一種治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑的制作方法
【專利摘要】一種治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑，主要成分包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯和維生素E；油溶性的維生素E與1體積的食用油溶液混合，水溶性的EGCG和2體積的蒸餾水混合；上述兩種液體混合后，再加入質(zhì)量為所述食用油質(zhì)量10%的乳化劑，形成油水混懸液，EGCG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02-0.1%，維生素E的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：對D-半乳糖誘導(dǎo)的阿爾茨海默病小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用，并可降低其腦內(nèi)Aβ1-40的沉積，通過升高抗氧化酶，降低氧化產(chǎn)物的抗氧化應(yīng)激作用及抗凋亡和抗炎作用來發(fā)揮其抗阿爾茨海默病作用。成分簡單、藥效明確、制備容易，能夠有效地發(fā)揮改善患者行為學(xué)和學(xué)習(xí)記憶功能的作用，且大劑量應(yīng)用時(shí)不會(huì)產(chǎn)生其它不良反應(yīng)。
【專利說明】一種治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及了一種治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑。
【背景技術(shù)】
[0002]阿爾茨海默病即老年癡呆癥，是一種進(jìn)行性發(fā)展的致死性神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。隨著老齡化速度的加快，阿爾茨海默病患者的人數(shù)將急劇增加，給家庭和社會(huì)帶來沉重的負(fù)擔(dān)，并逐漸上升為一種社會(huì)問題。因此，阿爾茨海默病的治療也成為了科學(xué)界亟待解決的大問題。
[0003]如今阿爾茨海默病的病因及發(fā)病機(jī)制尚未闡明，且至今沒有有效的治療方法，其特征性病理改變?yōu)榇竽X皮質(zhì)和海馬區(qū)的細(xì)胞外老年斑形成、細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)以及神經(jīng)元丟失伴膠質(zhì)細(xì)胞增生等。其中老年斑的主要成分為β淀粉樣蛋白，β淀粉樣蛋白的大量沉積是由β -淀粉樣肽前體蛋白在酶的作用下水解產(chǎn)生，并且通過氧化應(yīng)激、鈣超載和細(xì)胞調(diào)亡等方式啟動(dòng)了神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生退行性改變，出現(xiàn)阿爾茨海默病樣病變。此外，根據(jù)近些年對阿爾茨海默病發(fā)病機(jī)制的研究，阿爾茨海默病患者腦內(nèi)慢性炎癥反應(yīng)的發(fā)生也意味著阿爾茨海默 病可能是一種慢性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)含量最多的一種細(xì)胞，參與構(gòu)成了中樞神經(jīng)系統(tǒng)的微環(huán)境，在阿爾茨海默病的病變中起重要作用。膠質(zhì)纖維酸性蛋白是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異蛋白和骨架成分，其表達(dá)增強(qiáng)可以作為星形膠質(zhì)細(xì)胞被激活的一種標(biāo)志。
[0004]目前，用于阿爾茨海默病的臨床治療的常用藥物很多，依照其作用機(jī)制包括膽堿酯酶抑制劑、谷氨酸受體拮抗劑、吡拉西坦和其他草藥制劑等。但研究發(fā)現(xiàn)，這些治療措施雖然能夠短暫改善癥狀，但由于其自身的局限性而很難長期應(yīng)用，如臨床應(yīng)用的西藥在緩解癥狀的同時(shí)可能產(chǎn)生惡心、腹瀉和嘔吐等胃腸道不良反應(yīng)；中醫(yī)辨證的治療方法也因成分復(fù)雜而降低了藥物的安全性，因此研究開發(fā)新型有效的阿爾茨海默病治療藥物具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明目的是有效治療阿爾茨海默病，特提供一種治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑。
[0006]本發(fā)明提供了一種治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑，其特征在于:所述治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑的主要成分包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯和維生素E ；
[0007]油溶性的維生素E與I體積的食用油溶液混合，水溶性的EGCG和2體積的蒸餾水混合；上述兩種液體混合后,再加入質(zhì)量為所述食用油質(zhì)量10%的乳化劑，形成油水混懸液，EGCG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02-0.1%，維生素E的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%。
[0008]所述的表沒食子兒茶素沒食子酸酯為綠茶中提取的多酚成分或化學(xué)合成。
