雙功能肽的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種雙功能肽，其能夠激活膠原蛋白合成并且抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的生成，所述肽具有包括三個(gè)肽部分A、B和C的序列：第一肽部分A，對(duì)應(yīng)于重復(fù)至少三次的六肽，所述部分A能夠結(jié)合到受體彈性蛋白結(jié)合蛋白，以刺激膠原蛋白合成；第二肽部分B，對(duì)應(yīng)于能夠用作尿激酶蛋白酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑且被所述蛋白酶裂解的四肽；以及第三肽部分C，對(duì)應(yīng)于占據(jù)所述基質(zhì)金屬蛋白酶的至少一個(gè)活性位以抑制所述蛋白酶的三肽。本發(fā)明進(jìn)一步涉及包括所述雙功能肽的化妝品和/或藥物組合物。
【專利說(shuō)明】雙功能肽

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種肽，其將應(yīng)用于化妝品和藥物領(lǐng)域。
[0002] 本發(fā)明將主要應(yīng)用于特別是受到皮膚老化影響的真皮組織的修復(fù)或再生領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0003] 皮膚老化或多或少是由于合成控制機(jī)制的大規(guī)模失衡以及真皮的細(xì)胞外基質(zhì)的 組分的降解，而真皮則構(gòu)成皮膚的最內(nèi)層。由此，在皮膚老化期間，在真皮的細(xì)胞外基質(zhì)中， 一方面觀察到某些大分子（即，膠原蛋白和彈性蛋白）的合成減少，且另一方面觀察到某些 酶（例如，基質(zhì)金屬蛋白酶或MMPs)的表達(dá)的增加。后者即呈現(xiàn)溶膠原和彈性蛋白離解活 性，并且因此導(dǎo)致真皮基質(zhì)的大分子的降解。結(jié)果，皮膚失去色澤，表皮擴(kuò)張，導(dǎo)致皺紋的形 成。這種現(xiàn)象也會(huì)被外部因素放大，例如暴露于紫外線、污染物、壓力，或者煙草。
[0004] 傳統(tǒng)上，現(xiàn)有技術(shù)中已知的方案針對(duì)的是減慢皺紋的形成。這些策略包括：
[0005] -去死皮（peeling)或磨皮（dermabrasion)，這是一種皮膚的侵略性療法，以減少 其厚度；
[0006] -玻尿酸或肉毒桿菌毒素的抗皺注射，分別具有皺紋填充（wrinkle-filling)效應(yīng) 和使目標(biāo)肌肉麻痹作用以暫時(shí)減少皺紋；然而，這些技術(shù)昂貴且只呈現(xiàn)短期效果；
[0007] -表面治療的應(yīng)用，例如保濕劑、抗皺或平滑霜，可減慢皺紋的形成，但不能修正已 經(jīng)形成的皺紋；
[0008] -基于自體干細(xì)胞的療法，其仍然難以控制。
[0009] 此后幾年，實(shí)驗(yàn)室實(shí)施了其他策略以對(duì)抗皮膚老化效應(yīng)。
[0010] 具體地，歐洲專利申請(qǐng)EP1275372使用了例如N-?；被０费苌锏幕衔?。 更具體地，該文獻(xiàn)公開(kāi)了一種組合物，該組合物除包括上述的N-酰基氨基酰胺以外還包括 金屬蛋白酶抑制蛋白，而所述金屬蛋白酶則參與膠原蛋白的降解。
[0011] 然而，這樣的方案不是最佳的，具體因?yàn)樵摲桨敢环矫嫘枰獛追N化合物的組合，且 另一方面該方案不是積極作用在膠原蛋白的合成上。
[0012] 某些肽衍生物的使用也已被開(kāi)發(fā)，以預(yù)防皮膚老化癥狀。
[0013] 因此，例如，已知來(lái)自FR285489的包括肽衍生物的化妝品組合物， 該肽衍生物來(lái)自彈性蛋白。更具體地，該肽衍生物可具有如下序列：Rl-(AA) n-Val-Gly-Val-Ala-Pr〇-Gly-0R2,其中，
[0014] -R1對(duì)應(yīng)于Η或包括2到22個(gè)碳的烷基鏈，
[0015] _(ΑΑ)η對(duì)應(yīng)于肽鏈，其中，ΑΑ由任意的氨基酸或氨基酸衍生物構(gòu)成，并且其中，η 在0和3之間變化，
[0016] -R2對(duì)應(yīng)于Η或包括1到24個(gè)碳的烷基鏈。
[0017] 包括這種肽衍生物的化妝品組合物能夠?qū)崿F(xiàn)緊致以及重建的效果。
[0018] 然而，這樣的肽衍生物或包括該衍生物的組合物不能抑制ΜΜΡ蛋白酶的活性和/ 或表達(dá)，ΜΜΡ蛋白酶參與膠原蛋白的降解，而膠原蛋白構(gòu)成人體組織的細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋 白，也即真皮的主要蛋白。膠原蛋白能給予組織對(duì)張力的抵抗力。由此，上述文獻(xiàn)中描述的 肽不能防止對(duì)于保持皮膚光澤所必要的膠原蛋白的降解。
[0019] 還已知來(lái)自W0 2006053688的組合物，其包括幾種肽并且在抗皺治療中使用。具 體地，該組合中的這些肽在若干層面上參與了膠原蛋白和/或纖連蛋白的合成過(guò)程，即通 過(guò)刺激這種合成。
[0020] DE 10 2004 055 541轉(zhuǎn)而公開(kāi)了包括肽的組合的組合物，以刺激生長(zhǎng)因子 TGF-β的釋放，生長(zhǎng)因子TGF-β能誘發(fā)膠原蛋白的合成。
[0021] 然而，這些專利文獻(xiàn)中描述的肽具有如上所例舉的相同的缺陷，即，事實(shí)上這些專 利文獻(xiàn)中所建議的序列不能降低導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白降解的酶的表達(dá)，并且特別是不能 降低導(dǎo)致膠原蛋白降解的酶的表達(dá)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0022] 本發(fā)明通過(guò)提供一種雙功能肽而能夠應(yīng)對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的各種缺陷，該雙功能肽同時(shí) 具有刺激膠原蛋白的合成的性質(zhì)以及抑制參與膠原蛋白的降解級(jí)聯(lián)的蛋白酶的性質(zhì)。
[0023] 為此，本發(fā)明涉及一種能夠激活膠原蛋白合成并且抑制基質(zhì)金屬蛋白酶生成的雙 功能肽，所述肽具有包括三個(gè)肽部分A、B和C的序列：
[0024] -第一肽部分A，對(duì)應(yīng)于一重復(fù)至少三次的六肽，所述肽部分A能夠結(jié)合到彈性蛋 白結(jié)合受體蛋白以刺激膠原蛋白合成；
