 J.G. (Burgess J.G.)等人，從16S ri)NA序列的種系發(fā)生分析推斷出的磁螺菌菌株之間的 進化關(guān)系（Evolutionary relationships among Magnetospirillum strains inferred from phylogenetic analysis of 16S rDNA sequences).細菌學雜志（J. Bacteriol) 175:6689-6694(1993);松永T，等人，磁性細菌中的基因轉(zhuǎn)移：轉(zhuǎn)座子誘變和磁小體合 成所需的基因組 DNA 片段的克?。℅ene transfer in magnetic bacteria:transposon mutagenesis and cloning of genomic DNA fragments required for magnetosome synthesis).細菌學雜志 174:2748-2753(1992);川口 R(Kawaguchi R)等人，好氧磁性細 菌磁螺菌 AMB-1 的種系發(fā)生和 16s rRNA 序列（Phylogeny and 16s rRNA sequence of Magnetospirillum sp. AMB-1, an aerobic magnetic bacterium).核酸石開究(Nucleic Acids Res.) 20:1140,（1992)(這四個出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并 入））。
[0077] 轉(zhuǎn)化是通過使用供體大腸桿菌菌株接合來實現(xiàn)，如以下文獻中所述：古利安，M. (Goulian，M.)、范德沃德，M. A. (van der Woude，Μ. A.)用于在不同細菌中將lacZ轉(zhuǎn)化 為gfp報道基因融合物的簡單系統(tǒng)（A simple system for converting lacZ to gfp reporter fusions in diverse bacteria).基因 372,219_226(2006);舍費爾，八· (Scheffel，A.)、舍烏爾，D. (SchUier，D.)格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌MamJ蛋白質(zhì)的酸性 重復區(qū)顯示超變異性但并非磁小體鏈裝配所需要（The Acidic Repetitive Domain of the Magnetospirilium gryphiswaldense MamJ Protein Displays Hypervarlability but Is Not Required for Magnetosome Chain Assembly).細菌學雜志 9 月刊； 189(17) :6437-6446(2007)(這兩個出版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并 入）。在確定微量需氧條件下在DAP不存在下將交配反應培養(yǎng)10天以選擇陽性轉(zhuǎn)化體。
[0078] 在接合后，含有和不含夏因-達爾加諾序列的gfp+AMB轉(zhuǎn)化體順利顯示GFP熒光。 含有夏因-達爾加諾序列的轉(zhuǎn)化體所顯示GFP熒光水平高于不含此序列的轉(zhuǎn)化體。在以 100 X放大在488nm激發(fā)下觀看時，所得熒光不離開gfp+AMB細胞。
[0079] 通過MRI分析gfp+AMB的磁性性質(zhì)。使用1. 5T儀器將gfp+AMB懸浮于瓊脂塞中以 優(yōu)化并表征成像性質(zhì)。圖1顯示用?\脈沖序列在最高約108MTB/mL的對數(shù)級濃度中生成的 正反差。信號強度與濃度相關(guān)。
[0080] B.微注射到鼠類胚胎細胞中.
[0081] 將gfp+AMB在2細胞期微注射到170個小鼠胚胎中每一胚胎的一個細胞中。每個細 胞注射6個最高約10 5gfp+AMB的對數(shù)級濃度，所述濃度是在565nm下依據(jù)光學密度來估計。 在不同注射濃度之間，細胞在微注射后的死亡率恒定。比較以最高濃度（1〇 5ΜΤΒ/細胞）注 射的細胞的疊加熒光和微分干涉差（DIC)圖像的圖像。微注射對照展現(xiàn)低自發(fā)熒光水平。 在給定時間點比較8細胞胚胎中不同水平面的切片。在每一胚胎中，從經(jīng)注射細胞取得的 所有四個細胞都顯示明顯熒光，而從未注射內(nèi)部對照取得的四個細胞都不顯示明顯熒光。
[0082] 使胚胎在注射后發(fā)育3天。在每一濃度水平中，胚胎存活最長全部3天，發(fā)育到 256細胞囊胚期，且表現(xiàn)得足夠健康以供植入。每一囊胚內(nèi)的多個細胞顯示明顯熒光，表明 隨著包含真核宿主細胞的胚胎發(fā)育到囊胚期，人工內(nèi)共生生物跨越多次細胞分裂轉(zhuǎn)移到子 代細胞中。一個所述囊胚顯示于圖2中，其中圖A顯示囊胚的微分干涉差（DIC)圖像，且圖 B)顯示同一圖像的灰度熒光捕獲，從而顯示遍布囊胚的多個細胞中的熒光。
