一種制備動物脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的方法及其制備的組織基質(zhì)材料的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物組織處理和組織基質(zhì)材料制備【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種制備動物脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的方法及其制備的組織基質(zhì)材料。采用本發(fā)明方法制備的組織基質(zhì)材料保留了組織細(xì)胞外基質(zhì)原有的基本支架結(jié)構(gòu)、主要生物化學(xué)成分和生物力學(xué)強度；有效去除了動物組織中會引起人體免疫排異反應(yīng)的抗原；改進(jìn)了組織基質(zhì)的柔韌性、懸垂性和傷口曲面整合性能；制備的動物真皮基質(zhì)同人體皮膚相近，不會引起組織基質(zhì)中膠原蛋白和其他蛋白質(zhì)交聯(lián)、降解或變性，脫細(xì)胞的組織真皮保有天然真皮組織基質(zhì)的生物完整性，可用于病變和缺省組織的修復(fù)修補。
【專利說明】一種制備動物脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的方法及其制備的組織基質(zhì)材料
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物組織處理和組織基質(zhì)材料制備【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及制備動物脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的方法及其制備的脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料。
【背景技術(shù)】
[0002]人體和許多動物組織器官的細(xì)胞外基質(zhì)有極大的相似性和同源性。由同種異體或異種異體組織器官脫細(xì)胞制成的生物基質(zhì)材料，已經(jīng)成功地用于臨床醫(yī)學(xué)人體組織修補和修復(fù)。脫細(xì)胞的組織器官基質(zhì)也廣泛地應(yīng)用于各種組織工程試驗和再生醫(yī)學(xué)研究，例如除去動物組織器官的原有細(xì)胞成分，在體外通過人體細(xì)胞使具有三維框架結(jié)構(gòu)的組織器官基質(zhì)再次細(xì)胞化和功能化，最終生產(chǎn)可移植到人體的組織器官。
[0003]組織器官基質(zhì)是由各種復(fù)雜的結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)和功能蛋白質(zhì)構(gòu)成的三維立體框架，并含有許多有活性的其他復(fù)合物。主要成分包括膠原纖維、糖蛋白、黏蛋白等，其他成分有氨基葡聚糖(透明質(zhì)酸、硫酸軟骨素)等糖類、一些脂質(zhì)和生長因子。良好的組織器官基質(zhì)具有合適的生物力學(xué)強度，在植入宿主后，基質(zhì)材料提供初始的生物力學(xué)支持，通過與宿主細(xì)胞相互作用來調(diào)節(jié)細(xì)胞的行為(如粘附，遷移，增殖和分化)，隨著宿主細(xì)胞的長入，組織器官基質(zhì)本身逐步降解和轉(zhuǎn)化成新的組織。
[0004]目前，全世界有近三十 種組織器官衍生而來的基質(zhì)材料已被用在組織修復(fù)和再生的各種臨床醫(yī)療中。這些產(chǎn)品的組織器官原料來自人類和多種哺乳動物的組織，包括血管，心臟瓣膜，韌帶，神經(jīng)，皮膚，小腸黏膜，前胃，心包，腹膜，肌腱和膀胱等。