[0025] -第二肽部分B，對(duì)應(yīng)于能夠用作尿激酶蛋白酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑且能夠被所述蛋 白酶裂解的四肽；以及
[0026] -第三肽部分C，對(duì)應(yīng)于占據(jù)基質(zhì)金屬蛋白酶的至少一個(gè)活性位點(diǎn)的三肽，從而抑 制所述蛋白酶。
[0027] 有利地，刺激膠原蛋白合成的第一肽部分A具有Xl-Gly-X2-X3-Pr〇-Gly序列，該 序列重復(fù)至少三次，其中：
[0028] -XI對(duì)應(yīng)于任意的氨基酸，
[0029] -X2對(duì)應(yīng)于選自Val、Thr、Gin、Ala和Leu的氨基酸，
[0030] -X3對(duì)應(yīng)于選自Ala、Leu和lie的氨基酸。
[0031] 更有利地，所述肽的第一肽部分A具有Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly序列。
[0032] 優(yōu)選地，可被蛋白酶裂解的第二肽部分B具有Arg-Yl-Arg-Y2序列，其中，Y1和Y2 中的每一個(gè)對(duì)應(yīng)于選自Ser、Tyr、Gly、Ala、Arg、Val和Leu的氨基酸。
[0033] 更優(yōu)選地，所述肽的第二肽部分B具有Arg-Val-Arg-Leu序列。
[0034] 根據(jù)一個(gè)令人關(guān)注的實(shí)施方案，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的第三部分C具有 Zl-ile-Z2序列，其中：
[0035] -Z1對(duì)應(yīng)于選自Gly、lie和Leu的氨基酸，且
[0036] -Z2對(duì)應(yīng)于選自Leu、Phe、Ala、lie和Val的氨基酸。
[0037] 甚至更有利地，所述肽的第三肽部分C具有Gly-Ile-Leu序列。
[0038] 根據(jù)優(yōu)選的實(shí)施方案，本發(fā)明的肽具有對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID No. 1的如下序列S1 :
[0039] SI ：N- (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-〇H,
[0040] 其中，N和0H分別對(duì)應(yīng)于所述肽的N-末端和C-末端，并且
[0041] 其中，η = 3。
[0042] 然而，本發(fā)明雙功能肽的序列還可對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID No. 2至SEQ ID No. 26中的 一個(gè)。
[0043] 優(yōu)選地，本發(fā)明的雙功能肽通過(guò)化學(xué)合成獲得。此外，所述肽可有利地以凍干形式 保存。
[0044] 有利地，本發(fā)明的雙功能肽可用于慢性疤痕疾病的治療，即壓瘡或潰瘍的治療。
[0045] 本發(fā)明的雙功能肽還可用于真皮組織的修復(fù)和/或再生，即用于皮膚老化的治 療。
[0046] 本發(fā)明還涉及包括本發(fā)明雙功能肽的化妝品和/或藥物組合物。
[0047] 優(yōu)選地，所述化妝品組合物中的雙功能肽的濃度在10 μ g/mL到lmg/mL之間，并且 優(yōu)選地基本上等于100 μ g/mL。
[0048] 本發(fā)明的雙功能肽具有許多優(yōu)勢(shì)。一方面，它可刺激膠原蛋白，即，I型和III型 膠原蛋白的合成。III型膠原蛋白生產(chǎn)的增長(zhǎng)是尤其令人關(guān)注的；事實(shí)上，這種類型的膠原 蛋白被稱為"胎兒（fetal)"型膠原蛋白，因?yàn)樗饕谔弘A段和童年時(shí)期合成。這種類 型的膠原蛋白允許特別優(yōu)化的組織治愈，被稱為"完美"治愈。另一方面，所述肽可降低由 蛋白酶造成的膠原溶解。此外，同時(shí)獲得對(duì)膠原蛋白合成的刺激和對(duì)金屬蛋白酶的抑制分 別取決于雙功能肽的肽部分A和C，雙功能肽還包括肽部分B，其連接其他兩個(gè)部分且能夠 被尿激酶裂解。由此，本發(fā)明肽可具有約25個(gè)氨基酸的短序列，這容易進(jìn)行化學(xué)合成。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049] 本發(fā)明進(jìn)一步的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)將從以下參考附圖的本發(fā)明的非限制性實(shí)施方案的 詳細(xì)描述中變得清楚，其中：
[0050] -圖1是本發(fā)明肽的作用機(jī)制的示意圖。
[0051] -圖2是纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)的酶級(jí)聯(lián)的示意圖。
[0052] -圖3A和3B是柱狀圖，分別示出I型和III型膠原蛋白的合成，所述合成通過(guò)由 濃度為1〇〇 μ g/ml的本發(fā)明肽或相同肽的片段處理過(guò)的成纖維細(xì)胞進(jìn)行。
[0053] -圖4以柱狀圖的形式示出C0L1A1和C0L3A1基因的基因表達(dá)，C0L1A1和C0L3A1 基因分別編碼I型和III型膠原蛋白，所述I型和III型膠原蛋白培養(yǎng)自由本發(fā)明肽或相 同肽的片段處理過(guò)的真皮成纖維細(xì)胞。
[0054] -圖5示出，取決于患者的年齡（35、42和53歲），本發(fā)明雙功能肽分別對(duì)I型和 III型膠原蛋白的蛋白表達(dá)的效果，I型和III型膠原蛋白來(lái)自這些患者的真皮成纖維細(xì) 胞。
[0055] -圖6A和6B示出相對(duì)于合成底物（synthetic substrate)，雙功能肽對(duì)尿激酶活 性的效果。
[0056] -圖7A和7B示出相對(duì)于合成底物，雙功能肽對(duì)MMP-1活性的效果。
