糖鏈相關基因及其利用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明人深入研究的結(jié)果成功地首次發(fā)現(xiàn)通過阻礙作為構(gòu)成糖鏈的糖之一的GalNAc的4位或6位的硫酸化，可以在生物水平上抑制組織的纖維形成。而且，本發(fā)明人通過利用各種疾病模型動物的研究，成功地證實了GalNAc的4位或6位的硫酸化抑制劑對組織的纖維形成所引起的疾?。ńM織纖維形成性疾?。┚哂兄委熜Ч?。
【專利說明】糖鏈相關基因及其利用
[0001]本申請是申請日為2008年12月26日、發(fā)明名稱為“糖鏈相關基因及其利用”的中國申請?zhí)枮?00880127570.X的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明涉及通過阻礙糖鏈相關基因來抑制生物組織水平的纖維形成的抑制劑。
【背景技術】
[0003]一直以來，對于核酸和蛋白質(zhì)進行了深入細致的研究，已經(jīng)清楚了很多情況。但是相反地，這些研究也說明了人類的基因只不過僅有2萬2千個左右，蛋白質(zhì)的翻譯后修飾在生物體內(nèi)是重要的，其還說明了以往的研究方式是有限的。近年來，在后基因組、后蛋白質(zhì)組學的潮流中再次認識到了糖鏈的重要性(Nature誌446號:2007年4月26日發(fā)行(非專利文獻I~7)中也大量編入了糖鏈特輯)。對于糖鏈而言，由于結(jié)構(gòu)解析困難等理由，一直以來未被過多解析，雖然認為其有可能與癌癥、炎癥、免疫、病毒感染等有關，但在現(xiàn)階段，其作用等不清楚的部分還有很多，有待進一步闡明。
[0004]作為構(gòu)成糖鏈的糖(單糖)，目前已知有各種糖。例如已知葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、甘露糖(Man)、葡萄糖醛酸(GlcUA)、艾杜糖醛酸(IdoA)、巖藻糖(Fuc)、葡萄糖胺(GlcN), N-乙?；咸烟前?GlcNAc)、N-乙?；肴樘前?GalNAc)、木糖(Xyl )、唾液酸(SA)等。
[0005]另外，有報道指出構(gòu)成糖鏈的糖受到了各種化學修飾。例如已知甲基化、乙?；?、甲?；?、肉 豆蘧?；?、酰胺化、泛素化、酰化、磷酸化、差向異構(gòu)化、硫酸化等。另外還可以舉出唾液酸化、去唾液酸化、巖藻糖基化、糖基化、半乳糖基化、乳糖化、甘露糖基化等化學修飾。
[0006]糖中存在多個接受這些化學修飾的部位。例如已知在GlcNAc中I位~6位的碳全部受到化學修飾。其它的糖中也報道了在各種部位上受到了化學修飾。
[0007]非專利文獻1:Danica P.Galonic and David Y.Gin, Nature446: 1000-1007(2007)
[0008]非專利文獻2:Christopher J.Thibodeaux et.Al., Nature446:1008-1016(2007)
[0009]非專利文獻3 =Gerald ff.Hart et.Al.，Nature446:1017-1022 (2007)
[0010]非專利文獻4:Ajit Varki, Nature446:1023-1029 (2007)
[0011]非專利文獻5 Joseph R.Bishop et.Al.，Nature446:1030-1037 (2007)
[0012]非專利文獻6:Christopher N.et.Al.，Nature446:1038-1045 (2007)
[0013]非專利文獻7:Peter H.Seeberger and Daniel B.fferz, Nature446:1046-1051(2007)

