一種從短小芽孢桿菌e14中分離抗菌蛋白質(zhì)的方法
【專利摘要】本發(fā)明是一種從短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的方法，該方法通過發(fā)酵生產(chǎn)制得發(fā)酵菌液；離心制得上清液；然后用硫酸銨沉淀，所得沉淀用緩沖液重懸，得重懸液；通過離子交換法分離，收集洗脫峰、濃縮、透析，得活性成分分離峰。再通過抗菌活性檢測和蛋白質(zhì)電泳檢測，測得短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的分子量在在97.2-116.0kD之間。本發(fā)明方法設(shè)計簡單合理，操作方便，通過本發(fā)明方法可以分離得到具有抗哈維氏弧菌（Vibrioharveyi）效果的蛋白質(zhì)。
【專利說明】一種從短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種抗菌蛋白質(zhì)的制備方法，特別是一種從短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]近三十年來，我國漁業(yè)取得了長足發(fā)展，水產(chǎn)品產(chǎn)量連續(xù)十多年居世界首位，是世界上唯——個養(yǎng)殖產(chǎn)量超過捕撈產(chǎn)量的國家，水產(chǎn)品出口也已占農(nóng)產(chǎn)品出口凈收入的50%以上。漁業(yè)已經(jīng)成為我國大農(nóng)業(yè)中發(fā)展最快的產(chǎn)業(yè)之一，在促進農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整、增加農(nóng)民收入、保障食物安全、優(yōu)化國民膳食結(jié)構(gòu)以及維護國家海洋權(quán)益等方面做出了重要貢獻。然而隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，病害發(fā)生的頻率越來越高、造成的損失也越來越大。
[0003]引起海水養(yǎng)殖病害的微生物主要有病毒、細菌和真菌，在細菌當(dāng)中，弧菌是引起海水養(yǎng)殖品種中細菌性疾病的最重要的病原菌之一，流行面積廣并且發(fā)病率高，給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的危害，弧菌已成為水產(chǎn)領(lǐng)域長期以來的一大研究熱點。
[0004]目前防治此類病害大多使用抗生素和化學(xué)合成藥物，其對產(chǎn)品質(zhì)量的影響顯而易見，因此研究開發(fā)抗生素的替代品就顯得十分迫切和重要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種方法設(shè)計合理、可操作性強、分離的產(chǎn)物純度高的從短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的方法。
[0006]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實現(xiàn)的。本發(fā)明是一種從短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的方法，其特點是，其步驟如下:
(1)發(fā)酵生產(chǎn):取培養(yǎng)過夜的短小芽孢桿菌E14{Bacillus pumilus)將短小芽孢桿菌E14種子菌液接種于2216E液體培養(yǎng)基中，接種量為5%，180rpm，28°C培養(yǎng)24h ;得發(fā)酵菌液；
(2)上清液制備:發(fā)酵菌液1200rpm，4°C離心30min，上清液再次離心，重復(fù)2_3次；得上清液；
(3)硫酸銨沉淀:將硫酸銨烘干磨細，依據(jù)飽和硫酸銨溶液配制表，分別稱取不同等份，冰上邊攪拌邊加入上清液中，獲得質(zhì)量體積百分比為40%的硫酸銨溶液，然后冰上靜置20min,4°C,8000rpm離心5 min ;取上清,繼續(xù)冰上邊攪拌邊加入硫酸銨,至質(zhì)量體積百分比為80%的硫酸銨溶液，冰上靜置20 min, 4°C，8000rpm離心30 min,沉淀用緩沖液重懸，重懸體積為沉淀前上清液的1/10，得重懸液；緩沖液為50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，含150 mmoLNaCl，50 mmoL EDTA ；