[0057] -圖8A和8B分別示出未經(jīng)尿激酶處理過(guò)和經(jīng)由尿激酶處理過(guò)的本發(fā)明肽的洗脫 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0058] 作為初步準(zhǔn)備和信息性說(shuō)明，本說(shuō)明書(shū)使用國(guó)際上的三字母碼來(lái)命名氨基酸。由 此，Ala對(duì)應(yīng)于丙氨酸（A)、Cys對(duì)應(yīng)于半胱氨酸（C)、Asp對(duì)應(yīng)于天冬氨酸（D)、Glu對(duì)應(yīng)于 谷氨酸（E)、Phe對(duì)應(yīng)于苯丙氨酸（F)、Gly對(duì)應(yīng)于甘氨酸（G)、His對(duì)應(yīng)于組氨酸（H)、Ile對(duì) 應(yīng)于異亮氨酸（I)、Lys對(duì)應(yīng)于賴氨酸（K)、Leu對(duì)應(yīng)于亮氨酸（L)、Met對(duì)應(yīng)于蛋氨酸（M)、 Asn對(duì)應(yīng)于天冬酰胺（N)、Pro對(duì)應(yīng)于脯氨酸（P)、Gln對(duì)應(yīng)于谷氨酰胺（Q)、Arg對(duì)應(yīng)于精氨 酸（R)、Ser對(duì)應(yīng)于絲氨酸⑶、Thr對(duì)應(yīng)于蘇氨酸⑴、Val對(duì)應(yīng)于纈氨酸（V)、Trp對(duì)應(yīng)于 色氨酸（W)，以及Tyr對(duì)應(yīng)于酪氨酸（Y)。
[0059] 皮膚老化和由此導(dǎo)致的皺紋形成在細(xì)胞和分子水平上以對(duì)進(jìn)入細(xì)胞外基質(zhì)的成 分中的大分子合成相關(guān)的基因表達(dá)的降低為特征，例如膠原蛋白或彈性蛋白。另外，這些 基質(zhì)蛋白的生成的降低通常伴隨著與基質(zhì)蛋白降解相關(guān)的酶的過(guò)度表達(dá)；由此，真皮層面 上的光澤降低、表皮的擴(kuò)張以及最后皺紋的形成，部分是因?yàn)檫@些酶（基質(zhì)金屬蛋白酶或 MMPs)〇
[0060] 膠原蛋白是構(gòu)成人體組織的細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白。具體地，膠原蛋白在真皮層 面上占約90 %，真皮構(gòu)成皮膚的固體支撐并且起著營(yíng)養(yǎng)物和溫度控制的作用，并起抵御病 原微生物的作用。真皮主要由所謂的成纖維細(xì)胞形成，成纖維細(xì)胞參與膠原蛋白的合成以 及細(xì)胞外基質(zhì)的組織（organization)。
[0061] 由此，細(xì)胞外基質(zhì)的框架由膠原蛋白形成，但也由彈性蛋白，結(jié)構(gòu)糖蛋白和蛋白聚 糖，形成。更具體地，真皮基質(zhì)包括I型和III型膠原蛋白原纖維和V型膠原蛋白核心。
[0062] V型膠原蛋白有可能被所謂的MMP蛋白降解，MMP蛋白家族包括不少于26個(gè)成員。 更具體地，這些蛋白對(duì)應(yīng)于內(nèi)肽酶，即，其破壞蛋白內(nèi)的肽鍵。
[0063] 科學(xué)家們（Voorhes等、Hornebeck等，2009)進(jìn)行的研究已經(jīng)表明皮膚細(xì)胞、成纖 維細(xì)胞的衰老以這些內(nèi)肽酶（即MMP-1)的表達(dá)增加為特征。MMP-1屬于間質(zhì)膠原酶組，并且 是I型和III型膠原蛋白裂解的原因。無(wú)論是隨時(shí)間順序的還是光誘發(fā)的皮膚老化，MMP-1 被認(rèn)為是參與皮膚老化的主要膠原酶。
[0064] 由此，與降解酶（即，MMP-1)的增加相關(guān)聯(lián)的真皮基質(zhì)蛋白，也即膠原蛋白的減少 是皮膚老化的重要因素，其導(dǎo)致皮膚光澤的減少以及可見(jiàn)皺紋的形成。
[0065] 由此，本發(fā)明人創(chuàng)造性地研發(fā)出一種肽，其具有多種功能并且既允許在膠原蛋白 分子的合成過(guò)程的層面上作用，也允許在這些分子的降解級(jí)聯(lián)的不同層面上作用。
[0066] 并且，特別有利地，本發(fā)明的雙功能肽具有促進(jìn)恢復(fù)細(xì)胞外（即真皮）基質(zhì)的合成 代謝（合成）和分解代謝（分解）過(guò)程之間的平衡的特性。
[0067] 特別優(yōu)選地，本發(fā)明肽是雙功能的且包括可被劃分為以下三個(gè)部分的序列：
[0068]-第一肽部分，被稱為部分A，有利地具有增加膠原蛋白合成的功能；
[0069]-第二肽部分，被稱為部分B，優(yōu)選地具有被蛋白酶，尿激酶，所識(shí)別的序列，從而 所述肽部分B能夠被該蛋白酶裂解；
[0070] -第三肽部分，被稱為部分C，部分C能夠抑制MMPs。
[0071] 由此，本發(fā)明的肽一方面允許刺激膠原蛋白合成，并且另一方面允許通過(guò)抑制尿 激酶和MMP蛋白酶（即，MMP-1)來(lái)降低所述膠原蛋白的降解。
[0072] 更具體地，允許增加膠原蛋白合成的肽部分A由六肽組成，即一系列的6氨基酸殘 基。有利地，該六肽在本發(fā)明的雙功能肽內(nèi)重復(fù)至少3次。
[0073] 更優(yōu)選地，雙功能肽的肽部分A具有如下序列：Xl-Gly-X2-X3-Pr〇-Gly，其中XI、 X2和X3對(duì)應(yīng)于氨基酸。如上所述，該六肽序列)(l-Gly-X2-X3-Pr〇-Gly在本發(fā)明的肽內(nèi)重 復(fù)至少三次。事實(shí)上，一些研究表明重復(fù)三次所述序列在序列活性方面提供不同的、甚至更 引人關(guān)注的結(jié)果（Alix2001)。
[0074] 根據(jù)一令人關(guān)注的實(shí)施方案，肽部分A的XI殘基對(duì)應(yīng)任意的氨基酸。而殘基X2 有利地對(duì)應(yīng)于選自Val、Thr、Gin、Ala和Leu的氨基酸。最后，X3殘基優(yōu)選地對(duì)應(yīng)于選自 Ala、Leu和lie的氨基酸。
[0075] 還有更優(yōu)選地，XI和X2對(duì)應(yīng)于Val，且X3對(duì)應(yīng)于Ala。由此，對(duì)應(yīng)于雙功能肽的 部分A的六肽優(yōu)選地具有序列Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly。
[0076] 如在所附的圖3A和3B中以及以下的實(shí)施例1中說(shuō)明和解釋的，重復(fù)至少三次且 與肽部分B和C相關(guān)聯(lián)的上述序列對(duì)膠原蛋白（即，III型膠原蛋白）的蛋白表達(dá)有顯著 刺激。
[0077] 如圖4所說(shuō)明的，本發(fā)明的肽還允許分別編碼I型膠原蛋白和III型膠原蛋白的 C0L1A1和C0L3A1基因的基因表達(dá)的增加。雙功能肽在III型膠原蛋白合成上的作用尤其 令人關(guān)注；事實(shí)上，已知III型膠原蛋白在胎兒水平為占多數(shù)的膠原蛋白，而其生成在童年 期逐漸減少，直到在成年時(shí)其生成達(dá)到一個(gè)非常低的水平。舉例來(lái)說(shuō)，成人的III型膠原蛋 白為I型膠原蛋白的六分之一（Melissopoulosl998 ;Herbage，1997)。在治療期間，III型 膠原蛋白主要由肌成纖維細(xì)胞合成，以替換受損組織。在胎兒水平，III型膠原蛋白允許所 謂的"完美"治愈（Lorena 等，2002. Ferguson&0' Kane, 2004)。