[0005]制備組織器官基質(zhì)的工藝流程十分復(fù)雜，包括組織器官的采集、保存、清洗、消毒、脫細(xì)胞、降低抗原性、病毒滅活和終端滅菌等過程?，F(xiàn)有的制備組織器官基質(zhì)的方法有多種，根據(jù)其脫細(xì)胞的作用原理可分為物理、化學(xué)、酶學(xué)等方法。最常用的脫細(xì)胞方法是物理和化學(xué)處理相結(jié)合的方法。包括用攪拌或超聲波，機(jī)械按摩或加壓，凍結(jié)和解凍來破壞細(xì)胞膜，使細(xì)胞成分釋放出來，更利于后續(xù)的化學(xué)洗滌劑的脫細(xì)胞清洗。物理方法本身一般不足以實現(xiàn)完全的脫細(xì)胞。酶學(xué)處理方法，如某些胰蛋白酶，可調(diào)節(jié)組織胞外基質(zhì)的松緊度，切斷細(xì)胞表面和組織胞外基質(zhì)的聯(lián)系。使用不同的工藝流程和方法，細(xì)胞去除效率和對組織器官基質(zhì)的影響或損傷也不一樣。組織器官的采集、保存、清洗、消毒和脫細(xì)胞處理工藝，除了方法本身直接對組織器官基質(zhì)的損傷外，也還會影響到隨后的加工過程。各項處理會不同程度地影響改變組織器官基質(zhì)生物化學(xué)組成成分，三維立體框架的超微結(jié)構(gòu)和生物力學(xué)性能，這些改變會影響宿主對植入基質(zhì)材料的反應(yīng)。臨床前動物試驗和人類臨床應(yīng)用證據(jù)表明，各種組織器官基質(zhì)產(chǎn)品之間在組織修復(fù)和再生性能方面的差異很大，制備過程中組織器官基質(zhì)特性的改變是導(dǎo)致各種產(chǎn)品臨床效果差異的最主要原因之一。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，一方面提供了一種制備動物脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的方法，其包括如下步驟:
[0007]1、收集動物組織原材料，清洗血液和其它污垢，切割成長、寬和高為所需規(guī)格尺寸的組織材料，低溫保存；
[0008]2、緩慢解凍，在含有慶大霉素的生理鹽水中復(fù)水；
[0009]3、組織材料在中度堿性溶液中消毒滅菌，無菌純水漂洗，酸堿度調(diào)到中性；
[0010]4、脫細(xì)胞，清洗；
[0011]5、分解動物組織DNA成分，生理鹽水漂洗；
[0012]6、分解動物組織a -Gal抗原，高濃度氯化鈉溶液漂洗，生理鹽水漂洗；
[0013]7、病毒滅活，磷酸緩沖液漂洗；
[0014]8、無菌裝袋，密封；
[0015]9、終端滅菌處理。
[0016]在該方法中，采用酶學(xué)方法去除細(xì)胞成分、去除a -Gal抗原和增進(jìn)支架柔韌性。
[0017]在本發(fā)明的實施方案中，步驟I中的動物組織原材料選自皮膚，真皮，動脈，靜脈，胃，軟骨，半月板，小腸，大腸，隔膜，肌腱，韌帶，神經(jīng)組織，膀胱，尿道和輸尿管。
[0018]在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，步驟I中清洗血液和其它污垢采用純凈水，使用物理方法或超聲波進(jìn)行洗滌。
[0019]在制備組織基質(zhì)材料的工藝方法中，涉及豬真皮原料低溫保存的步驟，其中降溫和升溫的速度是非常重要的參數(shù)。降升溫的速度過快或組織間不均勻，可導(dǎo)致組織局部地區(qū)出現(xiàn)微小裂痕，使用時組織基質(zhì)容易撕裂。
[0020]在本發(fā)明的實施方案中，步驟I中的組織材料優(yōu)選在平均速率不大于每分鐘1.0攝氏度降溫至-40攝氏度以下進(jìn)行保存，更加優(yōu)選降溫速度為每分鐘0.5攝氏度。步驟2中低溫保存的組織材料在5?12攝氏度環(huán)境下緩慢解凍，以避免因升溫過快導(dǎo)致組織產(chǎn)生裂痕。待冰全部溶化后，步驟2中融化的組織材料在每升含有100毫克慶大霉素的生理鹽水中復(fù)水3?6小時。
[0021]在本發(fā)明一個優(yōu)選的實施方案中，步驟I中的低溫保存為長期保存，其方法是將豬真皮材料平放在一塊面積稍大的棉紗布、紙張、塑料膜、尼龍網(wǎng)或其它布織品保護(hù)層上，將真皮和上述保護(hù)層卷成一個多層同心卷或形成真皮和保護(hù)層交替的多層包裝形態(tài)，放入塑料袋中，密封后放入-80或-40攝氏度凍箱中保存。
[0022]本發(fā)明的制備方法中，涉及豬真皮原料的初始消毒滅菌?，F(xiàn)有的方法包括使用次氯酸鈉，過氧乙酸，雙氧水，碘溶液和高濃度氫氧化鈉(酸堿度13以上)。這些溶液處理后，組織基質(zhì)受到不同程度上的破壞，尤其是氫氧化鈉、次氯化鈉和碘溶液的影響更大。
[0023]同已有方法中原材料消毒和滅菌技術(shù)不同。在本發(fā)明的實施方案中，步驟3中所述的中度堿性溶液是酸堿度為10.5—11.5的碳酸氫鈉或氫氧化鈉或濃度為0.1%的氫氧化氨溶液，所述的消毒滅菌方法是將復(fù)水后的組織材料浸泡在上述中度堿性溶液中，緩慢搖動浸泡24?48小時，避免了組織基質(zhì)的損傷。
