膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法及應(yīng)用。本發(fā)明為將BMSCs胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，取單細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，加入L-DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)即得膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。本發(fā)明克服了宮腔鏡手術(shù)機(jī)械性分離宮腔粘連，術(shù)后放置宮內(nèi)節(jié)育器或防粘連材料，于術(shù)后給予雌激素促進(jìn)內(nèi)膜生長所帶給子宮內(nèi)膜嚴(yán)重?fù)p傷，無法解決內(nèi)膜疤痕問題，不能實(shí)現(xiàn)內(nèi)膜功能性修復(fù)，且極易發(fā)再次粘連等缺陷。本發(fā)明BMSCs作為治療嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷的活性成分，獲取方便，分泌生長因子改善局部微環(huán)境及免疫調(diào)節(jié)，良好的生物相容性、可降解性及安全性，促進(jìn)疤痕子宮內(nèi)膜修復(fù)，增加內(nèi)膜厚度及局部血管密度。
【專利說明】膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于婦產(chǎn)科學(xué)領(lǐng)域，涉及膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]子宮內(nèi)膜嚴(yán)重?fù)p傷時(shí)內(nèi)膜功能性修復(fù)障礙，代之以結(jié)締組織增生修復(fù)，子宮前后壁發(fā)生纖維化，瘢痕形成，臨床上主要表現(xiàn)為宮腔粘連、閉經(jīng)及子宮性不孕等，目前尚無有效治療方法。
[0003]在本發(fā)明之前，對(duì)于嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷的治療方法如下:
[0004]1、臨床上通用方法是宮腔鏡手術(shù)機(jī)械性分離宮腔粘連，術(shù)后放置宮內(nèi)節(jié)育器或防粘連材料(主要是透明質(zhì)酸、Intercoat gel)等，并于術(shù)后給予雌激素促進(jìn)內(nèi)膜生長。但對(duì)子宮內(nèi)膜嚴(yán)重?fù)p傷，無法解決內(nèi)膜疤痕問題，不能實(shí)現(xiàn)內(nèi)膜功能性修復(fù)，且極易發(fā)再次粘連。
[0005]2、最近有小樣本研究報(bào)道，宮腔粘連分離后用人新鮮羊膜覆蓋創(chuàng)面，該法不能誘導(dǎo)疤痕內(nèi)膜自身功能性修復(fù)，且羊膜還存在免疫炎癥和誘發(fā)感染等風(fēng)險(xiǎn)。
[0006]3、子宮腔灌注粒細(xì)胞集落刺激因子，據(jù)報(bào)道可使部分內(nèi)膜薄的患者內(nèi)膜厚度增加，但此法不能保留粒細(xì)胞集落刺激因子在局部，作用時(shí)間短，局部療效差，也無法達(dá)到促進(jìn)疤痕內(nèi)膜生長的效果。
[0007]4、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells BMSCs)在刮宮術(shù)后將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞均勻地注射到子宮腔內(nèi)，術(shù)后給予激素替代治療，能增加患者子宮內(nèi)膜厚度。但BMSCs局部注射后很難在損傷局部定位，影響療效。
[0008]膠原是細(xì)胞外基質(zhì)的主要成分，其具有來源廣泛、生物相容性良好、可降解、制備工藝簡單等優(yōu)點(diǎn)，膠原支架(圖1)已經(jīng)CFDA批準(zhǔn)應(yīng)用于臨床皮膚及口腔黏膜修復(fù)中。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明的目的就在于克服上述缺陷，提供膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在治療嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷中的應(yīng)用。
[0010]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0011]膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法，其主要技術(shù)特征在于將BMSCs與膠原支架復(fù)合培養(yǎng)；所述復(fù)合培養(yǎng)步驟包括:
[0012](1)將BMSCs胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液；
[0013](2)取單細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上:
[0014](3)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0015](4)加入L-DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)即得膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