[0078] 本發(fā)明雙功能肽的Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly序列的構(gòu)思來(lái)自由彈性纖維的 降解得到的彈性蛋白肽或彈性蛋白衍生肽（6lastokines)。由于脯氨酸和甘氨酸在所述 Xl-Gly-X2-X3-Pr〇-Gly序列內(nèi)的存在，這樣的序列采取VIII型β-肘形（Floquet等， 2004)。這種結(jié)構(gòu)模式被彈性蛋白受體蛋白識(shí)別，彈性蛋白受體蛋白傳統(tǒng)上以其英文名彈性 蛋白結(jié)合蛋白（Elastin Binding Protein)被引用，并且簡(jiǎn)稱為EBP。EBP被固定化在細(xì)胞 表面上，與另外兩個(gè)亞單位相關(guān)聯(lián)：結(jié)合到細(xì)胞膜上的保護(hù)蛋白或組織蛋白酶A(PPCA)和 神經(jīng)氨酸酶（Neu-Ι)。圖1中示出雙功能肽的肽部分A占據(jù)EBP受體蛋白導(dǎo)致分子單元的 激活，即導(dǎo)致I型和III型膠原蛋白的合成。
[0079] 分子單元的這種激活也可作用在成纖維細(xì)胞的趨化、增殖、粘附和存活上，并且還 可作用在血管生成上，血管生成在慢性創(chuàng)面（例如壓瘡或潰瘍）的血管再生過(guò)程中是必要 的。
[0080] 關(guān)于肽部分B，其優(yōu)選地由四肽組成，即包括4氨基酸的序列。
[0081] 更具體地，該四肽代表一作為底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑與絲氨酸蛋白酶（尿激酶）相 互作用的部門(mén)。由此，這允許在細(xì)胞附近釋放其他兩個(gè)肽部分A和C。
[0082] 尿激酶優(yōu)選地裂解具有兩個(gè)精氨酸的序列。因此，有利地，肽部分B具有序列 Arg-Yl-Arg-Y2,其中Y1和Y2對(duì)應(yīng)于氨基酸。
[0083] 根據(jù)一特定的示例性實(shí)施方案，Y1和Y2中的每一個(gè)對(duì)應(yīng)于選自Ser、Tyr、Gly、 Ala、Arg、Leu和Val的氨基酸。這些氨基酸與可斷裂的Arg位點(diǎn)相聯(lián)，優(yōu)選地被尿激酶蛋 白酶裂解。
[0084] 甚至更優(yōu)選地，本發(fā)明雙功能肽的肽部分B包括Arg-Val-Leu-Arg序列。
[0085] 尿激酶蛋白酶是纖溶酶原-纖溶酶系統(tǒng)的激活劑之一。纖溶酶原是尿激酶的生理 底物，尿激酶能以纖溶酶的形式將纖溶酶原激活。這種激活引發(fā)蛋白水解級(jí)聯(lián)，最終激活 MMP-1和MMP-3。由尿激酶蛋白酶引發(fā)的纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)的酶級(jí)聯(lián)在所附的圖2中 顯不。
[0086] 由此，尿激酶對(duì)纖溶酶原的活性是膠原蛋白，也即I型和III型膠原蛋白，降解的 間接原因。因此，肽部分B在本發(fā)明雙功能肽中的存在將用作尿激酶的底物或競(jìng)爭(zhēng)性抑制 齊IJ。結(jié)果，尿激酶將斷裂存在于肽部分B上Arg位點(diǎn)，因此將只有更少量的尿激酶被提供從 而造成對(duì)纖溶酶中的纖溶酶原的抑制；膠原蛋白大分子的降解也將由此減少。圖6A和圖6B 說(shuō)明了本發(fā)明的肽對(duì)尿激酶活性的作用。
[0087] 現(xiàn)在來(lái)看雙功能肽的肽部分C，其有利地由三肽組成，三肽是包括3氨基酸的序 列。
[0088] 優(yōu)選地，肽部分C具有Zl-Ile_Z2序列，其中Z1和Z2中的每一個(gè)對(duì)應(yīng)于氨基酸殘 基。
[0089] 根據(jù)一個(gè)令人關(guān)注的示例性實(shí)施方案，Z1是選自Gly、Leu和lie的氨基酸，而Z2 則選自 Leu、Phe、Ala、lie 和 Val。
[0090] 更優(yōu)選地，Z1對(duì)應(yīng)于Gly且Z2對(duì)應(yīng)于Leu。由此，雙功能肽的肽部分C有利地具 有Gly-Ile-Leu序列。該三肽Gly-Ile-Leu確實(shí)易于占據(jù)MMP-1的活性位點(diǎn)的一部分，且 用作該酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。
[0091] 事實(shí)上，這些氨基酸是尤其令人關(guān)注的，因?yàn)樗鼈兛赡芫哂蠭型MMP的三個(gè)袋 (p〇Cket)-P' 1、P' 2和P' 3袋。結(jié)果，I型膠原酶的活性位點(diǎn)不再能與Zn2+離子結(jié)合成螯合 物，而Zn2+離子對(duì)于所述膠原酶的活性是必要的。由此，由于本發(fā)明的雙功能肽，MMP-1對(duì) 膠原蛋白大分子的降解被降低。所附的圖7A和7B具體說(shuō)明這一點(diǎn)。
[0092] 因此，根據(jù)在膠原蛋白合成和MMPs(特別是MMP-1)的抑制方面獲得令人關(guān)注的結(jié) 果的優(yōu)選實(shí)施方案，本發(fā)明的雙功能肽具有如下序列，其被命名為序列S1且對(duì)應(yīng)于SEQ ID No. 1 ：
[0093] SI:N_(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-〇H。
[0094] 優(yōu)選地，Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly序列重復(fù)3次；換句話說(shuō)，n優(yōu)選等于3。然 而，該序列也可以重復(fù)大于3的次數(shù)。
[0095] 根據(jù)本發(fā)明的肽也可以具有，例如，被確定為SEQ ID No. 2到SEQ ID No. 26的序 列。
[0096] 然而，該序列的列表不是窮盡的，因此本發(fā)明并不受限于此。
[0097] SP，序列SEQ ID No. 1到26的氨基酸可以被化學(xué)上等價(jià)（SP，具有等價(jià)的物理和 化學(xué)性質(zhì)）的氨基酸替換；等價(jià)氨基酸之間的替換在例如非極性脂肪族氨基酸Ala、Val、 lie、Leu之間進(jìn)行，或在攜帶羥基的極性氨基酸Ser和Thr之間、氨基酸Asn和Gin之間、 攜帶兩個(gè)酸官能團(tuán)的氨基酸Asp和Glu之間等進(jìn)行。該信息列在Merops (http://merops. sanger.ac.uk/)的蛋白酶數(shù)據(jù)庫(kù)中。
[0098] 本發(fā)明的雙功能肽優(yōu)選地通過(guò)化學(xué)合成獲得。
