基于免疫膠體金的潛在指紋成像的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于免疫膠體金的潛在指紋成像的方法，包括：將指印轉(zhuǎn)移到基底上，得到指印樣本；往所述指印樣本的指印上加入納米金標(biāo)記的手指代謝物抗體溶液進(jìn)行孵育，孵育完成后用緩沖液進(jìn)行沖洗；將所述的指印樣本干燥，然后向指印上加入銀染液，避光顯色后，將指印樣本沖洗、干燥。本發(fā)明的方法簡單、快速、靈敏，能夠?qū)χ讣y進(jìn)行清晰的成像。
【專利說明】基于免疫膠體金的潛在指紋成像的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物分析和指紋檢測【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種基于免疫膠體金的潛在指紋成像的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]潛在指紋是經(jīng)身體自然分泌物(如汗液)轉(zhuǎn)移形成的指紋紋路，目視不易發(fā)現(xiàn)，是案發(fā)現(xiàn)場中最常見的指紋。據(jù)我國各地不完全統(tǒng)計，警方偵破的刑事案件中，利用指紋破案占七成以上，并且比例正在逐年上升。通常情況下，指紋是犯罪分子在現(xiàn)場留下的最直接物證，所以，研究潛在指紋的顯現(xiàn)技術(shù)，是提高指紋物證的采取率和利用率的重要環(huán)節(jié)。
[0003]現(xiàn)代指紋學(xué)的發(fā)展已經(jīng)具有上百年的歷史，按照顯現(xiàn)原理的不同，傳統(tǒng)的潛在指紋顯現(xiàn)方法主要分為三類:光學(xué)顯現(xiàn)法、化學(xué)顯現(xiàn)法以及物理吸附法。其基本原理是使用一種光線或物質(zhì)作用于指紋印痕的汗液物質(zhì)，使不能看見的潛在指紋變?yōu)榭梢姷?。發(fā)展至今，指紋檢測不僅在法醫(yī)鑒定、個體識別方面起著重要作用，同時廣泛應(yīng)用于日常生活中的安全檢驗、訪問控制、個人認(rèn)證等領(lǐng)域。近年來隨著分析科學(xué)的發(fā)展，人們對指紋的研究已不僅僅停留在利用傳統(tǒng)物理或化學(xué)手段對其形貌進(jìn)行觀察，同時更加致力于發(fā)展各種新興技術(shù)如質(zhì)譜成像、紅外/拉曼成像、掃描電化學(xué)顯微鏡以及熒光免疫成像等，對指紋中的成分進(jìn)行分析檢測，從而發(fā)掘出更多有價值的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)信息。比如，恐怖分子是否接觸過爆炸物、一個人是否具有吸煙的習(xí)慣，科學(xué)家都可以通過指紋檢測來獲取相關(guān)信息。
[0004]盡管指紋顯現(xiàn)技術(shù)在刑偵及分析科學(xué)中發(fā)揮著重大作用，但是目前在指紋顯現(xiàn)領(lǐng)域中仍然存在諸多困難。例如，在傳統(tǒng)方法中，大多要引用一種外源物質(zhì)來對潛在指紋進(jìn)行顯現(xiàn)，處理過程較為繁瑣復(fù)雜，同時對樣本具有破壞性。目前廣泛使用的煙熏法和刷粉法中采用的小粒度粉末對技術(shù)人員存在一定的身體損傷。而新興的指紋技術(shù)如質(zhì)譜成像法和紅外/拉曼成像法，則需要用到昂貴的大型儀器和專業(yè)的操作知識，不利于普及。因此目前仍然需要一種簡單、快速、 適用范圍廣的方法對潛在指紋進(jìn)行顯現(xiàn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種基于免疫膠體金的潛在指紋成像的方法，簡單、快速、靈敏，能夠?qū)χ讣y進(jìn)行清晰的成像。
[0006]一種基于免疫膠體金的潛在指紋成像的方法，包括:
[0007](I)將指印轉(zhuǎn)移到基底上，得到指印樣本；
[0008](2)往所述指印樣本的指印上加入納米金標(biāo)記的手指代謝物抗體溶液進(jìn)行孵育，孵育完成后用緩沖液進(jìn)行沖洗；
[0009](3)將所述的指印樣本干燥，然后向指印上加入銀染液，避光顯色后，將指印樣本沖洗、干燥。
[0010]人類指紋皮膚表面布滿汗腺，觸物留痕。一般來說留在客體表面的指紋物質(zhì)較少，一般為0.llmg，其中99%為水分，會迅速蒸發(fā)掉；固體物質(zhì)只占1%，其中2/3是有機(jī)物質(zhì)，如:氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪酸、尿素等；剩余1/3是無機(jī)物質(zhì)。本發(fā)明首先選擇手指代謝物的抗體，制備出納米金-抗體復(fù)合物(即免疫膠體金)，通過抗體與手指代謝物的特異性免疫反應(yīng)，使納米金間接標(biāo)記到指紋上，然后將銀染增強(qiáng)溶液滴在樣本上，在納米金的催化作用下，銀增強(qiáng)溶液中的銀離子還原成黑色的金屬銀，從而顯現(xiàn)出可視化的指紋紋路。