[0024]在本發(fā)明的實施方案中，步驟4中所述的脫細(xì)胞方法為經(jīng)消毒滅菌和漂洗后的組織材料在2.0毫摩爾濃度氯化鈣，2.0毫摩爾濃度氯化鎂和每升100毫克慶大霉素的生理鹽水中在室溫先漂洗I?3小時，然后加入分散酶`溶液洗脫細(xì)胞。
[0025]在一個優(yōu)選的實施方案中，所述的分散酶溶液是中性分散酶溶液，每升含I一20毫摩爾的氯化鈣，1-20毫摩爾氯化鎂和50—400單位的分散酶，所述分散酶溶液洗脫細(xì)胞的方法是把組織材料浸泡在所述分散酶溶液中，在37攝氏度緩慢搖動浸泡24?36小時。中性分散酶溶液中更加優(yōu)選每升含2.0毫摩爾的氯化鈣，2.0毫摩爾氯化鎂和100— 200單位的分散酶。
[0026]在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，步驟4中完成脫細(xì)胞之后，進(jìn)行清洗步驟。所述的清洗包括第一洗滌劑清洗和第二洗滌劑清洗，所述第一洗滌劑溶液是溶于羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖溶液(酸堿度7.0?8.0)中的0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，清洗方法是把組織材料浸泡在第一洗滌劑溶液中，在37攝氏度緩慢搖動浸泡12?18小時。所述第二洗滌劑溶液是溶于磷酸緩沖溶液(酸堿度7.2?7.8)中的1.0%脫氧膽酸鈉溶液，清洗方法是把組織材料浸泡在二洗滌劑溶液中，在室溫緩慢搖動浸泡24?36小時。同時，本發(fā)明也可采用其他合適的洗滌劑，如吐溫-20、叔辛基苯氧基聚乙烯乙氧基乙醇和3-[(3_膽固醇氨丙基)二甲基氨基]-1-丙磺酸等。
[0027]在本發(fā)明的實施方案中，在第一洗滌劑和第二洗滌劑浸泡后，在進(jìn)行步驟5之前，采用20mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖溶液(酸堿度7.0?8.0之間)在室溫下漂洗三次，每次2?4小時。
[0028]由于動物組織DNA的存在，組織基質(zhì)在植入人體后容易引起炎癥反應(yīng)。除人類和舊世紀(jì)猴外，其它哺乳動物的體內(nèi)都含有由α-1,3-半乳糖殘基[Gala (l，3)Gal]的雙糖末端的糖蛋白或糖脂組成的a-Gal抗原。豬組織中的a-Gal抗原,會引起免疫排斥反應(yīng)。消除或克服炎癥反應(yīng)和排斥反應(yīng)的方法之一是使用特異性的酶學(xué)處理去除動物組織基質(zhì)中DNA和a -Gal抗原。
[0029]在本發(fā)明的實施 方案中，步驟5中所述的分解動物組織DNA成分是通過加入脫氧核糖核酸酶溶液完成的，所述的脫氧核糖核酸酶溶液的配方是向每升IOOmM的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液(酸堿度7.2)中加入2.0毫摩爾濃度的氯化鈣，2.0毫摩爾濃度氯化鎂和5000酶單位脫氧核糖核酸酶，降解去除動物組織DNA的方法是把組織材料浸泡在上述脫氧核糖核酸酶溶液中，在37攝氏度緩慢搖動處理18?28小時，然后用放入生理鹽水在室溫漂洗兩次，每次I?3小時。
[0030]在本發(fā)明的實施方案中，步驟6中所述的分解動物組織a -Gal抗原是通過加入α -半乳糖苷酶溶液完成的，所述的α -半乳糖苷酶溶液的配方是向每升IOmM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖溶液(酸堿度7.0?8.0之間)中加入2.0mM的氯化鈣，2.0mM氯化鎂和400GALU單位的α -半乳糖苷酶，分解動物組織a -Gal抗原的方法是把組織材料浸泡在上述α -半乳糖苷酶溶液中，在37攝氏度緩慢搖洗24?36小時。
[0031]在制備可移植到人體的組織基質(zhì)時，有必要去除各種酶的殘留。為達(dá)到上述目的，在本發(fā)明的實施方案中，選用了鹽析法進(jìn)行清洗，步驟6中所述的高濃度氯化鈉溶液是2—5%的氯化鈉溶液，漂洗方法是把組織材料浸泡在上述氯化鈉溶液中，在室溫清洗兩次，每次2?4小時。在一個更加優(yōu)選的實施方案中，高濃度氯化鈉溶液優(yōu)選3%的氯化鈉溶液。此外，氯化鈉溶液也可用其它中性鹽溶液代替，如氯化鉀、氯化鎂和氯化鋰等。
[0032]為了進(jìn)一步增加產(chǎn)品的安全性，在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，還涉及病毒滅活處理，步驟(7)中所述的病毒滅活試劑是雙氧水和過氧乙酸，方法是把組織材料浸泡在含有