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014]本發(fā)明基于通過對糖鏈相關基因的研究而新發(fā)現(xiàn)的事實。本發(fā)明的目的在于提供糖鏈相關基因的新用途。具體地說，其目的在于提供通過阻礙糖鏈相關基因的功能來抑制生物組織水平的纖維形成的藥劑以及該藥劑的篩選方法。
[0015]雖然已知糖鏈在生物體內(nèi)的作用非常重要，但對于糖鏈在生物體內(nèi)的功能仍有很多不清楚的部分。
[0016]如上所述，構(gòu)成糖鏈的糖已知有多個種類，認為糖通過在多個部位受到各種化學修飾而在生物體內(nèi)承擔重要的生理作用。
[0017]如上所述，存在大量構(gòu)成糖鏈的糖的種類、以糖為靶標的化學修飾的種類以及其被化學修飾的部位，因此認為糖鏈是由無數(shù)個變量構(gòu)成的。因而，確定承擔某作用的糖鏈的結(jié)構(gòu)是非常困難的，而且也極難發(fā)現(xiàn)某種疾病所引起的病態(tài)與糖鏈的具體作用之間的關聯(lián)性。
[0018]本發(fā)明人深入研究的結(jié)果是首次成功地發(fā)現(xiàn)了通過阻礙構(gòu)成糖鏈的糖之一的GalNAc的4位或6位的硫酸化，可以抑制生物水平上的組織的纖維形成。進而，本發(fā)明人通過利用各種疾病模型動物的研究，證實了 GalNAc的4位或6位的硫酸化抑制劑對組織的纖維形成所引起的疾病(組織纖維形成性疾病)具有治療效果。
[0019]本發(fā)明涉及通過阻礙糖鏈相關基因的功能來抑制生物組織水平的纖維形成的藥劑以及該藥劑的篩選方法，更具體地說，本發(fā)明提供:
[0020](I) 一種組織纖維形成抑制劑，其以N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸化抑制劑為成分。
[0021](2)上述(I)所述的藥劑，其特征在于，對生物組織的纖維形成具有抑制效果。
[0022](3)上述(I)或(2)所述的藥劑，其`中，上述抑制劑具有阻礙N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基轉(zhuǎn)移酶的功能的活性。
[0023](4)上述(3)所述的藥劑，其中，上述抑制劑是抑制N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸基轉(zhuǎn)移酶基因的表達的siRNA。
[0024](5 )上述(I)或(2 )所述的藥劑，其中，上述抑制劑是N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸基的脫硫酸化酶。
[0025](6)上述(I)~(5)任一項所述的藥劑，其為纖維形成性疾病的治療用或預防用的藥劑。
[0026](7) 一種組織纖維形成抑制劑的篩選方法，其包含選擇阻礙構(gòu)成糖鏈的N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸化的化合物的工序。
[0027](8) 一種組織纖維形成抑制劑的篩選方法，其包含以下的工序(a)~(C):
[0028](a)使N-乙酰基半乳糖胺或含有N-乙酰基半乳糖胺的糖鏈與受試化合物接觸的工序；
[0029](b)測定N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸化程度的工序；
[0030]( c )選擇與未接觸受試化合物的情況相比使硫酸化程度降低的化合物的工序。
[0031](9) 一種組織纖維形成抑制劑的篩選方法，其包含以下的工序(a)~(C):
[0032](a)使N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基轉(zhuǎn)移酶與受試化合物接觸的工序;