[0099] 有利地，實(shí)施莉甲氧羰基技術(shù)（Fmoc)/叔丁基（tBu)以在Fmoc-Leu-Wang PS樹(shù)脂 上獲得肽鏈的延伸。
[0100] 然而，本發(fā)明并不限于這樣的實(shí)施方案，并且雙功能肽的化學(xué)合成可通過(guò)任何其 他合適的用于該目的且被本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的技術(shù)獲得。
[0101] 有利地，本發(fā)明肽是凍干的，以保證最佳的保存。
[0102] 本發(fā)明雙功能肽在制造針對(duì)促進(jìn)皮膚組織的修復(fù)和/或再生的化妝品組合物中 的使用是特別令人關(guān)注的。所述肽確實(shí)通過(guò)其在膠原蛋白的生成上的作用限制皺紋的形 成。
[0103] 另外，發(fā)明人已經(jīng)證明本發(fā)明的雙功能肽在膠原蛋白的生成上的效果看起來(lái)依賴 于患者的年齡。事實(shí)上，聯(lián)系圖5,實(shí)施例3中示出的結(jié)果顯示I型膠原蛋白的表達(dá)以及尤 其是III型膠原蛋白的表達(dá)在較年長(zhǎng)的患者中更多。由此，這樣的結(jié)果確定了在用于對(duì)抗 皮膚老化的化妝品組合物中使用所述肽是有益的。
[0104] 然而，本發(fā)明不限于這樣的實(shí)施方案。例如，本發(fā)明雙功能肽還可用于藥物組合物 的制備。
[0105] 事實(shí)上，基質(zhì)蛋白（例如膠原蛋白）的合成和這些相同蛋白的降解之間的平衡被 打破會(huì)導(dǎo)致慢性創(chuàng)面（也被稱為慢性疤痕疾病）的發(fā)展，例如壓瘡、潰瘍或嚴(yán)重?zé)齻娜恕?具體地，這些疾病表現(xiàn)為基質(zhì)蛋白酶MMPs的過(guò)度表達(dá)，并且一般與例如糖尿病或血管疾病 之類的疾病相關(guān)聯(lián)。
[0106] 這些慢性疤痕疾病在發(fā)達(dá)國(guó)家正在穩(wěn)定增長(zhǎng)，主要是由于人口老齡化。因此，這些 疾病的治療和管理表現(xiàn)出不可忽視的成本。
[0107] 在細(xì)胞水平上已顯示出大量的蛋白酶且即MMP-1型金屬蛋白酶在壓瘡型慢性創(chuàng) 面附近被釋放。研究也提供了 I型膠原酶或MMP-1的活性在慢性傷口的分泌物中顯著增長(zhǎng) 的證據(jù)。這種增長(zhǎng)是所述創(chuàng)面附近I型和III型膠原蛋白大分子降解的原因（Barone等， 1998. Shi 等，2006)。
[0108] 現(xiàn)在，具體地來(lái)看潰瘍，也已證明大量的蛋白酶在這些傷口附近出現(xiàn)。具體地，研 究鑒定出的MMP-1的比率是平常的65倍高，這些MMP接著造成細(xì)胞外基質(zhì)的蛋白的降解 過(guò)多且被延長(zhǎng)，以及也造成生長(zhǎng)因子蛋白的降解過(guò)多和延長(zhǎng)，導(dǎo)致治愈被延遲（Fischer等 2009)。
[0109] 最后，已經(jīng)證明，如圖2中可見(jiàn)，作為纖溶酶原/纖溶酶系統(tǒng)以及作為某些MMPs 被激活的間接原因的尿激酶激活劑，其濃度在腿部潰瘍以及壓瘡層面中極大地增加 (Werckroth 等 2004)。
[0110] 由此，能夠使得MMP蛋白酶活性降低并且使得基質(zhì)蛋白的合成增加的本發(fā)明的肽 將促進(jìn)這些慢性傷口的治療并且將替代當(dāng)前繁重、昂貴且低效的藥物治療。
[0111] 根據(jù)特定實(shí)施方案，本發(fā)明的雙功能肽被加入粘附于受到慢性創(chuàng)面影響的人體部 位的貼片中。
[0112] 然而，本發(fā)明絕不限于這樣的實(shí)施方案，并且可容易地預(yù)期本發(fā)明的雙功能肽可 加入可涂敷到要被治療的創(chuàng)面上的例如霜、膏、凝膠等制劑中。
[0113] 根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，雙功能肽優(yōu)選地以基本上在約10 μ g/ml到lmg/ml之間的濃 度被使用。在用濃度達(dá)到lmg/ml的肽處理過(guò)的真皮成纖維細(xì)胞上確實(shí)沒(méi)有觀察到本發(fā)明 的肽的毒性。另外，用以通過(guò)SAM(微陣列顯著性分析）統(tǒng)計(jì)法尋找毒性基因而進(jìn)行的研究 已經(jīng)顯示只有高濃度的雙功能肽（大于lmg/ml)可引發(fā)細(xì)胞死亡、結(jié)膜組織（conjunctive tissue)的破壞和腫瘤入侵。
[0114] 還有更優(yōu)選地，在藥物和/或化妝品組合物中使用所述肽的推薦濃度是基本上等 于 100 μ g/ml。
[0115] 本發(fā)明進(jìn)一步的特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)通過(guò)閱讀以下實(shí)施例是清楚的，給出的實(shí)施例是說(shuō)明 性而非限制性的。
[0116] 實(shí)施例1 :雙功能肽對(duì)膠原蛋白合成的效果-蛋白分析
[0117] 從為年齡在35到75之間的健康患者實(shí)施外科手術(shù)期間獲得的腹部皮膚活組織標(biāo) 本中分離出真皮成纖維細(xì)胞。
[0118] 在移除表皮之后，成纖維細(xì)胞通過(guò)酶消化法回收，接著在37°C下在補(bǔ)充有10%胎 牛血清和1%青霉素/鏈霉素的DMEM(Dulbecco的改良Eagle培養(yǎng)基）培養(yǎng)基中培養(yǎng)。
[0119] 接著，用濃度為1〇〇μ g/ml、具有S1序列或該序列的各片段的肽處理成纖維細(xì)胞。 所測(cè)試的各種片段如下：
[0120] -肽l(p印tl):具有S1序列的肽
[0121] -膚 2 (pept2):序列 N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly) 3Arg-Val-Arg-Leu-〇H
[0122] -膚 3 (pept3) :N_ (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly) 3-〇H
[0123] -膚 4 (pept4) :N-Arg_Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-〇H
[0124] -膚 5 (pept5) :N-Gly-Ile_Leu-〇H
[0125] 接著，I型膠原蛋白和III型膠原蛋白的蛋白表達(dá)通過(guò)蛋白印跡法示出且通過(guò)過(guò) 氧系數(shù)（ImageJ)量化。結(jié)果分別示于所附的圖3A和3B。對(duì)照（Ctrl)對(duì)應(yīng)于未經(jīng)肽處理 的I型和III型膠原蛋白在細(xì)胞水平的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)以一式三份進(jìn)行。