0.01?0.10%雙氧水，0.05?0.50%乙酸和0.05?0.50%過氧乙酸的溶液中，在室溫中緩慢搖洗2?3小時。在更加優(yōu)選的方案中，選用含有0.02%雙氧水、0.15%乙酸和0.10%過氧乙酸滅活病毒，2?3小時可以減少病毒數(shù)目10的6次方以上。雙氧水、乙酸和過氧乙酸的濃度可以隨細(xì)菌數(shù)量改變，增加或減少。
[0033]在本發(fā)明的實施方案中，在步驟7的病毒滅活后，在室溫下用中性磷酸緩沖液漂洗三次，每次2?4小時，以去除雙氧水、乙酸和過氧乙酸的殘留。
[0034]組織產(chǎn)品的終端滅菌處理，常常是對組織材料破壞最大的步驟之一。為此，在本發(fā)明的實施方案中，步驟9中采用了低溫輻射進(jìn)行處理。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，在-40攝氏度條件下，采用10 — 50kGy伽瑪射線進(jìn)行產(chǎn)品的終端滅菌處理，大大減少了對組織材料的破環(huán)。在一些優(yōu)選的實施方案中，輻射劑量根據(jù)組織基質(zhì)中細(xì)菌數(shù)量進(jìn)行改變，增加或減少。在一個更加優(yōu)選的實施方案中，采用20?30kGy的伽瑪射線進(jìn)行產(chǎn)品的終端滅菌處理。
[0035]在一些替代性的實施方案中，除輻射終端滅菌方法外，本發(fā)明還可以將組織基質(zhì)凍干，改用環(huán)氧乙烷氣體進(jìn)行滅菌。
[0036]在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方案中，步驟4 (酶脫細(xì)胞)、步驟5 (酶分解DNA)和步驟6 (酶分解α-1，3-半乳糖殘基抗原)的先后順序可以根據(jù)實際需要進(jìn)行調(diào)整變更。例如，可以先分解α-1，3-半乳糖殘基抗原，然后脫細(xì)胞和分解動物DNA成分；或者先分解動物DNA，接著分解抗原和最后脫細(xì)胞處理。
[0037]此外，在一些替代的實施方案中，如選用已用遺傳工程改良的無a-Gal抗原的動物，只需使用脫氧核糖核酸酶。同時，為了減少不利的對細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解的作用，處理時對分散酶濃度，溫度和時間要加以監(jiān)測和優(yōu)化。在工藝流程中，還可以加入特定的酶抑制齊U，例如用乙二胺四乙酸，用以抑制分散酶的活性。
[0038]本發(fā)明另一方面還涉及由本發(fā)明上述方法制備得到的動物脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料，其中采用的動物真皮原材料可以`包括帶有基膜的真皮，也可以包括除去基膜的真皮。
[0039]在本發(fā)明制備脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的方法中，涉及一系列處理動物皮膚組織和制備組織器官基質(zhì)的步驟以及多項生物化學(xué)溶液及配方。通過上述步驟和溶液所制備得到的真皮組織基質(zhì)材料，保留了組織細(xì)胞外基質(zhì)原有的基本支架結(jié)構(gòu)、主要生物化學(xué)成分和生物力學(xué)強度；有效去除了動物組織中會引起人體免疫排異反應(yīng)的抗原；改進(jìn)了組織基質(zhì)的柔韌性、懸垂性和傷口曲面整合性能，制備的動物真皮基質(zhì)同人體皮膚相近，不會引起組織基質(zhì)中膠原蛋白和其他蛋白質(zhì)交聯(lián)、降解或變性，脫細(xì)胞的組織真皮保有天然真皮組織基質(zhì)的生物完整性。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0040]圖1:組織切片分析圖。
[0041]A:新鮮豬真皮HE染色切片；
[0042]B:處理后真皮基質(zhì)HE染色切片；
[0043]C:新鮮豬真皮α -1, 3半乳糖殘基抗原免疫化學(xué)染色切片；
[0044]D:處理后真皮基質(zhì)α -1, 3半乳糖殘基抗原免疫化學(xué)染色切片。
[0045]圖2:組織切片分析圖。
[0046]A, B,C:I型膠原蛋白免疫化學(xué)染色切片；[0047]D, E,F:III型膠原蛋白免疫化學(xué)染色切片；
[0048]A，D:負(fù)染；
[0049]B, E:未處理鮮豬真皮正染；
