一種二氫楊梅素在促進(jìn)白血病細(xì)胞繼續(xù)分化藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種二氫楊梅素在治療白血病藥物中的應(yīng)用，更進(jìn)一步是提供在一種二氫楊梅素在白血病細(xì)胞周期阻滯藥物或白血病細(xì)胞繼續(xù)再分化藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于，公開(kāi)了二氫楊梅素在治療白血病方面的作用機(jī)理，具體來(lái)說(shuō)，DHM可以通過(guò)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的繼續(xù)分化，從而降低惡性克隆性白血病細(xì)胞的克隆能力，減輕其對(duì)機(jī)體的危害，并促使非正常細(xì)胞向正常細(xì)胞的分化。本發(fā)明為二氫楊梅素治療白血病提供了理論支撐，填補(bǔ)了二氫楊梅素在治療白血病應(yīng)用的空白。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種二氫楊梅素在促進(jìn)白血病細(xì)胞繼續(xù)分化藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及二氫楊梅素的應(yīng)用，更具體地，涉及一種二氫楊梅素在白血病細(xì)胞繼續(xù)再分化藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]白血病是一類(lèi)造血干細(xì)胞惡性克隆性疾病?？寺⌒园籽〖?xì)胞因?yàn)樵鲋呈Э?、分化障礙、凋亡受阻等機(jī)制在骨髓和其他造血組織中大量增殖累積，并浸潤(rùn)其他組織和器官，同時(shí)正常造血受抑制。臨床可見(jiàn)不同程度的貧血、出血、感染發(fā)熱以及肝、脾、淋巴結(jié)腫大和骨骼疼痛。據(jù)報(bào)道，我國(guó)各地區(qū)白血病的發(fā)病率在各種腫瘤中占第六位，是一類(lèi)嚴(yán)重危害人民健康的惡性疾病。因此，尋找與開(kāi)發(fā)治療白血病，抑制白血病細(xì)胞增殖的藥物，可有效延長(zhǎng)白血病患者的生存時(shí)間，并提聞患者的生存質(zhì)量。
[0003]二氫楊梅素(Dihydromyricetin, DHM),又名蛇葡萄素(Ampelopsin)。提取自葡萄科蛇葡萄屬植物藤茶的葉中，屬黃酮類(lèi)化合物，其分子式為C15H1208 (圖1)。已有的對(duì)二氫楊梅素的研究主要集中 在其保肝護(hù)肝作用上，如已證實(shí)的DHM可加速乙醇代謝產(chǎn)物乙醛的快速分解，從而降低酒精對(duì)肝臟的損害，同時(shí)可改善肝細(xì)胞損傷引起的血清乳酸脫氫酶活力增加，抑制肝性M細(xì)胞膠原纖維形成等。但目前雖然有將二氫楊梅素作為治療白血病藥物的報(bào)道，但是對(duì)其作用的機(jī)理已經(jīng)最后的作用的方向都沒(méi)有做相關(guān)的研究。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的在于，提供二氫楊梅素的新應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明提供一種二氫楊梅素在白血病細(xì)胞周期阻滯藥物中的應(yīng)用。
[0006]所述的白血病細(xì)胞周期阻滯為，阻泄早幼粒白血病細(xì)胞在G0/G1期。
[0007]所述的白血病細(xì)胞周期阻滯為，對(duì)于急性淋巴瘤細(xì)胞系U937和慢性髓源白血病細(xì)胞系K562，DHM對(duì)其周期的阻滯作用則主要發(fā)生在S期。
[0008]根據(jù)需求再一種二氫楊梅素在白血病細(xì)胞繼續(xù)再分化藥物中的應(yīng)用。
[0009]所述的白血病細(xì)胞繼續(xù)再分化是指提高⑶11和⑶14的表達(dá)量。
[0010]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下:
公開(kāi)了二氫楊梅素在治療白血病方面的作用機(jī)理，具體來(lái)說(shuō)，DHM可以通過(guò)誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的繼續(xù)分化，從而降低惡性克隆性白血病細(xì)胞的克隆能力，減輕其對(duì)機(jī)體的危害，并促使非正常細(xì)胞向正常細(xì)胞的分化。本發(fā)明為二氫楊梅素治療白血病提供了理論支撐，填補(bǔ)了二氫楊梅素在治療白血病應(yīng)用的空白。