[0011]步驟(1)中，所述的指印為血指印或汗?jié)撝赣　?br> [0012]所述的基底為玻璃板、塑料板、不銹鋼板、錫箔、硬紙片、膠帶等。
[0013]當(dāng)所述的指印為血指印時，手指代謝物為IgG。
[0014]當(dāng)所述的指印為汗?jié)撝赣r，手指代謝物為溶菌酶。
[0015]試驗發(fā)現(xiàn)，以IgG、溶菌酶為目標(biāo)對象進(jìn)行檢測，可成功對指紋成像，且指紋紋理清晰。
[0016]所述納米金標(biāo)記的手指代謝物抗體溶液的濃度為0.05~0.2mg/mL,優(yōu)選為0.1~
0.2mg/mL?？贵w溶液的濃度過高不僅浪費試劑，還會導(dǎo)致非特異性結(jié)合，或顯色背景重，而濃度過低，則會導(dǎo)致抗原與抗體的反應(yīng)不完全，化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度弱，從而影響指紋成像效果。其中，納米金的粒徑為一般為15nm。
[0017]所述納米金標(biāo)記的手指代謝物抗體溶液的溶劑為含2%BSA，0.1%吐溫-20的PBS，PBS的濃度為0.01M, pH為7.4。PBS中添加適量的BSA和吐溫-20后可降低抗體對基底的吸附作用，使指紋圖像更清晰。
[0018]為使反應(yīng)充分進(jìn)行，所述孵育的時間為25~35min，優(yōu)選為30min。
[0019]所述的緩沖液為含0.1%吐溫-20的PBS緩沖液。
[0020]所述的銀染液為Sigma-aldrich銀增強(qiáng)溶液,購買公司為Sigma_aldrich,包括A液和B液，其中A液貨號為S5020，B液貨號為S5145，使用時將A液和B液按體積比1:1混合。
[0021]所述避光顯色的時間為15~20min，優(yōu)選為15min。顯色時間過長過短均不利于指紋的清晰成像，若時間太短反應(yīng)不充分，時間太長則背景過深。
[0022]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為:
[0023](I)本發(fā)明的方法步驟簡單、檢測迅速，只需免疫標(biāo)記和顯色反應(yīng)兩步，50min即可得到指紋圖像。
[0024](2)與廣泛使用的熒光法相比，本發(fā)明的方法不需要熒光顯微鏡等昂貴復(fù)雜的儀器，通過目測或數(shù)碼相機(jī)即可獲得結(jié)果，便于現(xiàn)場快速實時檢測。
[0025](3)該方法不需要外加激發(fā)光源，因此不存在背景光干擾，指紋圖像更加顯著清晰。
[0026](4)本發(fā)明的方法靈敏度高，可實現(xiàn)指印中痕量代謝物的特異性檢測，在進(jìn)行個體識別的同時還能實現(xiàn)指印成分(IgG、溶菌酶等)分析的目的。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0027]圖1a為用納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(PBS稀釋)檢測得到的血指印銀染顯色圖；
[0028]圖1b為用納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(PBS-T-BSA稀釋)檢測得到的血指印銀染顯色圖；[0029]圖2a為用納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(濃度為0.02mg/mL)檢測得到的血指印銀染顯色圖；
[0030]圖2b為用納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(濃度為0.20mg/mL)檢測得到的血指印銀染顯色圖；
[0031]圖2c為用納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(濃度為0.40mg/mL)檢測得到的血指印銀染顯色圖；
[0032]圖3a為用納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(顯色時間為IOmin)檢測得到的血指印銀染顯色圖；
[0033]圖3b為用納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(顯色時間為15min)檢測得到的血指印銀染顯色圖；
[0034]圖3c為用納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(顯色時間為20min)檢測得到的血指印銀染顯色圖；[0035]圖4為用納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(較優(yōu)試驗條件)檢測得到的血指印銀染顯色圖；
[0036]圖5為用納米金-溶菌酶抗體檢測得到的潛在指紋銀染顯色圖。
【具體實施方式】