[0009]所述的乳化劑為大豆磷脂或卵磷脂。[0010]EGCG (epigallocatechin-3-gallate,(-)表沒食子兒茶素沒食子酸酯)是綠茶的一種主要多酚成分，具有抗氧化、抗癌、抗突變等活性，能夠保護(hù)細(xì)胞和DNA免受損害，并可通過抗神經(jīng)細(xì)胞氧化和凋亡改善與癡呆相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。維生素E (Vitamin E)是一種脂溶性維生素，又稱生育酚，由于VE能捕獲氧自由基使其成為最主要的抗氧化劑之一，在阿爾茨海默病相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞培養(yǎng)中，發(fā)現(xiàn)具有自由基代謝的神經(jīng)保護(hù)作用，還可能通過抑制和清除腦內(nèi)β -淀粉樣蛋白沉積，產(chǎn)生延緩衰老的作用。綜上，EGCG和VE因其有效的神經(jīng)保護(hù)作用，在阿爾茨海默病的治療過程中可能起到關(guān)鍵作用，目前國內(nèi)尚未有聯(lián)合應(yīng)用EGCG和VE在整體水平抗阿爾茨海默病方面的報(bào)道。因此，本發(fā)明擬用EGCG和VE合用組成復(fù)合制劑，并根據(jù)臨床有效劑量設(shè)計(jì)了幾組EGCG和VE合用的劑量，用D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠為對象，考察聯(lián)合使用EGCG和VE對D-半乳糖所致模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力的改善情況并對其進(jìn)行評價(jià)。
[0011]所述的治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑，對D-半乳糖誘導(dǎo)的阿爾茨海默病小鼠模型，分別應(yīng)用Morris水迷宮、被動(dòng)避暗試驗(yàn)、生化指標(biāo)檢測、免疫組織化學(xué)染色以及蛋白質(zhì)印跡法實(shí)驗(yàn)方法觀察不同劑量的EGCG和VE合用構(gòu)成的治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑對阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用及其抗氧化和抗炎作用。
[0012]本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn):
[0013]本發(fā)明所述的治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑，通過試驗(yàn)的結(jié)果證實(shí)，用EGCG和VE (EGCGl-5mg/kg+VE15mg/kg)合用組成的復(fù)合制劑對D-半乳糖誘導(dǎo)的阿爾茨海默病小鼠模型的學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用，并可降低其腦內(nèi)Aii1,的沉積，通過升高抗氧化酶(SOD、GSH-Px、CAT),降低氧化產(chǎn)物(MDA)的抗氧化應(yīng)激作用及抗凋亡和抗炎作用來發(fā)揮其抗阿爾茨海默病作用。
[0014]另外，與其它臨床中應(yīng)用的藥物相比，用EGCG和VE合用組成的復(fù)合制劑不但成分簡單、藥效明確、制備容易，能夠有效地發(fā)揮改善患者行為學(xué)和學(xué)習(xí)記憶功能的作用，且大劑量應(yīng)用時(shí)不會(huì)產(chǎn)生其它不良反應(yīng)，作為阿爾茨海默病患者日常生活中的用藥更具安全性，因此可以廣泛應(yīng)用于阿爾茨海默病的治療。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]下面結(jié)合附圖及實(shí)施方式對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的說明:
[0016]圖1為EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠水迷宮定向航行試驗(yàn)中尋找平臺(tái)潛伏期的影響示意圖，n=10 ；
[0017]圖2為EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠水迷宮定向航行試驗(yàn)中尋找平臺(tái)經(jīng)過路徑長度的影響示意圖，n=10 ；
[0018]圖3為EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠水迷宮空間探索試驗(yàn)中目的象限停留時(shí)間的影響示意圖，n=10 ；
[0019]圖4為EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠水迷宮空間探索試驗(yàn)中經(jīng)過原平臺(tái)所在位置的穿梭次數(shù)的影響示意圖，n=10 ；
[0020]圖5為EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠被動(dòng)避暗試驗(yàn)中避暗潛伏期的影響示意圖，n=10 ；
[0021] 圖6為EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠被動(dòng)避暗試驗(yàn)中明暗箱穿梭錯(cuò)誤次數(shù)的影響示意圖，n=10 ；
[0022]圖7為免疫組織化學(xué)染色法考察EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)APP沉積水平的影響示意圖；a:空白組；b:模型組；c:VE組；d =EGCG組；e:高EGCG+VE組；f:低EGCG+VE組；放大倍數(shù)均為400 X，n=3 ；
[0023]圖8為免疫組織化學(xué)染色法考察EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠腦海馬內(nèi)APP沉積水平的影響示意圖；a:空白組；b:模型組；c:VE組；d =EGCG組；e:高EGCG+VE組；f:低EGCG+VE組；放大倍數(shù)均為400 X，n=3 ；
[0024]圖9為免疫組織化學(xué)染色法考察EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)Αβ H0水平的影響示意圖；a:空白組；b:模型組；c:VE組；d =EGCG組；e:高EGCG+VE組；f:低EGCG+VE組；放大倍數(shù)均為400 X，n=3 ；
[0025]圖10為免疫組織化學(xué)染色法考察EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠腦海馬內(nèi)Αβ H0水平的影響示意圖；a:空白組；b:模型組；c:VE組；d =EGCG組；e:高EGCG+VE組；f:低EGCG+VE組；放大倍數(shù)均為400 X，n=3 ；
[0026]圖11為免疫組織化學(xué)染色法考察EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠腦皮質(zhì)內(nèi)GFAP水平的影響示意圖；a:空白組；b:模型組；c:VE組；d:EGCG組；e:高EGCG+VE組；f:低EGCG+VE組；放大倍數(shù)均為400 X，n=3 ；