[0033](b)測定上述酶的硫酸基轉(zhuǎn)移活性的工序；
[0034](C)選擇與未接觸受試化合物的情況相比使上述活性降低的化合物的工序。[0035](10) 一種組織纖維形成抑制劑的篩選方法，其包含以下的工序(a)~(C):
[0036](a)使受試化合物與表達編碼N-乙酰基半乳糖胺的4位或6位的硫酸基轉(zhuǎn)移酶的基因的細胞接觸的工序；
[0037](b)測定上述細胞中基因的表達量的工序；
[0038](C)選擇與未接觸受試化合物的情況相比使上述基因的表達量降低的化合物的工序。
[0039](11) 一種組織纖維形成抑制劑的篩選方法，其包含以下的工序(a)~(C):
[0040](a)使受試化合物與含有下述DNA的細胞或細胞提取液接觸的工序，所述DNA具有編碼N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸基轉(zhuǎn)移酶的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)區(qū)域與報告基因功能性結(jié)合而成的結(jié)構(gòu)；
[0041](b)測定上述報告基因的表達量的工序；
[0042](C)選擇與未接觸受試化合物的情況相比使上述報告基因的表達量降低的化合物的工序。
[0043](12)用于纖維形成性疾病的治療或預防的藥品組合物的制造方法，其包含以下的工序(a)和(b):
[0044](a)利用上述(7)~(11)任一項所述的方法從受試試樣中選擇組織纖維形成抑制劑的工序；
[0045](b)將上述藥劑和藥學上可允許的載體混合的工序。
[0046]另外，本發(fā)明還涉及:
[0047]( 13)—種抑制組織纖維形成的方法，其包含向個體投予N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸化抑制劑的工序。
[0048](14) N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸化抑制劑在制造組織纖維形成抑制劑中的用途。
[0049](15)用于組織纖維形成抑制用途的N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸化抑制劑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0050]圖1是表示使用定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法對通過DOX氣管內(nèi)投予所誘發(fā)的心肌病模型小鼠的基因表達進行研究的結(jié)果的圖。研究項目是作為siRNA的靶基因的GalNAc4S-6ST、作為纖維形成標記物的a-SMA和I型膠原。圖中表示了目標基因與看家基因(核糖體18S)的相對比值。*P〈0.001 (t-檢驗)
[0051]圖2是表示對通過鹽酸多柔比星(D0X:協(xié)和發(fā)酵公司制)腹腔內(nèi)投予所誘發(fā)的心肌病模型小鼠的心臟重量/體重比進行解析的結(jié)果的圖。*P〈0.05 (t-檢驗)
[0052]圖3是表示顯示通過DOX氣管內(nèi)投予所誘發(fā)的心肌病模型小鼠的siRNA治療組的I型膠原沉積的抑制效果的組織所見的照片。倍率為100倍。
[0053]圖4是表示顯示通過DOX氣管內(nèi)投予所誘發(fā)的心肌病模型小鼠的siRNA治療組的III型膠原沉積的抑制效果的組織所見的照片。倍率為100倍。
[0054]圖5是表示通過DOX氣管內(nèi)投予所誘發(fā)的心肌病模型小鼠siRNA治療組的纖維芽細胞(fibroblast，也稱為成纖維細胞)的聚集抑制效果的照片。倍率為50倍。[0055]圖6是表示通過DSS所誘發(fā)的小鼠腸道纖維形成模型的臨床圖像的圖。通過GalNAc4S-6ST siRNA投予，臨床評分(左)、大腸長度的短縮(右)均被顯著抑制。