[0037]下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0038]本發(fā)明是基于免疫膠體金的潛在指紋成像的方法，將一枚指印用納米金-抗體復(fù)合物進(jìn)行免疫標(biāo)記后，再將銀增強(qiáng)溶液滴在指印樣本上，通過銀染顯色顯現(xiàn)出指紋紋路，處理后的樣本可直接用肉眼進(jìn)行觀察。膠體金是由氯金酸(HAuCl4)在還原劑作用下，聚合成的一定大小的納米級金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，故稱膠體金。膠體金是一種常用的標(biāo)記技術(shù)，是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。結(jié)合銀染顯色法，可以通過金屬銀的沉積將納米金的檢測信號在特定位置進(jìn)行增強(qiáng)，具有檢測快速、便捷、不需要特殊設(shè)備、結(jié)果判斷直觀等特點。
[0039]實驗試劑:
[0040]納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物和納米金-溶菌酶抗體復(fù)合物由上海生工生物股份有限公司合成，其中，納米金為粒徑15nm的檸檬酸修飾的金納米粒子，羊抗人IgG的貨號為DAC1011 (生工生物工程有限公司)；溶菌酶抗體的貨號為DA2322 (生工生物工程有限公司)。
[0041 ] PBS-T為含0.1%吐溫-20的PBS緩沖液。
[0042]銀增強(qiáng)溶液:購買公司為Sigma-aldrich，包括A液和B液，其中，A液貨號為S5020, B 液貨號為 S5145。
[0043]實施例1
[0044]1、抗體溶劑對指紋成像的影響
[0045]( I)血指印樣本的制備:手指上蘸少量新鮮血液，在載玻片上按一枚血指?。?br> [0046](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L0.lmg/mL納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(溶劑為含2%BSA，0.1%吐溫-20的0.01MPBS, pH為7.4 ;以pH為7.4的PBS為對照)滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min,用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用IS氣將表面吹干。
[0047](3)銀染顯色:將200 μ L銀增強(qiáng)溶液滴在指印上，于暗室中避光顯色15min，用去離子水沖洗后氬氣吹干。
[0048](4)圖像采集:經(jīng)顯色后的樣本可直接用肉眼進(jìn)行觀察，或用數(shù)碼相機(jī)拍照采集圖像。
[0049]如圖1a和圖1b所示，采用PBS稀釋納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物，抗體對基底吸附嚴(yán)重(圖la)，指紋成像不清晰，在PBS中添加了吐溫和BSA后，明顯減少了其對基底的吸附，指紋紋理清晰(圖lb)。
[0050]2、不同濃度的納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物對指紋成像的影響
[0051](I)血指印樣本的制備:手指上蘸少量新鮮血液，在載玻片上按一枚血指??；
[0052](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(溶劑為含2%BSA, 0.1%吐溫-20的0.01M PBS, pH為7.4)滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣將表面吹干。
[0053](3)銀染顯色:將200 μ L銀增強(qiáng)溶液滴在指印上，于暗室中避光顯色15min，用去離子水沖洗后氬氣吹干。
[0054](4)圖像采集:經(jīng)顯色后的樣本可直接用肉眼進(jìn)行觀察，或用數(shù)碼相機(jī)拍照采集圖像。
[0055]圖2a_2c示出了納米金_羊抗人IgG抗體復(fù)合物的濃度分別為0.02、0.20、
0.40mg/mL時采集的指紋圖像,納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物的濃度太低(0.02mg/mL),銀染顯色效果不夠明顯(圖2a);濃度太高(0.40mg/mL)會使背景顏色加深(圖2c);0.20mg/mL的顯色效果最好(圖2b)。
[0056]3、銀染顯色時間對指紋成像的影響
[0057]( I)血指印樣本的制備:手指上蘸少量新鮮血液，在載玻片上按一枚血指??；
[0058](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L0.lmg/mL納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(含2%BSA, 0.1%吐溫-20的0.01M PBS,pH為7.4)滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣將表面吹干。
[0059](3)銀染顯色:將200 μ L銀增強(qiáng)溶液滴在指印上，于暗室中避光顯色，用去離子水沖洗后氬氣吹干。