[0126] 圖3A中可見(jiàn)的結(jié)果示出包括對(duì)應(yīng)于本發(fā)明肽部分A的Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly 序列的本發(fā)明的肽（peptl)以及片段（pept2和pept3)刺激I型膠原蛋白的蛋白表達(dá)增長(zhǎng) 30%。不包括本發(fā)明肽部分A的肽片段（pept4和p印t5)不刺激I型膠原蛋白的合成；相 比之下，當(dāng)成纖維細(xì)胞與pept4和pept5接觸時(shí)合成的膠原蛋白的比例看起來(lái)變小了。因 此，Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly序列確實(shí)是刺激I型膠原蛋白合成的原因。
[0127] 圖3B示出本發(fā)明具有S1序列的肽允許增加 III型膠原蛋白的合成；事實(shí)上，如在 柱狀圖中可看到的，當(dāng)成纖維細(xì)胞經(jīng)由具有S1序列的肽處理時(shí)，產(chǎn)生大于兩倍的III型膠 原蛋白。
[0128] 還令人關(guān)注的是，注意到與經(jīng)由僅具有（Val-Gly-Val-Ala-Pr〇-Gly)3序列 (pept3)的肽處理的成纖維細(xì)胞相比，具有S1序列（peptl)的肽對(duì)成纖維細(xì)胞的處理使 III型膠原蛋白的合成增長(zhǎng)36%。因此，本發(fā)明肽的其他部分也在III型膠原蛋白的合成 增長(zhǎng)中起作用。
[0129] 由此，本發(fā)明肽是特別令人關(guān)注的；除允許I型膠原蛋白的合成增長(zhǎng)以外，本發(fā)明 肽確實(shí)也促進(jìn)III型膠原蛋白的生成。
[0130] 實(shí)施例2 :雙功能肽對(duì)膠原蛋白合成的效果-基因表達(dá)分析
[0131] 在濃度為100 μ g/ml的不同肽（peptl至pept5)存在的情況下，測(cè)試了成纖維細(xì) 胞培養(yǎng)中I型和III型膠原蛋白的基因表達(dá)。
[0132] 在經(jīng)由不同肽處理24小時(shí)之后，使用RNeasy'?試劑盒（QIAGEN)將RNAs從培 養(yǎng)物中提取出來(lái)，接著使用來(lái)自SABiosciences?的RT2第一鏈試劑盒（RT2First Strand Kit)將RNAs再轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNAs (cDNAs)。
[0133] 接著，使用來(lái)自Stratagene公司的Mx3000p熱循環(huán)儀在96孔板中進(jìn)行實(shí)時(shí)PCR 分析。每個(gè)樣品重復(fù)分析三次。CDNAs在包含RT2 SYBR? Green/ROX? qPCR Master Mix 試劑（SABiosciences?)以及特定用于要擴(kuò)增的基因的正義和反義引物的反應(yīng)混合物中用 作基質(zhì)。在每一循環(huán)結(jié)束時(shí)讀出突光，且通過(guò)MxPro軟件（Stratagene)分析讀數(shù)。通過(guò)借 助"國(guó)內(nèi)（domestic)"基因（在這種情況下，編碼甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH)的基因 的RNA)擴(kuò)增而來(lái)的DNA的量使用于擴(kuò)增被研究基因的產(chǎn)品的量標(biāo)準(zhǔn)化，來(lái)獲得編碼I型和 III型膠原蛋白的有益C0L1A1和C0L3A1基因的相對(duì)表達(dá)。從對(duì)應(yīng)于100%有效的擴(kuò)增的 循環(huán)數(shù)起，使用2^^法（Livak&Schmittgen，2001)計(jì)算所研究的cDNAs的相對(duì)數(shù)量。
[0134] 圖4中的可見(jiàn)結(jié)果確認(rèn)了在蛋白表達(dá)研究中獲得的結(jié)果。包括 (Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly) 3序列的本發(fā)明雙功能肽以及肽片段p印t2和？印七3刺激I型 和III型膠原蛋白的基因表達(dá)。相對(duì)于用僅包含（％1-61 7，&141&-?1*〇-617) 3序列的肽3 存在的情況下處理的細(xì)胞，當(dāng)成纖維細(xì)胞由具有S1序列（p印tl)的肽處理時(shí)也觀察到III 型膠原蛋白的合成增長(zhǎng)。
[0135] 包含Gly-Ile-Leu序列的衍生物肽pept4和pept5對(duì)于編碼I型和III型膠原蛋 白的基因的表達(dá)沒(méi)有效果。
[0136] 對(duì)照（Ctrl)對(duì)應(yīng)于在成纖維細(xì)胞未經(jīng)處理時(shí)，編碼兩種類型膠原蛋白的基因的 表達(dá)。
[0137] 實(shí)施例3 :雙功能肽對(duì)膠原蛋白合成的效果-依據(jù)患者年齡的蛋白和基因表達(dá)測(cè) 試
[0138] 培養(yǎng)來(lái)自較年輕或較年長(zhǎng)的患者（35、42和53歲）的真皮成纖維細(xì)胞，并且針對(duì)I 型和III型膠原蛋白的蛋白和基因表達(dá)測(cè)試了本發(fā)明具有S1序列的肽。圖5可見(jiàn)所獲得 的針對(duì)兩種類型膠原蛋白的蛋白表達(dá)的結(jié)果?？梢?jiàn)，在成纖維細(xì)胞來(lái)自較年長(zhǎng)患者時(shí)，本發(fā) 明肽在膠原蛋白的合成上的作用是更大的。
[0139] 實(shí)施例4 :雙功能肽對(duì)尿激酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制
[0140] 評(píng)價(jià)了本發(fā)明雙功能肽對(duì)尿激酶（MMP-1蛋白酶的激活級(jí)聯(lián)的上游酶）的作用。
[0141] 在不同濃度的本發(fā)明肽存在以及不存的情況下測(cè)試了尿激酶對(duì)其合成底物 (D-Glu-Gly-Arg+NHPhN02 (S2444))的活性。
[0142] 結(jié)果示于所附的圖6A和6B中。