[0056]圖7是表示小鼠腸道纖維形成模型的纖維形成相關基因的表達的圖。研究了大腸組織中的GalNAc4S-6ST以及作為纖維形成標記物的a -SMA和I型膠原。圖中表示了目標基因與看家基因(核糖體18S)的相對比值。通過GalNAc4S-6ST siRNA的沉默效應(上)，I型膠原(下左)、α-SMA (下右)的表達增強被顯著抑制。
[0057]圖8是表示小鼠腸道纖維形成模型的膠原組織沉積的照片。大腸組織的馬松染色圖像(藍色)。X 100。GalNAc4S-6ST siRNA減輕了膠原的組織沉積。
[0058]圖9是表示小鼠腸道纖維形成模型的纖維芽細胞浸潤的照片。大腸組織的纖維芽細胞染色圖像(茶色)。X 100。GalNAc4S-6ST siRNA抑制了纖維芽細胞的全層性的浸潤。
[0059]圖10是表示小鼠腸道纖維形成模型的巨噬細胞浸潤圖像的照片。大腸組織的巨噬細胞染色圖像(茶色)。X 100。GalNAc4S-6ST siRNA抑制了巨噬細胞的全層性的浸潤。
[0060]圖11是表示小鼠腸道纖維形成模型的大腸長度的圖。GalNAc4ST siRNA顯著地抑制了大腸的短縮。
[0061]圖12是表示通過PPE所誘發(fā)的小鼠肺氣腫模型的臨床圖像的照片。C6ST_lsiRNA投予顯著地抑制了組織學上的肺泡壁破壞。X100。
[0062]圖13是表示小鼠肺氣腫模型的纖維形成相關基因的表達的圖。研究了肺組織中的C6ST-1以及作為纖維形成標記物的a -SMA和I型膠原。圖中表示了目標基因與看家基因(核糖體18S)的相對比值。通過C6ST-lsiRNA的沉默效應(左)，顯著地抑制I型膠原(中央)、α-SMA (右)的表達增強。
[0063]圖14是表示小鼠肺氣腫模型的纖維芽細胞浸潤的照片。肺組織的纖維芽細胞染色圖像(茶色)。X200。通過C6ST-lsiRNA抑制了纖維芽細胞在肺泡間質(zhì)中的浸潤。
[0064]圖15是表示小鼠肺氣腫模型的巨噬細胞浸潤圖像的照片。肺組織的巨噬細胞染色圖像(茶色)。X200。C6ST-lsiRNA抑制了巨噬細胞在肺泡間質(zhì)中的浸潤。
[0065]圖16是表示小鼠肺氣腫模型的靜態(tài)肺順應性(Cst)的圖。通過C6ST_lsiRNA，Cst顯著降低。
[0066]圖17是表示小鼠肺氣腫模型的右肺容量(μ I)的圖。通過C6ST_lsiRNA，肺容量顯著降低。
[0067]圖18是表示小鼠肺氣腫模型的纖維形成相關基因的表達的圖。研究了肺組織中的作為纖維形成標記物的0-5祖、1型膠原以及16?-3。圖中表示了目標基因與看家基因(核糖體18S)的相對比值。通過GalNACST siRNA的沉默，顯著地抑制了各纖維形成標記物的表達增強。
[0068]圖19是表示小鼠肺氣腫模型的靜態(tài)肺順應性(Cst)的圖。通過GalNAcST siRNA,Cst顯著降低。
[0069]圖20是表示小鼠肺氣腫模型的右肺容量(μ I)的圖。通過GalNAcST siRNA，肺容量顯著降低。
[0070]圖21是表示小鼠2型糖尿病模型的肥胖變化的圖。C4ST-lsiRNA、C4ST_2siRNA、C4ST-3siRNA顯示出肥胖抑制傾向。C4ST-2siRNA、C4ST_3siRNA顯示出顯著的抗肥胖效果。
·[0071]圖22是表示小鼠2型糖尿病模型的胰島素抵抗性的圖。通過C4ST_lsiRNA、C4ST-2siRNA、C4ST-3siRNA，胰島素抵抗性顯著地改善。
[0072]圖23是表示小鼠2型糖尿病模型的胰腺組織的基因表達的照片。通過C4ST-lsiRNA、C4ST-2siRNA、C4ST-3siRNA，抑制了胰腺組織的 C4ST-1、C4ST-2、C4ST_3 基因表達。