(4)離子交換法分離:米用DEAESepharose Fast Flow即DEAE FF分離； 裝柱:根據(jù)柱子大小，取適量的DEAE FF，加入適量的buffer A即50 mmoL Tris-HClpH 8.0，用玻璃棒輕輕攪拌，將其引流到層析柱中；平衡柱子:在Biologic Duoflow FPLC蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)上操作,buffer A平衡10倍柱體積，流速1.0 mL/min ；
上樣與洗脫:在Biologic Duoflow FPLC蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)中設(shè)置程序，完全自動進行，全程流速1.0 mL/min,當(dāng)A28tl大于0.05時開始收集，每管收集1.5 mL,程序如下:V為柱體積:
①buffer A再平衡5XV ;
②重懸液上樣80mL ；
③buffer A 平衡 5XV ;
④buffer B 即 50 mmoL Tris-HCl pH 8.0,0.8 mol/L NaCl，由 O % - 100 % 梯度洗脫 IOXV ；
⑤buffer B 洗脫 5XV ;
⑥buffer A 洗脫 5XV ;
(5)收集、濃縮、透析:將洗脫峰收集，同一峰的各試管合并，-70°C冰箱預(yù)冷過夜，用LG-5冷凍干燥機濃縮；凍干樣品用適量buffer C溶解，移至截留分子量為30 kD的透析袋中，并用buffer C透析6 h,中間換透析液一次,得活性成分分離峰；buffer C為50 mMTris-HCl ρΗ8.0，含 50 mmol NaCl,0.5 mmol EDTA ；
(6)抗菌活性檢測:抑菌活性檢測采用濾紙片抑菌圈法:將過夜培養(yǎng)的病原菌-哈維氏弧菌(harveyi) 3 μ L均勻涂抹于2216Ε固體培養(yǎng)基平板上，待培養(yǎng)基表面稍干后，將直徑為6 _的無菌濾紙片放置于培養(yǎng)皿中，然后吸取50 UL活性成分分離峰分次滴加于濾紙片上，28°C培養(yǎng)，16 h后觀察抑菌圈，測量抑菌圈大??；
(7)蛋白質(zhì)電泳檢測；對具有抗菌活性的活性成分分離峰進行SDS-PAGE電泳檢測，按常規(guī)SDS-PAGA技術(shù)規(guī)程操作，測得短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的分子量在在97.2-116.0 kD 之間。
[0007]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法設(shè)計簡單合理，操作方便，通過本發(fā)明方法可以分離得到具有抗哈維氏弧菌(K/Ario harveyi)效果的蛋白質(zhì)。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1為短小芽孢桿菌E14活性成分化學(xué)屬性及其在在細胞中位置的確定圖；其中:I為短小芽孢桿菌E14菌液，2為上清液，3為沉淀，4為水煮處理，5為蛋白酶K處理，6為2216E ；
圖2為不同硫酸銨濃度沉淀的活性成分圖；其中:圖中數(shù)字為沉淀活性成分時的硫酸銨濃度，Ck1為透析緩沖液；ck2為80%硫酸銨；
圖3為短小芽孢桿菌E14活性成分DEAE FF分離圖譜；
圖4為短小芽孢桿菌E14活性成分DEAE FF分離峰抑菌活性圖；其中:I為透析前，2為透析后，Ck1為透析液；ck2為無菌水；
圖5為短小芽孢桿菌E14活性成分DEAE FF分離峰蛋白電泳結(jié)果圖；其中:1為透析前，2為透析后，Ck1為透析液；ck2為無菌水。
【具體實施方式】[0009]以下參照附圖進一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便本領(lǐng)域技術(shù)人員進一步的理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對本發(fā)明權(quán)利要求的限制。
[0010]實施例1，一種從短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的方法，其步驟如下:
(1)發(fā)酵生產(chǎn):取培養(yǎng)過夜的短小芽孢桿菌E14{Bacillus pumilus)將短小芽孢桿菌E14種子菌液接種于2216E液體培養(yǎng)基中，接種量為5%，180rpm，28°C培養(yǎng)24h ;得發(fā)酵菌液；