【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0011]圖1:二氫楊梅素分子式。
[0012]圖2:不同濃度二氫楊梅素對(duì)HL-60細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯作用流式結(jié)果。
[0013]圖3:不同濃度二氫楊梅素對(duì)U937細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯作用流式結(jié)果。[0014] 圖4:不同濃度二氫楊梅素對(duì)K562細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯作用流式。
[0015]圖5:不同濃度二氫楊梅素對(duì)HL-60細(xì)胞表面抗原⑶11和⑶14表達(dá)的影響。
[0016]圖6:不同濃度二氫楊梅素對(duì)U937細(xì)胞表面抗原⑶11和⑶14表達(dá)的影響。
[0017]圖7:不同濃度二氫楊梅素對(duì)K562細(xì)胞表面抗原⑶11和⑶14表達(dá)的影響。
[0018]圖8:不同濃度二氫楊梅素處理HL-60細(xì)胞，NBT陽(yáng)性程度檢測(cè)結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明。除非特別說(shuō)明，本發(fā)明采用的試劑、設(shè)備和方法為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)市購(gòu)的試劑、設(shè)備和常規(guī)使用的方法。
[0020]實(shí)施例1 二氫楊梅素對(duì)白血病細(xì)胞系細(xì)胞周期阻滯的作用 一、背景簡(jiǎn)介
細(xì)胞的生命開(kāi)始于產(chǎn)生它的母細(xì)胞的分裂，結(jié)束于它的子細(xì)胞的形成，通常將通過(guò)細(xì)胞分裂產(chǎn)生的新細(xì)胞的生長(zhǎng)開(kāi)始到下一次細(xì)胞分裂形成子細(xì)胞結(jié)束為止所經(jīng)歷的過(guò)程稱(chēng)為細(xì)胞周期。在這一過(guò)程中，細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制并均等地分配給兩個(gè)子細(xì)胞。細(xì)胞周期分為G0/G1期:從有絲分裂到DNA復(fù)制前的一段時(shí)期，又稱(chēng)合成前期，此期主要合成RNA和核糖體；S期(synthesis):即DNA合成期，在此期，細(xì)胞進(jìn)行DNA合成，同時(shí)進(jìn)行必要的蛋白質(zhì)合成；G2/M期:DNA合成后期，是有絲分裂的準(zhǔn)備期以及有細(xì)胞分裂期。
[0021]在一個(gè)增殖的細(xì)胞群中，并非所有的細(xì)胞都是同步增殖的，因此在進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)的時(shí)候，同時(shí)檢測(cè)到處于不同周期階段的細(xì)胞。正常情況下在一個(gè)細(xì)胞群中，處于各階段的細(xì)胞的比例是相對(duì)穩(wěn)定的，但在受到外界不利環(huán)境的刺激下，細(xì)胞周期圖譜會(huì)發(fā)生變化，使得處于某一階段的細(xì)胞總數(shù)突然增多，這種現(xiàn)象稱(chēng)為細(xì)胞周期阻滯，即細(xì)胞分裂因某種原因停滯在某一時(shí)相，而較難以進(jìn)入下一時(shí)相的現(xiàn)象。周期阻滯可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)代謝紊舌L從而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)一步出現(xiàn)細(xì)胞增殖障礙，凋亡或細(xì)胞死亡等。
[0022]在細(xì)胞周期圖譜中，第一道峰(高)所占面積代表G0/G1期細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)的比例；第二道峰(低)所占面積代表G2/M期細(xì)胞占總細(xì)胞的比例；兩峰之間的梯形面積為S其細(xì)胞占總細(xì)胞的比例。
[0023]二、DHM對(duì)細(xì)胞周期的抑制作用