[0073]圖24是表示小鼠2型糖尿病模型中APP向胰腺胰島沉積的照片。通過C4ST-2siRNA，抑制了胰島的APP (綠色)沉積。細胞核(紅色)、X 400。
[0074]圖25是表示小鼠2型糖尿病模型中纖維芽細胞向胰腺胰島浸潤的照片。通過C4ST-lsiRNA、C4ST-2siRNA、C4ST-3siRNA，抑制了纖維芽細胞(茶色)向胰島的浸潤。X200。
[0075]圖26是表示小鼠2型糖尿病模型中巨噬細胞向胰腺胰島浸潤的照片。通過C4ST-1 siRNA, C4ST-2siRNA、C4ST_3siRNA，抑制了巨噬細胞(茶色)向胰島的浸潤。X 200。
[0076]圖27是表示小鼠2型糖尿病模型的胰島素抵抗性的圖。通過GalNAcST siRNA投予，胰島素負荷后的血糖下降良好地進行，即胰島素抵抗性有所改善。
[0077]圖28是表示小鼠糖尿病性腎病模型的纖維芽細胞的腎組織間質(zhì)聚集的圖及照片。通過C4ST-lsiRNA，顯著地抑制了纖維芽細胞(茶色)的聚集。X200。
[0078]圖29是表示小鼠糖尿病性腎病模型的巨噬細胞的腎組織間質(zhì)聚集的圖及照片。通過C4ST-lsiRNA，顯著地抑制了巨噬細胞(茶色)的聚集。X200。
[0079]圖30是表示小鼠糖尿病性腎病模型的a SMA陽性細胞的腎組織間質(zhì)聚集的照片。通過C4ST-lsiRNA，顯著地抑制了 a SMA陽性細胞(茶色)的聚集。Χ200。
[0080]圖31是表示小鼠糖尿病性腎病模型的抗纖維形成效果的圖。通過GalNAc4S_6ST(G#l) siRNA的投予，顯著地抑制了腎組織中的GalNAc4S-6ST (G#l)、a SMA.TGF^的表達增強。ARB:血管緊張素受體拮抗劑(纈沙坦)。
[0081]圖32是表示小鼠糖尿病性腎病模型的纖維芽細胞的腎組織間質(zhì)聚集的照片及圖。通過GalNAc4S-6ST (G#l) siRNA，顯著地抑制了纖維芽細胞(茶色)的聚集。X200。
[0082]圖33是表示小鼠糖尿病性腎病模型的巨噬細胞的腎組織間質(zhì)聚集的照片及圖。通過GalNAc4S-6ST (G#l) siRNA，顯著地抑制了巨噬細胞(茶色)的聚集。X200。
[0083]圖34是表示小鼠糖尿病性腎病模型的IV型膠原的蓄積的照片及圖。通過GalNAc4S-6ST (G#l) siRNA,顯著地抑制了可通過IV型膠原(茶色)陽性確認的腎小球基底膜的肥厚。X 400。
[0084]圖35是表示小鼠糖尿病性腎病模型的腎保護作用的圖。通過GalNAc4S_6ST(G#l)siRNA，顯著地抑制了腎組織的血管緊張素原以及ACE的表達增強。
[0085]圖36是表示小鼠糖尿病性腎病模型的腎功能保護作用的圖。通過GalNAc4S_6ST(G#l) siRNA，抑制了血清肌酸酐的增加、即抑制了腎功能下降。
[0086]圖37是表示小鼠糖尿病性腎病模型的基因表達的圖。通過GalNAcSTsiRNA，顯著地抑制了腎組織中的GalNAc4ST-l、GalNAc4ST-2、GalNAc4S_6ST的表達增強。
[0087]圖38是表示小鼠糖尿病性腎病模型的抗纖維形成效果的圖。通過GalNAcSTsiRNA，顯著地抑制了腎組織中的CTGF、a SMA, I型膠原、ACE的表達增強。
[0088]圖39是表示小鼠藥源性間質(zhì)性腎炎的基因表達的圖。通過GalNAc4S_6ST (G#l)siRNA，顯著地抑制了腎組織的GalNAc4S-6ST (G#l)的表達增強。
[0089]圖40是表示小鼠藥源性間質(zhì)性腎炎的膠原沉積的照片。通過GalNAc4S_6ST(G#l)siRNA, I型膠原(茶色)向腎間質(zhì)的沉積明顯減少。X200。
[0090]圖41是表示小鼠UUO纖維形成模型的抗纖維形成效果的圖。通過C6ST siRNA,顯著地抑制了腎組織中的C6ST-2 (G#10)、TGFβ , a SMA, I型膠原、CTGF的表達增強。