(2)上清液制備:發(fā)酵菌液1200rpm，4°C離心30min，上清液再次離心，重復(fù)2_3次；得上清液；
(3)硫酸銨沉淀:將硫酸銨烘干磨細，依據(jù)飽和硫酸銨溶液配制表，分別稱取不同等份，冰上邊攪拌邊加入上清液中，獲得質(zhì)量體積百分比為40%的硫酸銨溶液，然后冰上靜置20min,4°C,8000rpm離心5 min ;取上清,繼續(xù)冰上邊攪拌邊加入硫酸銨,至質(zhì)量體積百分比為80%的硫酸銨溶液，冰上靜置20 min, 4°C，8000rpm離心30 min,沉淀用緩沖液重懸，重懸體積為沉淀前上清液的1/10，得重懸液；緩沖液為50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，含150 mmoLNaCl，50 mmoL EDTA ；
(4)離子交換法分離:米用DEAESepharose Fast Flow即DEAE FF分離；
裝柱:根據(jù)柱子大小，取適量的DEAE FF，加入適量的buffer A即50 mmoL Tris-HClpH 8.0，用玻璃棒輕輕攪拌，將其引流到層析柱中；
平衡柱子:在Biologic Duoflow FPLC蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)上操作,buffer A平衡10倍柱體積，流速1.0 mL/min ；
上樣與洗脫:在Biologic Duoflow FPLC蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)中設(shè)置程序，完全自動進行，全程流速1.0 mL/min,當(dāng)A28t`l大于0.05時開始收集，每管收集1.5 mL,程序如下:V為柱體積:
①buffer A再平衡5XV ;
②重懸液上樣80mL ；
③buffer A 平衡 5XV ;
④buffer B 即 50 mmoL Tris-HCl pH 8.0,0.8 mol/L NaCl，由 O % - 100 % 梯度洗脫 10XV ；
⑤buffer B 洗脫 5XV ;
⑥buffer A 洗脫 5XV ;
(5)收集、濃縮、透析:將洗脫峰收集，同一峰的各試管合并，-70°C冰箱預(yù)冷過夜，用LG-5冷凍干燥機濃縮；凍干樣品用適量buffer C溶解，移至截留分子量為30 kD的透析袋中，并用buffer C透析6 h,中間換透析液一次,得活性成分分離峰；buffer C為50 mMTris-HCl ρΗ8.0，含 50 mmol NaCl,0.5 mmol EDTA ；
(6)抗菌活性檢測:抑菌活性檢測采用濾紙片抑菌圈法:將過夜培養(yǎng)的病原菌哈維氏弧菌3 μ L均勻涂抹于2216Ε固體培養(yǎng)基平板上,待培養(yǎng)基表面稍干后,將直徑為6 mm的無菌濾紙片放置于培養(yǎng)皿中，然后吸取50 μ L活性成分分離峰分次滴加于濾紙片上，28°C培養(yǎng)，16 h后觀察抑菌圈，測量抑菌圈大小；
(7)蛋白質(zhì)電泳檢測；對具有抗菌活性的活性成分分離峰進行SDS-PAGE電泳檢測，按常規(guī)SDS-PAGA技術(shù)規(guī)程操作，測得短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的分子量在在97.2-116.0 kD 之間。
[0011]實施例2，參照圖1 一 5，從短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的方法實驗:
1.實驗方法
1.1短小芽孢桿菌E14拮抗活性的檢測
短小芽孢桿菌E14，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC保存，保存號 CGMCC N0.6682。
[0012]本研究采用濾紙片抑菌圈法。將短小芽孢桿菌E14接種于2216E液體培養(yǎng)基中，28°C培養(yǎng)20 h，吸取0.1 mL培養(yǎng)液均勻涂抹于2216E固體培養(yǎng)基平板上，待培養(yǎng)基表面稍干后，將直徑為6 _的無菌濾紙片放置于培養(yǎng)皿中，然后吸取50 UL待測拮抗菌分次滴加于濾紙片上，28°C培養(yǎng)，16 h后觀察抑菌圈、測量抑菌圈大小。 [0013]1.2短小芽孢桿菌E14活性物質(zhì)在細胞中位置的確定
取培養(yǎng)過夜的液體短小芽孢桿菌E14 I mL菌液，于12000 rpm離心30 min，留上清備用。沉淀用等體積2216E重懸、超聲破碎，然后取過夜發(fā)酵菌液、發(fā)酵菌液上清液及沉淀重懸液各50 μ L進行抑菌活性檢測。