主要試驗(yàn)材料:二氫楊梅素(Dihydromyrictin, DHM, Sigma)溶解于二甲亞砜(DMSO)中，配制成50 mM濃縮液，-20 °C保存，使用時(shí)分別稀釋為10，20，30，和40 μΜ，即配即
用；細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡試劑盒(碧云天)。
[0024]試驗(yàn)方法:將細(xì)胞消化，離心并重懸浮于相應(yīng)培養(yǎng)液中，以3X IO5/皿的密度種植于60 mm培養(yǎng)皿中，置于37 °C，5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移除原培養(yǎng)液，加入新鮮配制的，分別含有10，20，和30 μ M DHM的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后終止培養(yǎng)，按細(xì)胞周期與細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，流式細(xì)胞儀檢測(cè)。
[0025]試驗(yàn)結(jié)果:結(jié)果顯示，DHM對(duì)不同類(lèi)型的白血病細(xì)胞均有細(xì)胞分裂周期的阻滯作用，從而使細(xì)胞不能順利分裂增殖。但是，不同細(xì)胞型在DHM作用下會(huì)被阻滯在細(xì)胞周期的不同時(shí)期。對(duì)于早幼粒白血病細(xì)胞HL-60，DHM的作用可有效將其細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期(圖2);對(duì)于急性淋巴瘤細(xì)胞系U937和慢性髓源白血病細(xì)胞系K562，DHM對(duì)其周期的阻滯作用則主要發(fā)生在S期(圖3，4)。[0026]實(shí)施例2 二氫楊梅素對(duì)白血病細(xì)胞的繼續(xù)分化作用 一、背景簡(jiǎn)介
細(xì)胞分化受阻是克隆性白血病的致病原因之一。分化受阻使得大量低分化，無(wú)正常功能的細(xì)胞在血液中大量增殖，從而導(dǎo)致機(jī)體功能異常。通過(guò)藥物作用使白血病患者血液中低分化的病變細(xì)胞能夠繼續(xù)分化成為分化程度較高的功能性細(xì)胞，從而降低其無(wú)限增殖的能力，并產(chǎn)生正常的細(xì)胞功能，是治療白血病的有效方法之一。
[0027]⑶11和⑶14是細(xì)胞表面的抗原標(biāo)志物，它們的表達(dá)量與細(xì)胞的分化程度呈正相關(guān)，即:未分化細(xì)胞的CDll和CD14表達(dá)量較低，已分化的功能性細(xì)胞，其表面的CDll和CD14增高。
[0028]細(xì)胞分化過(guò)程耗氧量增加，磷酸已糖旁路代謝活動(dòng)增強(qiáng)，葡萄糖-6-磷酸氧化脫氫。此時(shí)若向其中加入硝基四氮唑藍(lán)(NBT)，NBT中的四氮唑基可接受葡萄糖-6-磷酸脫下的氫，生成甲脘基使原先呈淡黃色的NBT還原生成點(diǎn)狀或塊狀的藍(lán)紫色沉淀，通過(guò)檢測(cè)其吸光度的變化，即可判定細(xì)胞是否處于分化階段。
[0029]本試驗(yàn)證明二氫楊梅素可有效地提高白血病細(xì)胞表面⑶11和⑶14的表達(dá)量，并并增強(qiáng)白血病細(xì)胞中磷酸已糖旁路代謝活動(dòng)，促進(jìn)白血病細(xì)胞從低分化狀態(tài)逐漸向功能性細(xì)胞分化，從而減少對(duì)機(jī)體的損害，達(dá)到治療白血病的作用。
[0030]二、二氫楊梅素對(duì)⑶11和⑶14表達(dá)的影響
細(xì)胞系:本試驗(yàn)使用三種不同類(lèi)型的白血病細(xì)胞系:早幼粒白血病細(xì)胞HL-60 ;急性淋巴瘤細(xì)胞系U937和慢性髓源白血病細(xì)胞系K562。
[0031]主要試驗(yàn)材料:DHM，溶解于二甲亞砜(DMSO)中，配制成50mM濃縮液，-20 °〇保存，使用時(shí)分別稀釋為10，20和30 μ M，即配即用；CD11, CD14流式抗體(BD Pharmingen)；Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium (eBioscience) ;PBS ;60mm 培養(yǎng)皿，流式專(zhuān)用
上樣管。