[0091]圖42是表示小鼠UUO纖維形成模型的纖維芽細胞的間質(zhì)聚集的圖及照片。通過C6ST siRNA，顯著地抑制了纖維芽細胞(茶色)從近腎小球向間質(zhì)的聚集。X200。
[0092]圖43是表示小鼠UUO纖維形成模型中巨噬細胞的間質(zhì)聚集的圖及照片。通過C6STsiRNA，顯著地抑制了巨噬細胞(茶色)從近腎小球向間質(zhì)的聚集。X200。
[0093]圖44是表示小鼠UUO纖維形成模型中膠原沉積的圖及照片。通過C6ST siRNA,顯著地抑制了可以通過IV型膠原(茶色)確認的腎小球基底膜的肥厚。X400。
[0094]圖45是表示小鼠UUO纖維形成模型中組織聚集纖維芽細胞的活化的照片。通過C6ST siRNA，顯著地抑制了 a SMA陽性細胞(茶色)從近腎小球向間質(zhì)的聚集。Χ400。
[0095]圖46是表示小鼠UUO纖維形成模型中ACE產(chǎn)生細胞的間質(zhì)聚集的照片。通過C6STsiRNA，顯著地抑制了 ACE產(chǎn)生細胞(茶色)從近腎小球向間質(zhì)的聚集。X400。
[0096]圖47是表示小鼠糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型的IV型膠原的組織蓄積的照片。通過GalNac4S-6ST (G#l)siRNA，抑制了 IV型膠原(茶色)的聚集。X200。GCL:神經(jīng)節(jié)細胞層、INL:內(nèi)顆粒層、ONL:外顆粒層。
[0097]圖48是表示小鼠 糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型中CSPG的組織蓄積的照片。通過GalNac4S-6ST (G#l) siRNA，抑制了 CSPG (茶色)的聚集。特別是從GCL、0NL向色素上皮細胞層的抑制效果明顯。X200。
[0098]圖49是表示小鼠糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型中GFAP陽性細胞的照片。通過GalNac4S-6ST (G#l) siRNA，GFAP 陽性細胞(茶色)從 INL 向 GCL 顯著增加。X200。
[0099]圖50是表示小鼠糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型中神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)的圖。GGL中神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)的計數(shù)。通過GalNac4S-6ST (G#l) siRNA，可顯著抑制神經(jīng)節(jié)細胞數(shù)的減少。
[0100]圖51是表示小鼠糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型中視神經(jīng)再生效果的圖。通過GalNac4S-6ST (G#l) siRNA,眼組織的GS表達顯著上升。
[0101]圖52是表示小鼠脂肪性肝損傷模型中基因表達的圖。表示了 GalNAc4S_6ST在肝臟組織的表達增強和GalNAcST siRNA帶來的顯著抑制。
[0102]圖53是表示小鼠脂肪性肝損傷模型中纖維形成相關基因表達的圖。表示了 I型膠原、a SAM在肝臟組織的表達增強和GalNAcST siRNA帶來的顯著抑制。
[0103]圖54是表示小鼠脂肪性肝損傷模型中纖維形成細胞浸潤的照片。通過GalNAcSTsiRNA，抑制了纖維芽細胞(茶色)在肝臟組織的橋樣聚集。X 100。
[0104]圖55是表示小鼠脂肪性肝損傷模型中臨床纖維形成評分的圖。通過GalNAcSTsiRNA，顯著地抑制了肝臟組織的纖維形成評分的上升。