[0143] 尿激酶（9. 25*10_6mM)對(duì)底物S2444(0. 3nM)的水解動(dòng)力學(xué)測(cè)定在具有S1序列且 濃度在10'ΚΓ4和10,的雙功能肽存在下進(jìn)行1小時(shí)。對(duì)照對(duì)應(yīng)于不存在肽的情況下的 動(dòng)力學(xué)。通過(guò)在35分鐘內(nèi)每5分鐘測(cè)量405nm的吸收率（D0)來(lái)評(píng)價(jià)酶活性。結(jié)果示于圖 6A中。
[0144] 圖6B圖示在使用雙功能肽15分鐘時(shí)，尿激酶的活性和雙功能肽濃度之間的劑 /效關(guān)系。圖中虛線確定了 IC50,即降低尿激酶活性50%需要的肽濃度。IC50對(duì)應(yīng)于 0. 83*10_5M的肽，即質(zhì)量濃度為19 μ g/ml的肽。
[0145] 因此，可見(jiàn)，本發(fā)明的雙功能肽表現(xiàn)為尿激酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑。
[0146] 實(shí)施例5 :雙功能肽對(duì)MMP-1蛋白酶活性的效果
[0147] 接著評(píng)價(jià)了本發(fā)明雙功能肽直接作用在MMP-1活性上的效果，MMP-1是被尿激酶 激活的級(jí)聯(lián)的下游酶。
[0148] 在所述肽存在的情況下被用于測(cè)試MMP-1活性的MMP-1底物是合成底物：DNP-Pr o-Cha-Gly-Cys(Me)-His-Ala-Lys(N-Me-Abz) - NH2。
[0149] 在不存在雙功能肽或在雙功能肽以濃度為10'1(T4和1(T5M存在的情況下，濃度 為80ng/l·! 1的MMP-1被引入0.4ng/l·! 1的合成底物中達(dá)1小時(shí)。結(jié)果在圖7A和7B中顯 /_J、1 〇
[0150] 更具體地，圖7A代表在不同濃度的肽存在或不存在（對(duì)照）的情況下，MMP-1的 合成底物的水解動(dòng)力學(xué)。通過(guò)在35分鐘內(nèi)每5分鐘測(cè)量465nm吸收率（D0)來(lái)評(píng)價(jià)MMP-1 的酶活性。
[0151] 圖7B圖示在使用雙功能肽15分鐘時(shí)，MMP-1的活性和雙功能肽的濃度之間的劑 量-效果關(guān)系。圖中虛線確定IC50,其在這里對(duì)應(yīng)于0. 4*1(Γ4Μ，即雙功能肽的濃度等于 91 μ g/ml〇
[0152] 還在MMP-1的天然底物（即，人體皮膚的膠原纖維）存在的情況下測(cè)試了本發(fā)明 肽對(duì)MMP-1活性的效果。
[0153] 為此，MMP-1此前已被濃度為20mM的APMA(4-氨基苯汞乙酸）在37°C激活1小時(shí) 30分。接著，由此激活的MMP-1在本發(fā)明的肽存在（100 μ g/ml)或不存在的情況下沉積在 厚度為5 μ的皮膚切口（cuts of skin)上。3小時(shí)之后，皮膚切口被免疫標(biāo)記，用以揭露I 型和III型膠原蛋白的存在，接著通過(guò)共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果（未示出）顯示在未經(jīng)所 述肽處理的切口層面上未觀察到膠原蛋白I和III，說(shuō)明膠原蛋白I和III完全被MMP-1降 解。另一方面，在雙功能肽存在的情況下，MMP-1的作用被抑制；確實(shí)檢測(cè)到膠原蛋白I和 III。
[0154] 本發(fā)明的雙功能肽通過(guò)原位抑制MMP-1活性來(lái)抑制膠原蛋白的降解。
[0155] 實(shí)施例6 :雙功能肽被尿激酶裂解
[0156] 在細(xì)胞外周層面觀察到約1(Γ4Μ的過(guò)量尿激酶。由此，所述肽可能被尿激酶裂解， 尿激酶具體在本發(fā)明肽的部分Β的精氨酸殘基（Arg)處作用。
[0157] 通過(guò)高效液相色譜法（HPLC)在 Chromolith Jupiter C18 柱（50x4. 6mm)上進(jìn)行了 研究，并且在100分鐘內(nèi)在0. 1 % TFA水溶液中以線性梯度從0到100%施加的0. 1 % TFA 乙腈溶液。結(jié)果顯示圖譜峰值出現(xiàn)在11. 75分鐘，這是雙功能肽的特征（圖8A)。然而，在 過(guò)量尿激酶作用在雙功能肽（〇.45mM)上之后，圖譜峰值是不同的；事實(shí)上，新的洗脫峰值 在20分鐘，由此表征雙功能肽被尿激酶裂解（圖8B)。
[0158] 由此，在皮膚老化條件下，在大量尿激酶存在時(shí)，本發(fā)明雙功能肽被裂解，由此釋 放包括Gly-Ile-Leu序列的所述肽的C端。
[0159] 實(shí)施例7 :Gly_Ile_Leu序列對(duì)MMP-1活性的效果
[0160] 發(fā)明人選擇Gly-Ile-Leu序列是因?yàn)槠淠軌蛘紦?jù)I型膠原蛋白酶（MMP-1)的P' 1、 P'2和P'3袋。在具有Gly-Ile-Leu序列的肽5不存在或以濃度為1(Γ5、1(Γ4和1(Γ 3Μ存在 的情況下，在合成底物（DNP-Pro-Cha-Gly-Cys (Me) -His-Ala-Lys (N-Me-Abz) -ΝΗ2)上測(cè)試 了 MMP-1的活性。
[0161] 結(jié)果（未示出）表明肽5以取決于劑量的方式降低MMP-1對(duì)其合成底物的活性。 測(cè)量了 Gly-Ile-Leu 肽的 IC50 ;為 0· 71*10_4M，g卩，濃度為 21. 3μ g/ml 的肽。
[0162] 由此，本發(fā)明雙功能肽的端部C(Gly-Ile-Leu)能在過(guò)量尿激酶發(fā)生時(shí)生成并且 導(dǎo)致對(duì)MMP-1的活性的抑制。這些數(shù)據(jù)確認(rèn)了所述肽在對(duì)抗皮膚老化和/或治愈慢性傷口 方面的重要性。
[0163] 還在更綜合性研究的模型上進(jìn)行了研究：取自體外（ex vivo)的皮膚模型能模仿 皮膚老化和一些相關(guān)病理學(xué)。獲得的結(jié)果未示出，但其確認(rèn)了在上述體外結(jié)果。
[0164] 當(dāng)然，本發(fā)明不限于以上示出和描述的實(shí)施例，所述實(shí)施例可以在不脫離本發(fā)明 范圍的條件下具有各種變形和修改。
[0165] 參考f獻(xiàn)
[0166] -Alix, A. J. A turning point in the knowledge of the structure-function-activity relations of elastin. J Soc Biol2001 ； 195(2) :181-93
[0167] -Barone,E.J.,et al.， Interleukin-lalpha and collagenase activity are elevated in chronic wounds. Plast Reconstr. Surg, 1998102(4):p. 1023-7 ； discussion1028-9.