[0050]C，F(xiàn):處理后組織真皮基質(zhì)。
[0051]圖3:脫細(xì)胞組織基質(zhì)在終端伽瑪射線輻射滅菌后抗膠原蛋白酶水解的特性圖。
[0052]圖4:脫細(xì)胞組織基質(zhì)植入大鼠皮下兩周后寄主細(xì)胞生長進(jìn)入和新血管形成的HE染色圖。
【具體實施方式】
[0053]下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明，旨在用于說明本發(fā)明而非限定本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn)和修飾，這些改進(jìn)和修飾也同樣落入本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0054]實施例1:動物脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的制備及性能檢測
[0055]1、制備
[0056]( I)組織器官的采集和保存
[0057]從剛屠宰的豬體身上收集新鮮豬皮，臨時保存在4攝氏度的冰箱中。機(jī)械拔毛后，取豬皮分層為約1.0毫米厚真皮，在負(fù)20攝氏度冰凍保存。
[0058](2)脫細(xì)胞`
[0059]真皮解凍后，先用生理鹽水沖洗二次，每次30分鐘。沖洗后的豬真皮浸泡在每升含100毫克慶大霉素的鹽水溶液中，溶液中另加入2.0毫摩爾濃度的氯化鈣，2.0毫摩爾濃度氯化鎂和每升150單位的中性分散酶，在37攝氏度處理24小時。
[0060](3)清洗
[0061]慶大霉素浸泡后，用0.5%的聚乙二醇辛基苯基醚溶液清洗真皮16小時。脫細(xì)胞清洗后先用生理鹽水沖洗二次，每次120分鐘。
[0062](4)分解DNA和去除α -1, 3半乳糖殘基抗原
[0063]每升溶液中再加入2.0毫摩爾濃度的氯化鈣，2.0毫摩爾濃度氯化鎂，5000單位脫氧核糖核酸酶和兩粒葛蘭素史克比諾藥片(含α-半乳糖苷酶)，在室溫中處理20小時。
[0064](5)病毒滅活
[0065]清洗后，用含有0.02%雙氧水，0.15%乙酸和0.10%過氧乙酸的溶液殺菌和病毒滅活2小時。
[0066](6)清洗和保存
[0067]最后用無菌生理鹽水沖洗至無聚乙二醇辛基苯基醚和酶殘留。處理后的真皮基質(zhì)暫時保存在6%的甘油溶液中。
[0068]2、性能檢測
[0069]測定表明，材料的抗拉強度為15.0±3.6兆帕斯卡(Ν=24);縫線強度為56±13牛頓(N=24);每100克濕重真皮基質(zhì)中含有24.2±2.9克真皮干物質(zhì)材料(N=15)。差示掃描量熱儀分析顯示組織基質(zhì)材料的起始變性溫度為58.0±0.4攝氏度(N=5)，焓變值為每克干重61.6±2.1焦耳(N=5)，同真皮原材料中自然態(tài)的真皮基質(zhì)無明顯差別，整個工藝過程對真皮基質(zhì)特性無明顯改變和損傷。組織切片分析表明細(xì)胞成分(如脫氧核糖核酸DNA)和基質(zhì)中的α-1，3半乳糖殘基抗原去除的干凈，具體參見圖1。I型和III型膠原蛋白免疫化學(xué)染色分析也顯示處理工藝對真皮基質(zhì)中膠原蛋白無損害，具體參見圖2。
[0070]實施例2:清洗和消毒真皮的適宜條件的確定
[0071]從豬體身上收集新鮮真皮，新鮮豬真皮分別在37攝氏度和酸堿度為10.6,11.5和
11.8的氫氧化鈉溶液中進(jìn)行處理。每公斤豬皮4升氫氧化鈉溶液，以磷酸緩沖液為對照。24小時后，測定每毫升溶液中的菌落形成單位。磷酸緩沖液中含有10.3±1.3對數(shù)菌落形成單位(LogCFU) (Ν=3);酸堿度為10.6，11.5和11.8的溶液中，對數(shù)菌落形成單位分別是
2.1±0.1，0和O。可見，中度堿液的消毒和殺菌作用明顯。用差示掃描量熱儀分析表明，酸堿度11.5以上損害組織基質(zhì)，組織基質(zhì)中蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性明顯下降。高酸堿度對組織基質(zhì)的損壞還表現(xiàn)在組織基質(zhì)不可逆的吸漲和硬化。本實施例確定了較為合適的清洗和消毒真皮的條件是調(diào)整酸堿度到10.5?11.5之間。
[0072]實施例3:動物脫 細(xì)胞組織基質(zhì)材料的制備及性能檢測
[0073]1、制備
[0074]( I)組織器官的采集和保存
[0075]從剛屠宰的豬體身上收集新鮮豬皮，臨時保存在4攝氏度的冰箱中。機(jī)械拔毛后，取豬皮分層為約1.0毫米厚真皮。