[0016]所述步驟(2)中，單細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)量約IXlO6 / cm2。
[0017]所述步驟(3)中，培養(yǎng)箱為37°C、5% CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)15min。[0018]所述步驟(4)中，加入L-DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間為lh。
[0019]膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以應(yīng)用于治療嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷。
[0020]所述的嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷是指各種原因造成的子宮內(nèi)膜過度損傷，內(nèi)膜功能性修復(fù)障礙，代之以結(jié)締組織增生修復(fù)，子宮壁發(fā)生纖維化，瘢痕形成。
[0021]所述膠原支架由煙臺(tái)正海生物技術(shù)有限公司提供，已經(jīng)CFDA批準(zhǔn)應(yīng)用于皮膚及口腔黏膜修復(fù)。
[0022]所述骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由發(fā)明人分離與培養(yǎng)，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)細(xì)胞表面抗原鑒定(圖2)及體外誘導(dǎo)分化鑒定(圖3):⑶90、⑶44、CD29陽性，⑶45、CD34陰性，可誘導(dǎo)分化為骨、脂肪及神經(jīng)元細(xì)胞。
[0023]所述膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞由以下方法制備:
[0024]培養(yǎng)基濕潤膠原支架排氣后將BMSCs細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上(約IXlO6 / Cm2)，放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min，加入L-DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)Ih0
[0025]本發(fā)明治療嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷與以往治療方法相比，具有以下優(yōu)點(diǎn)=BMSCs作為治療嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷的活性 成分，具有獲取方便的優(yōu)點(diǎn)，其可以補(bǔ)充局部干細(xì)胞數(shù)量，并分泌生長因子改善局部微環(huán)境及免疫調(diào)節(jié)等作用。膠原支架具有良好的生物相容性、可降解性及安全性。其可以為BMSCs提供支持位點(diǎn)，提高局部BMSCs濃度，延長BMSCs作用時(shí)間。膠原支架復(fù)合BMSCs可以促進(jìn)疤痕子宮內(nèi)膜修復(fù)，增加內(nèi)膜厚度及局部血管密度。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0026]圖1——膠原支架外觀及掃描電鏡圖片示意圖。
[0027]圖2——流式細(xì)胞術(shù)BMSCs表面標(biāo)志測定示意圖。
[0028]圖3——BMSCs體外定向誘導(dǎo)分化結(jié)果示意圖。
[0029]圖4—HE染色觀察BMSCs與膠原支架復(fù)合后其在膠原支架中的分布示意圖。
[0030]圖5-掃描電鏡觀察BMSCs與膠原支架復(fù)合后其在膠原支架表面分布不意圖。
[0031]圖6-膠原支架復(fù)合BMSCs用于大鼠子宮全層損傷修復(fù)后HE染色觀察不意圖。
[0032]圖7—膠原支架復(fù)合BMSCs用于大鼠子宮全層損傷修復(fù)后平滑肌免疫組化示意圖。
[0033]圖8-膠原支架復(fù)合BMSCs用于大鼠子宮全層損傷修復(fù)后血管免疫組化不意圖。
[0034]圖9—膠原支架復(fù)合BMSCs用于大鼠子宮全層損傷修復(fù)后妊娠結(jié)局比較示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0035]實(shí)施例1:
[0036]BMSCs與膠原支架復(fù)合培養(yǎng)
[0037]1、所用設(shè)備，材料，試劑
[0038]超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、離心機(jī)、掃描電鏡、臨界點(diǎn)干燥儀、組織包埋冷凍臺(tái)、石蠟切片機(jī)、全自動(dòng)組織染色機(jī)、細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6孔板、離心管、L-DMEM培養(yǎng)液、胎牛血清、青霉素/鏈霉素、胰酶、甲醛、戊二醛、二甲苯、濃度梯度乙醇、蘇木素、伊紅等
[0039]2、BMSCs細(xì)胞活性保持