[0083] 通過在胚胎的8細胞期開始隨時間在不同點測量整個胚胎中的總GFP熒光，使用 共焦顯微術(shù)對所有四個個別胚胎中的GFP的總表達進行定量。圖3顯示胚胎熒光隨時間的 變化。此指示，人工內(nèi)共生生物的拷貝數(shù)在子代細胞中維持至少7代，從而使得隨著胚胎從 2細胞期進展到256細胞囊胚期，維持宿主細胞的熒光表型。
[0084] 這些結(jié)果表明，在通過微注射遞送時，gfp+AMB并非立即被清除或降解，且在3天的 實驗過程期間對發(fā)育中的胚胎無毒性。微注射的胚胎正常分裂，表明gfp+AMB不顯示致病 標記或分泌毒性化合物。其跨越多次細胞分裂轉(zhuǎn)移到子代細胞中，含于細胞質(zhì)中，有小斑點 且均勻分布，并在子代宿主細胞內(nèi)維持拷貝數(shù)，從而使得在子代細胞中經(jīng)過至少7代維持 真核生物宿主細胞的熒光表型。這些結(jié)果表明，AMB可穩(wěn)定維持在細胞內(nèi)并經(jīng)至少7次細 胞分裂轉(zhuǎn)移到子代細胞中。
[0085] 實例2. AMB的吞噬件講入
[0086] 受體介導的：從單核細胞增生李斯特菌（L. monocytogenes)基因組DNA (ATCC 19114)擴增inlAB基因且插入pBBRlMCS-5, 107(pBBRlMCS-2的慶大霉素同源物）中（科 瓦奇，Μ. E.，等人，廣泛宿主克隆載體pBBRIMCS的四種新衍生物，其攜載不同抗生素抗性 盒· Gem 166, 175-176,（1995))，且生成 gfp+inlAB+AMB。將 gfp+inlAB+AMB 與真核宿主細 胞共培養(yǎng)，所述真核宿主細胞包括常見上皮腫瘤細胞系C〇C〇-2、MDA-MB231和MCF7、非上皮 腫瘤細胞系（例如HT-1080和HL60)以及鼠類干細胞。使用熒光顯微術(shù)和FACS來檢測并 定量內(nèi)化和細胞內(nèi)位置。
[0087] 成孔溶血素（hlyA)在AMB中的表達是通過從單核細胞增生李斯特菌基因組 DNA(ATCC 19114)擴增 hlyA 來實現(xiàn)。將擴增 hlyA 插入 pBBRlMCS-3(pBBRlMCS-2 的四環(huán)素 同源物）中，然后使用其來轉(zhuǎn)化gfp+AMB。將所得AMB菌株暴露于能進行自發(fā)吞噬作用的鼠 類巨噬細胞系J774中。使用慶大霉素處理來消除未內(nèi)化細菌并使用hlyAIMB作為陰性對 照。使用熒光顯微術(shù)來監(jiān)測AMB的細胞內(nèi)結(jié)局和定位。
[0088] 如果細菌保持局限于吞噬體中，那么引入單核細胞增生李斯特菌逃脫到胞質(zhì)溶膠 中所涉及的兩個基因 plcA和plcB。（史密斯，G. A. (Smith, G. A.)、馬奎斯，H. (Marquis, H.)、 瓊斯，S. (Jones, S.)、約翰斯頓，Ν· C (Johnston, Ν· C)、波特努瓦，D. A. (Portnoy, D. A.)、 戈德法因，Η· (Goldfine，H.)感染和免疫（Infection and immunity)63:4231(1995);卡 米利，A. (Camilli，A.);戈德法因，H.;波特努瓦，D. A.，實驗醫(yī)學雜志（The Journal of Experimental Medicine) 173:751 (1991)(這兩個出版物中的每一者出于所有目的全文以 引用方式并入））。如果細菌順利逃脫，但未能增殖，那么引入hpt。（戈茨，M.、布博特，A.、 王，G.、奇科-卡萊羅，I.、巴斯克斯-博蘭，J.A.、貝克，M.、斯萊惠斯，J.、紹洛伊，A. A.、格貝爾，W.美國國家科學院院刊98:12221(2001);奇科-卡萊羅，I.、蘇亞雷斯，M. (Suarez, M.)、網(wǎng)薩雷斯-佐恩，B. (Gonzalez-Zorn, B.)、斯考替，M. (Scortti, M.)、斯萊惠 斯，J.、格貝爾，W.、巴斯克斯-博蘭，J.A.美國國家科學院院刊99:431 (2002)(這兩個出 版物中的每一者出于所有目的全文以引用方式并入））。在單核細胞增生李斯特菌中，hpt 編碼負責從胞質(zhì)溶膠攝取葡萄糖-6-磷酸鹽的轉(zhuǎn)運蛋白。其它來自單核細胞增生李斯特 菌的基因參與維持在宿主內(nèi)的生長（glnA和gltAB和argD)，且視需要系統(tǒng)性引入這些基 因。（約瑟夫，B. (Joseph, B.)、普爾茲比拉，K. (Przybilla, K.)、斯圖勒，C(Stuhler, C)、肖 爾，K. (Schauer，K.)、斯萊惠斯，J.、富克斯，T.M. (Fuchs，T.M.)、格貝爾，W.，細菌學雜志 188:556(2006)(其出于所有目的全文以引用方式并入））。
[0089] 實例3. AMB牛長的調(diào)節(jié)