[0105]圖56是表示小鼠脂肪性肝損傷模型中巨噬細胞浸潤的照片。通過GalNAcSTsiRNA，抑制了巨噬細胞(茶色)在肝臟組織的聚集。X 100。
[0106]圖57是表示小鼠脂肪性肝損傷模型中脂質(zhì)代謝相關基因表達的圖。通過GalNAcST siRNA，顯著地抑制了肝臟組織中的ChREBP、ACC2的表達上升。
[0107]圖58是表示小鼠脂肪性肝損傷模型中纖維形成細胞浸潤的照片。通過C4ST-1 siRNA, C4ST-2siRNA、C4ST_3siRNA，抑制了纖維芽細胞(茶色)在肝臟組織的橋樣聚集。X 100。
[0108]圖59是表示小鼠脂肪性肝損傷模型中臨床纖維形成評分的圖。通過C4ST-1 siRNA, C4ST-2siRNA、C4ST_3siRNA，顯著地抑制了肝臟組織的纖維形成評分的上升。
[0109]圖60是表示小鼠脂肪性肝損傷模型中臨床的肝功能障礙的圖。通過C4ST-1 siRNA, C4ST-2siRNA、C4ST_3siRNA，抑制了作為肝細胞功能障礙指標的ALT的上升。
[0110]圖61是表示小鼠肝纖維癥模型中纖維芽細胞浸潤的照片。通過C6STsiRNA，抑制了纖維芽細胞(茶色)在肝臟組織的聚集。X50。
[0111]圖62是表示小鼠肝纖維癥模型中臨床纖維形成評分的圖。通過C6STsiRNA，顯著地抑制了肝臟組織的纖維形成評分的上升。
[0112]圖63是表示小鼠肝纖維癥模型中抗纖維形成效果的圖。通過C6STsiRNA，顯著地抑制了 a SMA、I型膠原、CTGF、TGF β的表達。
[0113]圖64是表示小鼠帕金森病模型中抗纖維形成效果的圖。通過GalNAc4S_6STsiRNA，顯著地抑制了腦組織的GalNAc4S-6ST、TGF0、I型膠原、a SMA的表達。
[0114]圖65是表示小鼠帕金森病模型中纖維芽細胞聚集的照片。通過GalNAc4S_6STsiRNA，纖維芽細胞(茶色)的腦組織聚集劇減。X 200。
[0115]圖66是表示小鼠帕金森病模型中神經(jīng)保護作用的圖。通過GalNAc4S_6ST siRNA,⑶NF、Nurrl的表達顯著地增強。
[0116]圖67是表示小鼠帕金森病模型中多巴胺神經(jīng)再生效果的照片。通過GalNAc4S-6ST siRNA，抑制了 TH陽性多巴胺神經(jīng)(綠色)的損失。X200。
[0117]圖68是表示小鼠帕金森病模型中的多巴胺神經(jīng)再生效果的照片。通過GalNAc4STsiRNA，抑制了 TH陽性多巴胺神經(jīng)(綠色)的損失。X200。
[0118]圖69是表示2型糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型小鼠的C4-硫酸酯酶的CSPG減弱效果的照片。表示了 2型糖尿病模型小鼠視網(wǎng)膜中的CSPG (CS56)染色圖像(茶色、箭頭)。
[0119]圖70是表示2型糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型小鼠的C4-硫酸酯酶的血管增生抑制效果的照片。表示了 2型糖尿病模型小鼠視網(wǎng)膜的血管內(nèi)皮細胞(⑶31)染色圖像(茶色、箭頭)。
[0120]圖71是表示2型糖尿病性視網(wǎng)膜病變模型小鼠的C4-硫酸酯酶的膠原增生抑制效果的照片。表示了 2型糖尿病模型小鼠視網(wǎng)膜的IV型膠原染色圖像(茶色、箭頭)。
[0121]圖72是表示小鼠2型糖尿病模型的肝臟中的C4-硫酸酯酶的纖維芽細胞的聚集抑制效果的照片。倍率為50倍和100倍。
[0122]圖73是表示小鼠2型糖尿病模型的肝臟中的巨噬細胞浸潤抑制效果的照片。倍率為50倍和100倍。