[0014]1.3短小芽孢桿菌Ε14活性物質(zhì)屬性的判斷
處理1，取過夜發(fā)酵菌液約200μ?，95?水煮10 min;處理2，取過夜發(fā)酵菌液約200 μ L，按終濃度0.1 mg/mL添加蛋白酶K，55°C水浴4 h。分別將處理1、處理2及過夜發(fā)酵菌液50 μ L進行抑菌活性檢測。
[0015]1.4短小芽孢桿菌Ε14活性物質(zhì)的分離純化
根據(jù)前述研究結(jié)果，視活性成分的化學(xué)屬性和在細胞中的位置，分別選用不同的分離純化方法，本實驗以胞外蛋白質(zhì)類活性成分的分離純化為例說明研究方法。
[0016]1.4.1 短小芽孢桿菌Ε14活性成分的粗分離一硫酸銨分級沉淀法
(1)短小芽孢桿菌Ε14發(fā)酵液上清液的制備:將過夜培養(yǎng)的發(fā)酵液在12000rpm，4°C離心30 min,取上清,再離心,至不再有沉淀為止；
(2)短小芽孢桿菌E14活性成分的小量制備:首先配制硫酸銨飽和溶液，通過調(diào)整發(fā)酵液上清液與飽和硫酸銨的比例(冰上操作)，分別制備20%，40%, 60%和80%硫酸銨的沉淀物，依次檢測各濃度下沉淀物的抑菌活性，獲得不同拮抗菌活性成分可選用的最適硫酸銨濃度；
(3)短小芽孢桿菌E14活性成分的大量制備:以步驟(2)中獲得的最適硫酸銨濃度為依據(jù)，稱取適量固體硫酸銨(注意用前烘干磨細)，冰上邊攪拌邊加入發(fā)酵液上清液中，然后靜置 20 min,沉淀用少量緩沖液(50 mmol Tris-HCl pH 8.0,含 150 mmol NaCl, 50 mmolEDTA)重懸，部分用于檢測抑菌活性，部分用于后續(xù)實驗。
[0017]1.4.2 短小芽孢桿菌E14活性成分的細分級分離一離子交換法 米用 DEAE Sepharose Fast Flow(以下簡稱 DEAE FF)分離。
[0018](I)裝柱:根據(jù)柱子大小，取適量的DEAE FF，加入適量的buffer A (50 mmoLTris-HCl pH 8.0)，用玻璃棒輕輕攪拌，將其引流到層析柱中；
(2)平衡柱子:在BiologicDuoflow FPLC蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)上操作，buffer A平衡10倍柱體積，流速1.0 mL/min ；
(3)上樣與洗脫:在BiologicDuoflow FPLC蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)中設(shè)置程序，完全自動進行，全程流速1.0 mL/min，當(dāng)A28tl大于0.05時開始收集，每管收集1.5 mL，程序如下(下文V為柱體積):
①buffer A再平衡5XV ;
②上樣80mL，可根據(jù)樣品體積調(diào)整；
③buffer A 平衡 5XV ;
④buffer B (50 mmoL Tris-HCl pH 8.0,0.8 mol/L NaCl)由 O % - 100 % 梯度洗脫 IOXV ；
⑤buffer B 洗脫 5XV ;
⑥buffer A 洗脫 5XV ;
(4)收集、濃縮、透析和保存。將洗脫峰收集，同一峰的各試管合并，-70 °C冰箱預(yù)冷過夜，用LG-5冷凍干燥機濃縮。凍干樣品用少量buffer C (50 mM Tris-Cl pH8.0，含50 mMNaCl, 0.5 mM EDTA)溶解，移至截留分子量為30 kD的透析袋中，并用buffer C透析6 h，中間換透析液一次，透析后的樣品用于抗菌活性實驗或應(yīng)用。
[0019]1.5短小芽孢桿菌E14活性成分分子量測定 常規(guī)SDS-PAGE電泳檢測。
[0020]2.實驗結(jié)果
3.1短小芽孢桿菌E14活性成分化學(xué)屬性及其在在細胞中位置的確定 按方法2.1-2.3操作，結(jié)果如圖1。
[0021]95°C加熱和蛋白酶K處理均可使拮抗菌喪失活性，表明該活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)類；沉淀重懸液無抑菌活性以及上清液具有抑菌活性，說明抑菌活性成分被分泌在細胞外。
[0022]2.2短小芽孢桿菌E14活性物質(zhì)的粗分離
按方法2.4.1操作，不同硫酸銨濃度沉淀的活性成分，其抑菌活性如圖2。
[0023]由圖2看出，濃度為60%和80%的硫酸銨溶液均可析出具有抑菌活性的活性成分，其中80%硫酸銨抑菌活性更強。因此后續(xù)實驗大量制備活性成分時選用80%的硫酸銨濃度。
[0024]2.3短小芽孢桿菌E14活性物質(zhì)的純化