[0090] AMB在胚胎干細胞中生長的調(diào)節(jié)可如下調(diào)節(jié)。從米象（Sitophilus oryzae)總 〇0嫩擴增鞘翅膚-六((]〇16€^61'；[(3；[11-六，（]〇]^)。〇〇]^在米象（3；[1：0口11；[1118)屬甲蟲中的表 達調(diào)節(jié)已自然發(fā)育出與所述甲蟲的密切共生關(guān)系的原細菌的效價，且留存在稱為含 菌細胞的特定細胞中。（洛金，F(xiàn).H. (Login，F(xiàn).H.)、巴爾曼，S. (Balmain，S.)、瓦利耶，A. (Vallier, A.)、文森特-蒙尼蓋特，C(Vincent_Monegat, C)、維涅龍，A. (Vigneron, A.)、韋 斯-加耶，M. (Weiss-Gayet, M.)、羅沙，D. (Rochat, D.)、埃迪，A. (Heddi, A.)抗微生物肽 將昆蟲內(nèi)共生生物保持在控制下（Antimicrobial peptides keep insect endosymbionts under control).科學334(6054) :362-365 (2011)(其出于所有目的全文以引用方式并 入））。
[0091] 使用神經(jīng)分化方案處理包含gfp+AMB的鼠類胚胎干細胞。使用qPCR和熒光顯微 術(shù)對MTB表達水平進行定量。然后使經(jīng)擴增colA在gfp+AMB胚胎干細胞中表達。選擇啟 動子來提供最佳ColA表達水平。
[0092] 實例4.含有g(shù)fplMB的鼠類細朐的磁件表型
[0093] 將來自從鼠類腹水和實體腫瘤取得的引入gfp+AMB的巨噬細胞系J774. 2的細胞 施加到磁選柱上并通過所述柱來保持。這些結(jié)果表明，在引入gfp+AMB后，在J774. 2鼠類 細胞發(fā)生磁性濃縮和磁性收集時，對其進行磁性檢測和磁性操作。
[0094] 實例5.人類乳癌細朐系MDA-MB-231中的GfplMB
[0095] 將 Gfp+AMB、Gfp+InlA/B+AMB 和 Gfp+Plal+AMB 各自引入來自細胞系 MDA-MB-231 的人類乳癌細胞中。在引入Gfp+AMB、Gfp+InlA/B+AMB和Gfp+Plal+AMB中的每一者后48 小時，在90%以上的MDA-MB-231細胞中檢測到GFP熒光。在引入gfp+AMB后至少13天，在 MDA-MB-231細胞在引入后的第四次傳代中，在這些MDA-MB-231細胞中觀察到Gfp+AMB中的 GFP熒光，其中MDA-MB-231細胞群在每次傳代之間加倍3到4次。在MDA-MB-231細胞的在 細胞分裂過程中引入gfp+AMB的兩種所形成的子代細胞中都觀察到GFP熒光
[0096] 在引入 gfp+AMB 后，用購自生命技術(shù)（Life Technologies)的 Lysotracker? 紅 色DND-99染料和Hoechst 33342染色劑對MDA-MB-231細胞進行染色。在定位于個別 MDA-MB-231細胞內(nèi)時觀察到綠色GFP熒光
[0097] 在引入后24小時和72小時，在用PBS洗滌后在福爾馬林（formalin)和戊二醛中 固定平鋪的MDA-MB-231細胞和平鋪的對照MDA-MB-231細胞。然后用普魯士藍（Prussian Blue)對細胞進行染色，且通過顯微術(shù)在40X放大下觀察。在一些引入gfp+AMB的 MDA-MB-231細胞中觀察到鐵染色，但在未引入gfp+AMB的對照MDA-MB-231細胞中未觀察到 所述染色。在引入gfp+AMB后72小時的MDA-MB-231細胞與在引入gfp+AMB后24小時的 MDA-MB-231細胞之間，顯示鐵染色的細胞的比例類似。
[0098] 在引入gfp+AMB后48小時，將MDA-MB231細胞胰蛋白酶化并再懸浮于PBS中。將這 些細胞的一個樣品置入載玻片室中。將磁體與室側(cè)面對準且在顯微鏡下在20X放大下觀 察細胞移動。引入gfp+AMB的MDA-MB231細胞展現(xiàn)朝向磁體的移動，但未引入gfp+AMB的對 照MDA-MB231細胞不展現(xiàn)所述移動。將這些細胞的另一樣品置入小管中，將其捆扎到磁體 并保持1小時。未引入gfp+AMB的對照MDA-MB231細胞沉降在管底部。然而，引入gfp+AMB 的MDA-MB231細胞與管的磁體側(cè)對準。
[0099] 這些結(jié)果指示，gfp+AMB并非立即從人類乳癌MDA-MB-231細胞中清除。其跨越至少 12次細胞分裂轉(zhuǎn)移到子代細胞中且定位在MDA-MB-231細胞內(nèi)，在溶酶體和細胞核二者外 部。這些結(jié)果還表明，在引入gfp+AMB后至少48小時，在所顯示含有g(shù)fp+AMB的MDA-MB-231 細胞發(fā)生磁性移動、磁性靶向位置、磁性濃縮和磁性收集時，對其進行磁性檢測和磁性操 作。另外，在引入gfp+AMB后至少72小時，MDA-MB-231細胞含有可觀察量的鐵。
[0100] 實例6.人類誘導多能干細朐中的GfplMB
[0101] 在將gfp+AMB引入人類誘導多能干（"IPS"）細胞中之后至少8天時，在IPS細胞 的第二次傳代中，在IPS細胞中觀察到GFP熒光。這些結(jié)果指示，gfp+AMB并非立即從人類 IPS細胞中清除，且轉(zhuǎn)移到子代細胞中。