[0060](4)圖像采集:經(jīng)顯色后的樣本可直接用肉眼進(jìn)行觀察，或用數(shù)碼相機(jī)拍照采集圖像。
[0061]圖3a_3c示出了避光顯色時間分別為10、15、25min時采集的指紋圖像，銀染時間太短(lOmin)，顏色較淺，顯色不夠深(圖3a);銀染時間太長(25min)，會使背景顏色加深(圖3c);顯色15min較為合適(圖3b)。
[0062]4、血指印最優(yōu)條件的檢測
[0063]( I)血指印樣本的制備:手指上蘸少量新鮮血液，在載玻片上按一枚血指??；
[0064](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將100 μ L0.lmg/mL納米金-羊抗人IgG抗體復(fù)合物(溶劑為含2%BSA，0.1%吐溫-20的0.01MPBS，pH為7.4)滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣
將表面吹干。
[0065](3)銀染顯色:將200 μ L銀增強(qiáng)溶液滴在指印上，于暗室中避光顯色15min，用去離子水沖洗后氬氣吹干。
[0066](4)圖像采集:經(jīng)顯色后的樣本可直接用肉眼進(jìn)行觀察，或用數(shù)碼相機(jī)拍照采集圖像，圖像如圖4，可見指紋圖像紋理清晰可見。
[0067]實施例 2
[0068](I)汗?jié)撝赣颖镜闹苽?測試者用香皂將手洗凈，熱風(fēng)吹干后，戴上PE手套捂汗5min,然后在基底上按Imin,得到汗?jié)撝赣　?br> [0069](2)免疫標(biāo)記:用免疫組化筆在指印周圍畫一個圈，以避免抗體溶液擴(kuò)散，將IOOyL0.lmg/mL納米金-溶菌酶抗體復(fù)合物(溶劑為含2%BSA，0.1%吐溫-20的0.01M PBS,pH為7.4)滴在指印上，于室溫培養(yǎng)30min，用PBS-T沖洗以洗去未結(jié)合的抗體，用氬氣將表面吹干。
[0070](3)銀染顯色:將200 μ L銀增強(qiáng)溶液滴在指印上，于暗室中避光顯色15min，用去離子水沖洗后氬氣吹干。
[0071](4)圖像采集:經(jīng)顯色后的樣本可直接用肉眼進(jìn)行觀察，或用數(shù)碼相機(jī)拍照采集圖像，圖像如圖5，可見指紋圖像紋理清晰可見。
[0072]上述實施例用來解釋說明本發(fā)明，而不是對本發(fā)明進(jìn)行限制，在本發(fā)明的精神和權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)，對本發(fā)明作出的任何修改和改變，都落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種基于免疫膠體金的潛在指紋成像的方法，其特征在于，包括: (1)將指印轉(zhuǎn)移到基底上，得到指印樣本； (2)往所述指印樣本的指印上加入納米金標(biāo)記的手指代謝物抗體溶液進(jìn)行孵育，孵育完成后用緩沖液進(jìn)行沖洗； (3)將所述的指印樣本干燥，然后向指印上加入銀染液，避光顯色后，將指印樣本沖洗、干燥。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的基底為玻璃板、塑料板、不銹鋼板、錫箔、硬紙片或膠帶。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(1)中，所述的指印為血指印或汗?jié)撝赣　?br> 4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的指印為血指印時，手指代謝物為IgG。
5.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述的指印為汗?jié)撝赣r，手指代謝物為溶菌酶。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米金標(biāo)記的手指代謝物抗體溶液的濃度為 0.05 ~0.2mg/mL。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述孵育的時間為25~35min。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述納米金標(biāo)記的手指代謝物抗體溶液的溶劑為含2%BSA，0.1%吐溫-20的PBS0
9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述的銀染液為Sigma-aldrich銀增強(qiáng)溶液。
10.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述避光顯色的時間為15~20min。
【文檔編號】A61B5/117GK103536297SQ201310493747
【公開日】2014年1月29日 申請日期:2013年10月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年10月18日
【發(fā)明者】蘇彬, 許林茹, 何亞蕓 申請人:浙江大學(xué)