[0076](2)收集和清洗
[0077]1.0毫米厚的豬真皮在收集清洗后(見實施例一)，暫存于負(fù)80攝氏度凍箱中。
[0078](3)脫細(xì)胞
[0079]解凍后用5mM的羥乙基哌嗪乙硫磺酸溶液(pH7.4)沖洗，加入2.0mM氯化鈣和每毫升0.2單位的中性分散酶后，在37攝氏度處理18小時。
[0080](4)清洗
[0081]用1.0%的脫氧膽酸鈉溶液在37攝氏度清洗20小時。
[0082](5)分解DNA和α -1, 3半乳糖殘基抗原
[0083]用無菌生理鹽水沖洗120分鐘后，每升溶液中再加入2.0mM的氯化鈣和2.0mM氯化鎂，4000單位重組脫氧核糖核酸酶和200GALU單位綠色咖啡豆種子中提取的α -半乳糖苷酶，在37攝氏度處理24小時。
[0084](6)病毒滅活
[0085]無菌生理鹽水清洗后，用0.05%雙氧水，0.30%乙酸和0.20%過氧乙酸殺菌2小時。
[0086](7)清洗
[0087]用無菌生理鹽水沖洗至無脫氧膽酸鈉，重組脫氧核糖核酸酶和α -半乳糖苷酶殘
&3甶O
[0088](8)終端滅菌處理
[0089]處理后的真皮基質(zhì)保存在含12%甘油的無菌生理鹽水溶液中，用25kGy的伽瑪射線滅細(xì)菌。
[0090]2、性能檢測
[0091]經(jīng)帶有00型探針的軟硬度儀測定表明，未經(jīng)處理的豬真皮的柔軟度為40±8.6(N=24),脫細(xì)胞豬真皮的柔軟度為13.0±4.0 (N=25),人體真皮的柔軟度為14.2±6.1(N=40)。表明相對于未經(jīng)處理的豬真皮(硬得多)，脫細(xì)胞處理后的豬真皮基質(zhì)的柔軟度同人體真皮組織在統(tǒng)計上無明顯差異。表面本發(fā)明的方法改進(jìn)了組織基質(zhì)的柔韌性，懸垂性和傷口曲面整合性能。
[0092]組織切片分析表明，生產(chǎn)的組織基質(zhì)中的α -1, 3半乳糖殘基抗原已被干凈的去除，染色成陰性，無抗原的表達(dá)。用QuantiT-PicoGreen熒光染料法測定DNA含量，結(jié)果表明新鮮豬真皮每克含有約84.0±10.2微克DNA (Ν=3),清洗消毒后的豬真皮每克含有62.9±9.5微克DNA (Ν=3)，脫細(xì)胞處理和清洗后組織基質(zhì)每克只含有1.9± 1.1微克DNA(Ν=3),動物DNA含量平均減少97.7%。差示掃描量熱儀分析顯示組織基質(zhì)材料的起始變性溫度為54.7±0.2攝氏度(Ν=3)，焓變值為每克干重59.5±3.1焦耳(Ν=3)。同豬真皮原材料中自然態(tài)的真皮比，起始變性溫度只下降3.3攝氏度，焓變值無明顯差別，說明整個制備過程(包括終端伽瑪射線輻射滅菌)對組織基質(zhì)特性無明顯改變和損傷。
[0093]用羥脯氨酸法測定組織基質(zhì)中膠原蛋白的含量，經(jīng)終端伽瑪射線輻射滅菌后的豬皮組織基質(zhì)含有91.0±3.0% (Ν=6)的膠原蛋白。用Fastin染色法測定彈性蛋白含量，經(jīng)終端伽瑪射線輻射滅菌后的組織基質(zhì)含有0.92±0.21% (Ν=6)的彈性蛋白，同未處理的豬真皮材料比，下降了 71.4%。
[0094]脫細(xì)胞組織基質(zhì)抗膠原蛋白酶水解的特性，可用于研究在終端伽瑪射線輻射滅菌后，本發(fā)明制備的脫細(xì)胞組織基質(zhì)中膠原蛋白的穩(wěn)定性。制備脫細(xì)胞組織基質(zhì)放入每毫升含有5個膠原酶單位的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸溶液中(10mM，酸堿度7.5)，在37攝氏度中培養(yǎng)長達(dá)64小時。結(jié)果顯示同未處理的豬真皮材料比，用本發(fā)明方法制備的脫細(xì)胞組織基質(zhì)在終端伽瑪射線輻射滅菌后，抗膠原蛋白酶水解的性能沒有改變，具體參見附圖3。
[0095]用本發(fā)明方法制備的脫細(xì)胞組織基質(zhì)的再細(xì)胞化特性，用大鼠(Rattusnorvegicus Lewis)做了動物評估實驗。大鼠((8例)麻醉后,用電動剪刀剃去背毛,用70%的酒精擦拭手術(shù)部位，在 背面上下和左右切開個單獨的切口，形成小口袋，大小以容納IX I厘米的樣品(?I毫米厚)為宜。將組織基質(zhì)樣品植入皮下。手術(shù)后，如果大鼠表現(xiàn)出疼痛的跡象，用丁丙諾啡(0.05毫克/千克)止痛。兩周后犧牲大鼠，取出植入的組織基質(zhì)材料，用10%中性福爾馬林溶液固定。通過組織切片方法來觀查大鼠寄主細(xì)胞進(jìn)入和血管生長。結(jié)果表明兩周內(nèi)就有大量寄主細(xì)胞生長進(jìn)入組織基質(zhì)材料，并開始產(chǎn)生新血管，沒有觀查到不良反應(yīng)，具體參見附圖4。