[0102] 本文討論和引用的所有出版物、專利和專利申請案都是全文以引用方式并入本文 中。應理解，所揭示本發(fā)明并不限于所述具體方法、方案和材料，因為這些可變。還應理解， 本文所用術(shù)語僅出于闡述具體實施例的目的，且不打算限制本發(fā)明的范圍，本發(fā)明的范圍 僅受限于所附權(quán)利要求書。
[0103] 所屬領(lǐng)域技術(shù)人員僅使用常規(guī)實驗即可認識到或能確定本文所述本發(fā)明的特定 實施例的多種等效形式。所述等效形式都打算涵蓋在以下權(quán)利要求書中。
【權(quán)利要求】
1. 一種真核宿主細胞，其在所述宿主細胞中包含人工內(nèi)共生生物。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞，其中所述真核宿主細胞是哺乳動物細胞。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的細胞，其中所述哺乳動物宿主細胞是鼠類細胞。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的細胞，其中所述哺乳動物宿主細胞是人類細胞。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞，其中所述人工內(nèi)共生生物經(jīng)遺傳修飾。
6. -種真核細胞，其在所述真核細胞中包含趨磁細菌。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的細胞，其中所述趨磁細菌來自選自由以下組成的群組的菌 株：趨磁螺菌菌株AMB-1、向磁磁螺菌、格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌、多形磁螺菌、磁螺菌MSM-4、 磁螺菌MSM-6、海洋趨磁球菌和趨磁球菌菌株MC-1。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的細胞，其中所述趨磁細菌經(jīng)遺傳修飾。
9. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的細胞，其中所述真核細胞是哺乳動物細胞。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的細胞，其中所述哺乳動物細胞是鼠類細胞。
11. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的細胞，其中所述哺乳動物細胞是人類細胞。
12. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的細胞，其中所述人類細胞是癌細胞。
13. 根據(jù)權(quán)利要求11所述的細胞，其中所述人類細胞是IPS細胞。
14. 一種磁性操作真核細胞的方法，其包含使根據(jù)權(quán)利要求6所述的細胞經(jīng)受磁場。
15. -種檢測真核細胞的方法，其包含使根據(jù)權(quán)利要求6所述的細胞經(jīng)受磁場。
16. -種產(chǎn)生人工內(nèi)共生生物的方法，其包含將趨磁細菌引入真核宿主細胞中。
17. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述真核宿主細胞是哺乳動物細胞。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述哺乳動物宿主細胞是鼠類細胞。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17所述的方法，其中所述哺乳動物宿主細胞是人類細胞。
20. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述人類細胞是癌細胞。
21. 根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中所述人類細胞是IPS細胞。
22. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述趨磁細菌選自菌株，所述菌株選自由以下 組成的群組：趨磁螺菌菌株AMB-1、向磁磁螺菌、格瑞菲斯瓦爾德磁螺菌、多形磁螺菌、磁螺 菌MSM-4、磁螺菌MSM-6、海洋趨磁球菌和趨磁球菌菌株MC-1。
23. 根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述趨磁細菌是經(jīng)遺傳修飾的細菌。
【文檔編號】A61K35/74GK104159593SQ201380013027
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2013年1月14日 優(yōu)先權(quán)日:2012年1月13日
【發(fā)明者】凱萊布·B·貝爾三世, 亞力克西·巴扎羅夫 申請人:貝爾生物系統(tǒng)公司