[0032]試驗(yàn)方法:將細(xì)胞消化成細(xì)胞懸液后，以合適的密度鋪于60 mm培養(yǎng)皿中，于37°C, 5 % CO2培養(yǎng)箱中孵育約24 h，待細(xì)胞生長(zhǎng)至占培養(yǎng)皿底部50%左右時(shí)，移除原培養(yǎng)液，加入新鮮配制的，分別含有5，10，20 μ M DHM的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后小心收集上清液并使用Accutase-Enzyme Cell Detachment Medium消化細(xì)胞,將細(xì)胞懸液與上清液混合離心，將收集到的細(xì)胞用4°C預(yù)冷的PBS洗滌兩次，調(diào)整細(xì)胞濃度至106/100 μ L，加入抗體，避光孵育20 min，用冷PBS洗去多余抗體，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CDll和CD14的表達(dá)量變化。
[0033]試驗(yàn)結(jié)果:在流式圖像上，峰的右移表示熒光增強(qiáng)，進(jìn)一步代表抗原的表達(dá)升高。在本試驗(yàn)中，無(wú)論是HL-60，U937還是K562，在施加大于20 μ M DHM處理后，峰圖均有明顯的右移趨勢(shì)，說(shuō)明大于20 μ M劑量的DHM可有效誘導(dǎo)白血病細(xì)胞的分化(圖5~7)。
[0034]三、NBT法檢測(cè)二氫楊梅素對(duì)白血病細(xì)胞分化的作用 細(xì)胞系:本試驗(yàn)使用的細(xì)胞系為早幼粒白血病細(xì)胞HL-60
試驗(yàn)材料:DHM，溶解于二甲亞砜(DMSO)中，配制成50mM濃縮液，-20 °C保存，使用時(shí)分別稀釋為10，20和30 μ M，即配即用;硝基四氮唑藍(lán)(NBT，Sigma)溶于PBS中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%，4°C保存，配制后一周內(nèi)使用;胰酶(Gibco) ；PBS ；96孔板(Nunc)。
[0035]試驗(yàn)方法:將細(xì)胞消化，離心并重懸浮于相應(yīng)培養(yǎng)液中，以I X IO4/孔的密度種植于96孔板，置于37 °C, 5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，移除原培養(yǎng)液，加入新鮮配制的，分別含有5，10，20和30 μ M DHM的1640培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后終止培養(yǎng)，向每孔加入10 μ L ΝΒΤ，再重新置于37 °C, 5 % CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min后，取出3~5X IO5個(gè)細(xì)胞，離心后加入DMSO混勻，酶標(biāo)儀OD 570nm處檢測(cè)各孔的吸光值。每個(gè)濃度設(shè)置三個(gè)重復(fù)組。[0036] 試驗(yàn)結(jié)果:結(jié)果顯 示隨著DHM處理劑量的增加，各組細(xì)胞的分化程度依次增高。說(shuō)明DHM可有效誘導(dǎo)低分化的白血病細(xì)胞進(jìn)行進(jìn)一步的分化，從而達(dá)到治療白血病的目的(圖 8)。
【權(quán)利要求】
1.一種二氫楊梅素在促進(jìn)失去正常分化能力的白血病細(xì)胞繼續(xù)分化的藥物中的應(yīng)用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的白血病細(xì)胞繼續(xù)分化表現(xiàn)為提高CDll和CD14的表達(dá)量。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的內(nèi)容，其特征在于所述的白血病細(xì)胞繼續(xù)分化表現(xiàn)為二氫楊梅素可以增強(qiáng)白 血病細(xì)胞中的磷酸已糖旁路代謝活動(dòng)，加速葡萄糖-6-磷酸的氧化脫氫。
【文檔編號(hào)】A61P35/02GK103933026SQ201310440537
【公開(kāi)日】2014年7月23日 申請(qǐng)日期:2013年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月25日
【發(fā)明者】朱潤(rùn)芝, 李明意, 夏娟, 劉潔, 張慶余, 劉斌 申請(qǐng)人:廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院