[0040](I)培養(yǎng)至貼壁細(xì)胞90%融合時(shí)，進(jìn)行傳代；
[0041](2)吸除舊培養(yǎng)液，加入PBS洗去殘留培養(yǎng)液，吸除PBS ；
[0042](3)加入胰酶Iml，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶；
[0043](4)倒置顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)回縮、細(xì)胞間隙增大，加入完全培養(yǎng)液終止消化；
[0044](5)吹打瓶壁細(xì)胞，使其形成細(xì)胞懸液；
[0045](6)將細(xì)胞懸液吸入離心管，離心(常溫170g，5min)，棄上清；
[0046](7)用完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度后接種于培養(yǎng)瓶中，37°C、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；
[0047](8)隔天換液，繼續(xù)培養(yǎng)。
[0048]3、BMSCs與膠原支架復(fù)合培養(yǎng)
[0049](I)膠原支架UP面朝下，置于6孔板中，用培養(yǎng)基充分濕潤，適當(dāng)擠壓去除內(nèi)部空氣，用無菌紗布將多余培養(yǎng)基吸干。
[0050](2)取生長良好的BMSCs，胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)并調(diào)整細(xì)胞濃度。
[0051](3)取適量單細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上，細(xì)胞數(shù)量約IX IO6 / cm2，將6孔板放入37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15min，然后緩慢加入2mLL_DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)I小時(shí)。
[0052]4、膠原支架為BMSCs提供支持位點(diǎn)
[0053](I)BMSCs在膠原支架中分布
[0054]BMSCs與膠原支架復(fù)合培養(yǎng)后，分別取培養(yǎng)lh、3h、12h、24h、48h、72h的膠原支架作為樣品，HE染色觀察細(xì)胞在支架表面及內(nèi)部分布。
[0055]樣品于10%中性甲醛溶液中固定24小時(shí)，經(jīng)乙醇梯度脫水、二甲苯透明后浸蠟過夜，石蠟包埋樣品后切片，行HE染色，封片，光學(xué)顯微鏡下觀察(結(jié)果見圖4)
[0056]結(jié)果:HE染色可見膠原呈紅色。BMSCs與膠原支架復(fù)合培養(yǎng)Ih后,可見圓形細(xì)胞分布在膠原支架表面。培養(yǎng)3h后可見分布在膠原支架表面BMSCs由圓形變?yōu)槎嘟切?。培養(yǎng)12h后可見大部分BMSCs為多角形，少量呈梭形，細(xì)胞伸出觸角相互連接。培養(yǎng)24h后，可見大部分BMSCs由變?yōu)樗笮?，除膠原支架表面分布外，部分細(xì)胞散在膠原纖維中。培養(yǎng)48h后，可見梭形BMSCs部分融合，膠原支架中細(xì)胞數(shù)量增多，細(xì)胞周圍膠原開始降解。培養(yǎng)72h后，可見梭形BMSCs融合成片，細(xì)胞數(shù)量明顯增加，細(xì)胞周圍膠原降解。結(jié)果表明BMSCs能夠粘附于膠原支架表面，并且增殖進(jìn)入膠原支架內(nèi)部，保持良好的生物活性。
[0057](2) BMSCs在膠原支架表面形態(tài)學(xué)觀察
[0058]BMSCs與膠原支架復(fù)合培養(yǎng)后，分別取培養(yǎng)lh、3h、12h、24h、48h、72h的膠原支架
作為樣品，用掃描電鏡觀察細(xì)胞在膜表面形態(tài)。
[0059]將樣品裁剪為面積約8X8mm薄片，于4°C 2.5%戊二醛固定24小時(shí)，漂洗樣品，梯度乙醇脫水，純丙酮置換，中間液(醋酸異戊酯)代換，臨界點(diǎn)干燥儀中干燥，用導(dǎo)電膠將樣品裝固在樣品臺(tái)上，掃描電鏡觀察(結(jié)果見圖5)。
[0060]結(jié)果:掃描電鏡下可見，膠原支架為疏松多孔組織，具有較廣的孔徑分布范圍和較高的孔隙率。BMSCs與膠原支架復(fù)合培養(yǎng)Ih后，可見圓形細(xì)胞分布在膠原支架表面，少量細(xì)胞伸出觸角，細(xì)胞輪廓清晰可辨。培養(yǎng)3h后可見BMSCs由圓形變?yōu)槎嘟切危糠旨?xì)胞伸出觸角相互連接。培養(yǎng)12h后可見分布在膠原支架表面大部分BMSCs變?yōu)槎嘟切魏退笮?，?xì)胞伸出觸角相互連接，細(xì)胞輪廓尚可辨別。培養(yǎng)24h后可見BMSCs相互融合成片覆蓋在膠原支架表面，細(xì)胞輪廓不清，在膠原支架內(nèi)部孔隙中可見細(xì)胞存在。繼續(xù)培養(yǎng)48h和72h后可見膠原支架表面孔隙被融合成片的細(xì)胞遮蓋，細(xì)胞增殖，并進(jìn)入到膠原支架內(nèi)部。結(jié)果表明BMSCs能夠粘附于膠原支架表面，BMSCs與膠原支架之間具有良好的生物相容性。
[0061]實(shí)施例2:
[0062]膠原支架復(fù)合BMSCs用于嚴(yán)重子宮損傷動(dòng)物模型修復(fù)治療中
[0063]UBMSCs使用前鑒定