按方法2.4.2操作，梯度洗脫峰比較單一，如圖3。收集分離峰，經(jīng)抑菌活性檢測(圖4)，證明該峰就是目標(biāo)物即拮抗物質(zhì)。
[0025]2.4短小芽孢桿菌E14活性成分分子量測定
按常規(guī)SDS-PAGA技術(shù)規(guī)程操作，經(jīng)離子交換層析分離的目標(biāo)峰，電泳結(jié)果如圖5(透析后濃度比較小，未顯示電泳條帶)?？梢姸绦⊙挎邨U菌E14的拮抗物質(zhì)分子量在在97.2-116.0 kD 之間。
【權(quán)利要求】
1.一種從短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的方法，其特征在于，其步驟如下: (1)發(fā)酵生產(chǎn):取培養(yǎng)過夜的短小芽孢桿菌E14{Bacillus pumilus)將短小芽孢桿菌E14種子菌液接種于2216E液體培養(yǎng)基中，接種量為5%，180rpm，28°C培養(yǎng)24h ;得發(fā)酵菌液； (2)上清液制備:發(fā)酵菌液1200rpm，4°C離心30min，上清液再次離心，重復(fù)2_3次；得上清液； (3)硫酸銨沉淀:將硫酸銨烘干磨細，依據(jù)飽和硫酸銨溶液配制表，分別稱取不同等份，冰上邊攪拌邊加入上清液中，獲得質(zhì)量體積百分比為40%的硫酸銨溶液，然后冰上靜置20min,4°C,8000rpm離心5 min ;取上清,繼續(xù)冰上邊攪拌邊加入硫酸銨,至質(zhì)量體積百分比為80%的硫酸銨溶液，冰上靜置20 min, 4°C，8000rpm離心30 min,沉淀用緩沖液重懸，重懸體積為沉淀前上清液的1/10，得重懸液；緩沖液為50 mmoL Tris-HCl pH 8.0，含150 mmoLNaCl，50 mmoL EDTA ； (4)離子交換法分離:米用DEAESepharose Fast Flow即DEAE FF分離； 裝柱:根據(jù)柱子大小，取適量的DEAE FF，加入適量的buffer A即50 mmoL Tris-HClpH 8.0，用玻璃棒輕輕攪拌，將其引流到層析柱中； 平衡柱子:在Biologic Duoflow FPLC蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)上操作,buffer A平衡10倍柱體積，流速1.0 mL/min ； 上樣與洗脫:在Biologic Duoflow FPLC蛋白質(zhì)層析系統(tǒng)中設(shè)置程序，完全自動進行，全程流速1.0 mL/min,當(dāng)A28tl大于0.05時開始收集，每管收集1.5 mL,程序如下:V為柱體積: buffer A 再平衡 5XV ； 重懸液上樣80 mL ； buffer A 平衡 5XV ；
buffer B 即 50 mmoL Tris-HCl pH 8.0,0.8 mol/L NaCl，由 O % - 100 % 梯度洗脫10XV ； buffer B 洗脫 5XV ； buffer A 洗脫 5XV ； (5)收集、濃縮、透析:將洗脫峰收集，同一峰的各試管合并，-70°C冰箱預(yù)冷過夜，用LG-5冷凍干燥機濃縮；凍干樣品用適量buffer C溶解，移至截留分子量為30 kD的透析袋中，并用buffer C透析6 h,中間換透析液一次,得活性成分分離峰；buffer C為50 mmolTris-Cl ρΗ8.0，含 50 mmol NaCl,0.5 mmol EDTA ； (6)抗菌活性檢測:抑菌活性檢測采用濾紙片抑菌圈法:將過夜培養(yǎng)的病原菌哈維氏弧菌(Vibrio harveyi ) 3 μ L均勻涂抹于2216Ε固體培養(yǎng)基平板上，待培養(yǎng)基表面稍干后，將直徑為6 _的無菌濾紙片放置于培養(yǎng)皿中，然后吸取50 μ L活性成分分離峰分次滴加于濾紙片上，28°C培養(yǎng)，16 h后觀察抑菌圈，測量抑菌圈大小； (7)蛋白質(zhì)電泳檢測；對具有抗菌活性的活性成分分離峰進行SDS-PAGE電泳檢測，按常規(guī)SDS-PAGA技術(shù)規(guī)程操作，測得短小芽孢桿菌E14中分離抗菌蛋白質(zhì)的分子量在在97.2-116.0 kD 之間。
【文檔編號】A61P31/04GK103725735SQ201310741896
【公開日】2014年4月16日 申請日期:2013年12月30日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月30日
【發(fā)明者】安賢惠, 李聯(lián)泰, 閻斌倫, 朱明
申請人:淮海工學(xué)院