[0123]圖74是表示小鼠2型糖尿病模型的血清中的生化學檢查(AST、ALT、TG)的結(jié)果的圖。圖中，未治療組標記為unt、對照組標記為nor、C4-硫酸酯酶標記為C4sul。
[0124]圖75是表示腦組織中的CSPG的局部存在的照片。該照片是使用酶抗體免疫染色法對腦組織中的CSPG的表達動態(tài)進行解析的結(jié)果。一抗使用CS-56 (生化學工業(yè)公司制)、小鼠染色試劑盒進行染色。
[0125]圖76是表示腦組織中的多巴胺能神經(jīng)的局部存在的照片。是使用熒光免疫染色法進行解析的結(jié)果。[0126]圖77是表示利用實時PCR法的TNF-α的基因表達解析結(jié)果的圖。圖中表示了使用實時PCR對作為纖維化標記物的TGF- β、作為伴隨巨噬細胞浸潤的炎癥指標的TNF- α的表達進行研究的結(jié)果。
[0127]圖78是表示利用實時PCR法的Nurrl基因表達解析結(jié)果的圖。圖中表示了腦組織中的Nurrl的基因表達，是使用Cyber premix kit (Takara Bio公司制)和實時PCR基因擴增儀DICE (Takara Bio公司制)進行的。另外，圖中表示了 Nurrl與看家基因(β -肌動蛋白)的相對比值。
【具體實施方式】
[0128]以下詳細地說明本發(fā)明。
[0129]本發(fā)明涉及以阻礙構(gòu)成糖鏈的糖之一的N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸化為機制的組織纖維形成抑制劑。
[0130]即，本發(fā)明提供以N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸化抑制劑(本說明書中有時記為“本發(fā)明的抑制劑”或者僅記為“抑制劑”)為成分的組織纖維形成抑制劑。
[0131]本發(fā)明的“N-乙?；肴樘前?GalNAc)”是作為己糖胺一種的半乳糖胺的N-乙
?；w。
[0132]另外，已知N-乙?；?乳糖胺的I~6位的部位受到化學修飾。
[0133]本發(fā)明的特征在于阻礙了 N-乙?；肴樘前返?位或6位的部位的硫酸化。
[0134]被本發(fā)明的抑制劑阻礙的部位具體地為下述GalNAc化學式中用箭頭表示的部位。
[0135]
【權利要求】
1.N-乙?；肴樘前返?位或6位的硫酸化抑制劑在制造消化道組織纖維形成抑制劑中的用途，所述硫酸化抑制劑為抑制編碼N-乙?；肴樘前?-磺基轉(zhuǎn)移酶-1即GalNAc4ST-l、N-乙?；肴樘前?-磺基轉(zhuǎn)移酶_2即GalNAc4ST_2、軟骨素-4-0-磺基轉(zhuǎn)移酶-1即C4ST-1、軟骨素-4-0-磺基轉(zhuǎn)移酶-2即C4ST-2、軟骨素-4-0-磺基轉(zhuǎn)移酶_3即C4ST-3、軟骨素-6-0-磺基轉(zhuǎn)移酶-1即C6ST-1、N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯6-0磺基轉(zhuǎn)移酶即GalNAc4S-6ST、皮膚素4磺基轉(zhuǎn)移酶I即D4ST-1、或軟骨素-6-0-磺基轉(zhuǎn)移酶-2即C6ST-2的基因的表達的siRNA。
2.權利要求1所述的用途，其中，siRNA為抑制編碼N-乙酰基半乳糖胺4-硫酸酯6-0磺基轉(zhuǎn)移酶即GalNAc4S-6ST的基因的表達的siRNA。
【文檔編號】A61K45/00GK103656644SQ201310495268
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2008年12月26日 優(yōu)先權日:2007年12月27日
【發(fā)明者】米山博之, 小山純, 藤井莊人 申請人:斯特里克再生醫(yī)學學院,斯特里克學院事務所