【權(quán)利要求】
1.一種制備動物脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料的方法，其包括如下步驟: (O收集動物組織原材料，清洗血液和其它污垢，切割成長、寬和高為所需規(guī)格尺寸的組織材料，低溫保存； (2)緩慢解凍，在含有慶大霉素的生理鹽水中復(fù)水； (3)組織材料在中度堿性溶液中消毒滅菌，無菌純水漂洗，酸堿度調(diào)到中性； (4)脫細(xì)胞，清洗； (5)分解動物組織DNA成分，生理鹽水漂洗； (6)分解動物組織α-1, 3-半乳糖殘基抗原(a -Gal抗原)，高濃度氯化鈉溶液漂洗，生理鹽水漂洗； (7)病毒滅活，磷酸緩沖液漂洗； (8)無菌裝袋,密封； (9)終端滅菌處理； 其特征在于，采用酶學(xué)方法去除細(xì)胞成分、去除a -Gal抗原和增進(jìn)支架柔韌性。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所 述的方法，其中步驟(I)中的動物組織原材料選自皮膚，真皮，動脈，靜脈，胃，軟骨，半月板，小腸，大腸，隔膜，肌腱，韌帶，神經(jīng)組織，膀胱，尿道和輸尿管。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(I)中清洗血液和其它污垢采用純凈水，使用物理方法或超聲波進(jìn)行洗滌。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(I)中的組織材料在平均速率不大于每分鐘1.0攝氏度降溫至-40攝氏度以下進(jìn)行保存，優(yōu)選降溫速度為每分鐘0.5攝氏度。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(I)中的低溫保存為長期保存，其方法是將豬真皮材料平放在一塊面積稍大的棉紗布、紙張、塑料膜、尼龍網(wǎng)或其它布織品保護(hù)層上，將真皮和上述保護(hù)層卷成一個多層同心卷或形成真皮和保護(hù)層交替的多層包裝形態(tài)，放入塑料袋中，密封后放入-80或-40攝氏度凍箱中保存。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(2)中低溫保存的組織材料在5?12攝氏度環(huán)境下緩慢解凍。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(2)中融化的組織材料在每升含有100毫克慶大霉素的生理鹽水中復(fù)水。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(3)中所述的中度堿性溶液是酸堿度為10.5—11.5的碳酸氫鈉或氫氧化鈉或濃度為0.1%的氫氧化氨溶液，所述的消毒滅菌方法是將復(fù)水后的組織材料浸泡在上述中度堿性溶液中，緩慢搖動浸泡24?48小時。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(4)中所述的脫細(xì)胞方法為經(jīng)消毒滅菌和漂洗后的組織材料在2.0毫摩爾濃度氯化鈣，2.0毫摩爾濃度氯化鎂和每升100毫克慶大霉素的生理鹽水中在室溫先漂洗I?3小時，然后加入分散酶溶液洗脫細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其中所述的分散酶溶液是中性分散酶溶液，每升含1-20毫摩爾的氯化鈣，1-20毫摩爾氯化鎂和50— 400單位的分散酶，所述分散酶溶液洗脫細(xì)胞的方法是把組織材料浸泡在所述分散酶溶液中，在37攝氏度緩慢搖動浸泡24?36小時，中性分散酶溶液中優(yōu)選每升含2.0毫摩爾的氯化鈣，2.0毫摩爾氯化鎂和100—200單位的分散酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(4)中所述的清洗包括第一洗滌劑清洗和第二洗滌劑清洗，所述第一洗滌劑溶液是溶于羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖溶液(酸堿度7.0?.8.0)中的0.5%聚乙二醇辛基苯基醚，清洗方法是把組織材料浸泡在第一洗滌劑溶液中，在.37攝氏度緩慢搖動浸泡12?18小時；所述第二洗滌劑溶液是溶于磷酸緩沖溶液(酸堿度.7.2?7.8)中的1.0%脫氧膽酸鈉溶液，清洗方法是把組織材料浸泡在二洗滌劑溶液中，在室溫緩慢搖動浸泡24?36小時。