[0064](I)無菌試驗(yàn):如培養(yǎng)過程中未出現(xiàn)任何異常，常規(guī)在BMSCs與膠原支架復(fù)合前3天，最后一次換液后，對(duì)每一培養(yǎng)瓶中的上清液作無菌試驗(yàn)，培養(yǎng)細(xì)菌和霉菌。
[0065](2)外觀及鏡下觀察:在BMSCs與膠原支架復(fù)合的當(dāng)天，如無菌試驗(yàn)報(bào)告無細(xì)菌、霉菌生長，對(duì)培養(yǎng)瓶中的上清液進(jìn)行顏色觀察，在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞密度、有無細(xì)菌或霉菌生長。如有可疑，須再次抽樣作無菌試驗(yàn)培養(yǎng)細(xì)菌、霉菌。
[0066](3)活細(xì)胞比例:在BMSCs與膠原支架復(fù)合當(dāng)天對(duì)收集的細(xì)胞懸液抽樣檢查活細(xì)胞比例占95%以上。
[0067](4)表面標(biāo)志:在BMSCs與膠原支架復(fù)合前3天抽樣行表面標(biāo)志測定:⑶34、⑶45表達(dá)陰性KD29、⑶44、⑶90表達(dá)陽性。
[0068]2、膠原支架復(fù)合BMSCs治療大鼠子宮嚴(yán)重?fù)p傷
·[0069]選取大鼠子宮全層損傷模型為子宮嚴(yán)重操作動(dòng)物模型一切除長約1.5厘米、寬約0.5厘米，相當(dāng)于子宮周徑一半的全層子宮壁組織。
[0070]大鼠麻醉，取下腹部正中縱形切口進(jìn)入腹腔。于子宮中段子宮系膜對(duì)側(cè)切除長約
1.5cm、寬約0.5cm全層子宮壁組織。分別將復(fù)合有PBS和BMSCs的膠原支架修補(bǔ)缺損部位，關(guān)閉腹部切口。術(shù)后30天及90天后分別取材行HE染色及免疫組化染色進(jìn)行組織學(xué)評(píng)估，術(shù)后90天行妊娠試驗(yàn)進(jìn)行功能學(xué)評(píng)估。
[0071]結(jié)果:術(shù)后30天及90天組織學(xué)評(píng)估顯示，與膠原支架/ PBS組相比，膠原支架/BMSCs組子宮內(nèi)膜及肌層均較厚，有大量血管、腺體和細(xì)胞(圖6-8)。妊娠試驗(yàn)顯示:膠原支架/ BMSCs組妊娠率及手術(shù)區(qū)域妊娠率較膠原支架/ PBS組明顯增高(圖9)。結(jié)果提示:膠原支架/ BMSCs能夠促進(jìn)大鼠子宮仝層損傷后子宮內(nèi)膜和平滑肌再生，提高組織血管化和細(xì)胞化，促進(jìn)子宮妊娠功能恢復(fù)。
[0072]本發(fā)明通過體外培養(yǎng)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，BMSCs能夠粘附于膠原支架表面，且與膠原支架之間具有良好的生物相容性，膠原支架復(fù)合BMSCs能夠促進(jìn)嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷后修復(fù)，增加內(nèi)膜厚度、內(nèi)膜細(xì)胞數(shù)量及內(nèi)膜局部血管密度，無毒性。所以，膠原支架復(fù)合BMSCs可以用于治療嚴(yán)重子宮內(nèi)膜損傷。
【權(quán)利要求】
1.膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法，其特征在于將BMSCs與膠原支架復(fù)合培養(yǎng)；所述復(fù)合培養(yǎng)步驟包括: (1)將BMSCs胰酶消化后制備單細(xì)胞懸液； (2)取單細(xì)胞懸液均勻滴加到膠原支架上； (3)放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (4)加入L-DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)即得膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法，其特征在于步驟(2)中，單細(xì)胞懸液細(xì)胞數(shù)量約IXlO6/ cm2。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法，其特征在于步驟(3)中，培養(yǎng)箱為37°C、5%CO2培養(yǎng)箱，培養(yǎng)15min。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞制備方法，其特征在于步驟(4)中，加入L-DMEM完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)時(shí)間為lh。
5.根據(jù)權(quán)利要求1得到的膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的應(yīng)用，其特征在于膠原支架復(fù)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞以復(fù)合補(bǔ)片的形態(tài)貼附固定于子宮內(nèi)膜創(chuàng)傷表面，治療子宮內(nèi)膜損傷。`
【文檔編號(hào)】A61L31/04GK103705984SQ201310697505
【公開日】2014年4月9日 申請(qǐng)日期:2013年12月17日 優(yōu)先權(quán)日:2013年12月17日
【發(fā)明者】胡婭莉, 戴建武, 李新安, 丁利軍 申請(qǐng)人:南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院