[0168] -Ferguson, M. W. and S. 0' Kane，Scar-free healing: from 10embryonic mechanisms to adult therapeutic intervention. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci，2004359(1445) :p. 839-50.
[0169] -Fisher, G. J. , et al. , Collagen fragmentation promotes oxidative stress and elevates matrix metalloproteinase-1 in fibroblasts in aged human skin. Am J Pathol，2009174(1) :p. 101-14.
[0170] -Floquet, N. , Hery-Huynh, S. , Dauchez, M. , Derreumaux, P. , Tamburro, A. M.,
[0171] Alix, A. J. Structural characterization of VGVAPG, an elastin-derived peptide. Biopolymers, 2004 ；76 (3):266-80. Review
[0172] -Herbage, D. Collagenes et proteoglycannes du derme:donnees actuelles, in Biologie de la peau. 1997
[0173] -Hornebeck, W. , Intlannn-age et cascades proteolytiques. Medecine et longevite. Vol. 1. 2009:Elsevier Masson. 38-43
[0174] -Livak, K. J. and T. D. Schmittgen，Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the2 (-Delta Delta C(T))Method. Methods, 200125(4) :p. 402-8.
[0175] -Lorena, D. , et al. , Normal scarring: importance of myofibroblasts. Wound Repair Regen，200210(2) :p. 86-92.
[0176] -Melissopoulos A. , L. C. , La peau. Medicales et internationales ed. 1998.
[0177] -Shi,B. , et al., Effect of vacuum assisted closure on collagenase activity in human chronic wound.Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi, 200622(6) :p. 465-7.
[0178] -Voorhees, J. J. , et al, Collagen degradation in aged/photodamaged skin in vivo and after exposure to matrix metalloproteinase-1 in vitro. J Invest Dermatol，2003 ; 120 (5):p. 842-8
[0179] -Weckroth,M.,et al. , Epithelial tissue-type plasminogen activator expression,unlike that of urokinase, its receptor,and plasminogen activator inhibitor-1，isincreased in chronic venous ulcers.Br J Dermatol, 2004151(6) :p. 1189-96
【權(quán)利要求】
1. 一種雙功能肽，所述雙功能肽能夠激活膠原蛋白的合成并且抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的 生成，其中，所述雙功能肽具有一序列，所述序列具有三個(gè)肽部分A、B和C : -第一肽部分A，對(duì)應(yīng)于重復(fù)至少三次的六肽，所述部分A能夠結(jié)合到彈性蛋白結(jié)合受 體蛋白以刺激膠原蛋白合成， -第二肽部分B，對(duì)應(yīng)于能夠用作尿激酶蛋白酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑并且被所述蛋白酶裂 解的四肽，以及 -第三肽部分C，對(duì)應(yīng)于占據(jù)基質(zhì)金屬蛋白酶的至少一個(gè)活性位點(diǎn)的三肽，從而抑制所 述蛋白酶。
2. 如權(quán)利要求1所述的雙功能肽，其中，刺激膠原蛋白合成的所述第一肽部分A具有 Xl-Gly-X2-X3-Pr〇-Gly序列，該序列重復(fù)至少三次，其中： -XI對(duì)應(yīng)于任何氨基酸， -X2對(duì)應(yīng)于選自Val、Thr、Gin、Ala和Leu的氨基酸， -X3對(duì)應(yīng)于選自Ala、Leu和lie的氨基酸。
3. 如權(quán)利要求2所述的雙功能肽，其中，所述肽的所述第一肽部分A具有 Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly 序列。
4. 如權(quán)利要求1-3中任一項(xiàng)所述的雙功能肽，其中，可被蛋白酶裂解的所述第二肽部 分B具有Arg-Yl-Arg-Y2序列，其中，Y1和Y2中的每一個(gè)對(duì)應(yīng)于選自Ser、Tyr、Gly、Ala、 Arg、Val和Leu的氨基酸。
5. 如權(quán)利要求4所述的雙功能肽，其中，所述肽的所述第二肽部分B具有 Arg-Val-Arg-Leu 序列。
6. 如權(quán)利要求1-5中任一項(xiàng)所述的雙功能肽，其中，抑制基質(zhì)金屬蛋白酶的所述第三 部分C具有Zl-Ile-Z2序列，其中： -Z1對(duì)應(yīng)于選自Gly、lie和Leu的氨基酸，并且 -Z2對(duì)應(yīng)于選自Leu、Phe、Ala、lie和Val的氨基酸。
7. 如權(quán)利要求6所述的雙功能肽，其中，所述肽的所述第三肽部分C具有Gly-Ile-Leu 序列。
8. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的雙功能肽，其中，所述雙功能肽具有如下的S1序列， 所述S1序列對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID No. 1 : SI：N-(Val-Gly-Val-Ala-Pro-Gly)n-Arg-Val-Arg-Leu-Gly-Ile-Leu-〇H, 其中，N和OH分別對(duì)應(yīng)于所述肽的N-末端和C-末端，并且 其中，η = 3。
9. 如權(quán)利要求1-7中任一項(xiàng)所述的雙功能肽，其中，所述雙功能肽對(duì)應(yīng)于序列SEQ ID No. 2 至 SEQ ID No. 26 中的一個(gè)。
10. 如權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的雙功能肽，其中，通過(guò)化學(xué)合成獲得所述雙功能 肽。
11. 如權(quán)利要求1-10中任一項(xiàng)所述的雙功能肽，其中，所述雙功能肽以凍干形式保存。
12. 如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的雙功能肽，其用于慢性疤痕疾病的治療。
13. 如權(quán)利要求12所述的雙功能肽，其用于壓瘡或潰瘍的治療。
14. 如權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的雙功能肽，其用于真皮組織的修復(fù)和/或再生。
15. 如權(quán)利要求14所述的雙功能肽，其用于皮膚老化的治療。
16. -種化妝品和/或藥物組合物，包括根據(jù)權(quán)利要求1-11中任一項(xiàng)所述的雙功能肽。
17. 如權(quán)利要求16所述的化妝品和/或藥物組合物，其中，所述雙功能肽的濃度在 10 μ g/mL和lmg/mL之間變化，并且優(yōu)選地基本上等于100 μ g/mL。
【文檔編號(hào)】A61K38/55GK104159599SQ201380012956
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2013年1月31日 優(yōu)先權(quán)日:2012年2月1日
【發(fā)明者】威廉·霍恩貝克, 瓊·阿蒂亞, 桑德里納·洛里默, 弗蘭克·安東尼斯利 申請(qǐng)人:瑞吉恩提斯國(guó)際貿(mào)易有限公司, 蘭斯大學(xué), 國(guó)家科學(xué)研究中心