12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中在第一洗滌劑和第二洗滌劑浸泡后，在進(jìn)行步驟(5)之前，用20mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖溶液(酸堿度7.0?8.0之間)在室溫下漂洗三次，每次2?4小時。
13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(5)中所述的分解動物組織DNA成分是通過加入脫氧核糖核酸酶溶液完成的，所述的脫氧核糖核酸酶溶液的配方是向每升IOOmM的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸緩沖溶液(酸堿度7.2)中加入2.0毫摩爾濃度的氯化鈣，2.0毫摩爾濃度氯化鎂和5000酶單位脫氧核糖核酸酶，降解去除動物組織DNA的方法是把組織材料浸泡在上述脫氧核糖核酸酶溶液中，在37攝氏度緩慢搖動處理18?28小時，然后放入生理鹽水在室溫漂洗兩次，每次I?3小時。
14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(6)中所述的分解動物組織a-Gal抗原是通過加入α-半乳糖苷酶溶液完成的，所述的α-半乳糖苷酶溶液的配方是向每升IOmM的輕乙基哌嗪乙硫磺酸緩沖溶液(酸堿度7.0?8.0之間)中加入2.0mM的氯化|丐，2.0mM氯化鎂和400GALU單位的α -半乳糖苷酶，分解動物組織a -Gal抗原的方法是把組織材料浸泡在上述α -半乳糖苷酶溶液中，在37攝氏度緩慢搖洗24?36小時。
15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(6)中所述的高濃度氯化鈉溶液是2—5%的氯化鈉溶液，漂洗方法是把組織材料浸泡在上述氯化鈉溶液中，在室溫清洗兩次，每次2?4小時，高濃度氯化鈉溶液優(yōu)選3%的氯化鈉溶液。
16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(7)中所述的病毒滅活試劑是雙氧水和過氧乙酸，方法是把組織材料浸泡在含有0.01?0.10%雙氧水，0.05?0.50%乙酸和0.05?.0.50%過氧乙酸的溶液中，在室溫中緩慢搖洗2?3小時。
17.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(7)中病毒滅活后，在室溫下用中性磷酸緩沖液漂洗三次，每次2?4小時，以去除雙氧水、乙酸和過氧乙酸的殘留。
18.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(9)中所述的終端滅菌處理是采用低溫伽瑪射線輻射或環(huán)氧乙烷氣體進(jìn)行滅菌處理，伽瑪射線的處理劑量優(yōu)選為10 — 50kGy。
19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中步驟(4)、步驟(5)和步驟(6)的先后順序可以根據(jù)實際需要進(jìn)行調(diào)整變更。
20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，在選用已用遺傳工程改良的無a-Gal抗原的動物組織原材料時，無需進(jìn)行第(6)步驟而直接進(jìn)行第(7)步驟。
21.由權(quán)利要求1-20中任一項所述的方法制備得到的動物脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料。
22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的動物脫細(xì)胞組織基質(zhì)材料，其中采用的動物真皮原材料包括帶有基膜的真皮和除去基膜的真 皮。
【文檔編號】A61L27/36GK103432627SQ201310376619
【公開日】2013年12月11日 申請日期:2013年8月26日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月26日
【發(fā)明者】劉志剛, 劉新華 申請人:北京瑞健高科生物科技有限公司