[0027]圖12為免疫組織化學(xué)染色法考察EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠腦海馬內(nèi)GFAP水平的影響示意圖；a:空白組；b:模型組；c:VE組；d:EGCG組；e:高EGCG+VE組；f:低EGCG+VE組；放大倍數(shù)均為400 X，n=3 ；
[0028]圖13為EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠皮質(zhì)中微量丙二醛(MDA)水平的影響示意圖，n=4 ；
[0029]圖14為EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠皮質(zhì)中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平的影響不意圖，n=4 ；
[0030]圖15為EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠皮質(zhì)中總超氧化物歧化酶(T-S0D)水平的影響示意圖，n=4 ；
[0031]圖16為EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠皮質(zhì)中過氧化氫酶(CAT)水平的影響示意圖，n=4 ；
[0032]圖17為蛋白質(zhì)印跡法考察EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠皮質(zhì)中APP蛋白表達(dá)水平的影響示意圖，n=3 ；
[0033]圖18為蛋白質(zhì)印跡法考察EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠皮質(zhì)中Αβ蛋白表達(dá)水平的影響示意圖，η=3 ；
[0034]圖19為蛋白質(zhì)印跡法考察EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠皮質(zhì)中GFAP蛋白表達(dá)水平的影響示意圖，η=3 ；
[0035]圖20為比較例中EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠皮質(zhì)中微量丙二醛(MDA)水平的影響示意圖，η=4 ；
[0036]圖21為比較例中EGCG 和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠皮質(zhì)中谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)水平的影響示意圖，η=4 ；
[0037]圖22為比較例中EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠皮質(zhì)中總超氧化物歧化酶(T-SOD)水平的影響不意圖，η=4 ；[0038]圖23為比較例中EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖小鼠皮質(zhì)中過氧化氫酶(CAT)水平的影響示意圖，n=4 ；
[0039]以上各圖中:
[0040]EGCG為表沒食子兒茶素沒食子酸酯的英文縮寫；
[0041]*P〈0.05, **P〈0.01,空白組及各實(shí)驗(yàn)組與模型組比；#P<0.05, ##P<0.01,低EGCG+VE 組與高 EGCG+VE 組比；+P〈0.05，++P〈0.01，高 EGCG+VE 組、低 EGCG+VE 組與 VE 組比；Δ Ρ〈0.05, ΔΔ Ρ〈0.01，高 EGCG+VE 組、低 EGCG+VE 組與 EGCG 組比。
【具體實(shí)施方式】
[0042]實(shí)施例1
[0043]本實(shí)施例提供了一種治療阿爾 茨海默病的藥物復(fù)合制劑，其特征在于:所述治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑的主要成分包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯和維生素E ；
[0044]油溶性的維生素E與I體積的食用油溶液混合，水溶性的EGCG和2體積的蒸餾水混合；上述兩種液體混合后,再加入質(zhì)量為所述食用油質(zhì)量10%的乳化劑，形成油水混懸液，EGCG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%，維生素E的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%。
[0045]所述的表沒食子兒茶素沒食子酸酯為綠茶中提取的多酚成分或化學(xué)合成。
[0046]所述的乳化劑為大豆磷脂或卵磷脂。
[0047]所述的治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑，對D-半乳糖所致的阿爾茨海默病模型小鼠具有減少β淀粉樣蛋白聚集的作用。本發(fā)明擬用D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病模型小鼠為對象，考察EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用改善D-半乳糖所致的阿爾茨海默病模型小鼠的學(xué)習(xí)記憶能力以及其作用機(jī)制。試驗(yàn)分別應(yīng)用Morris水迷宮、被動(dòng)避暗試驗(yàn)、生化指標(biāo)檢測、免疫組織化學(xué)染色以及蛋白質(zhì)印跡法等實(shí)驗(yàn)方法考察不同劑量的EGCG和VE合用構(gòu)成的藥物復(fù)合物對阿爾茨海默病模型小鼠學(xué)習(xí)記憶障礙的改善作用，并初步從抗氧化、抗凋亡和抗炎的角度探討了其治療阿爾茨海默病作用的機(jī)理。
[0048]試驗(yàn)方法:
[0049]實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及給藥方法:
[0050]取昆明系小鼠50只，雌雄各半，隨機(jī)分成5組:空白對照組(生理鹽水)、模型組(D-半乳糖)、VE處理組(VE-15mg/kg)、EGCG處理組(EGCG-lmg/kg)、高劑量EGCG+VE處理組(EGCG-5mg/kg;VE-15mg/kg)。每組10只小鼠。具體給藥方法如下:模型組:每日給小鼠按150mg/kg皮下注射3%的D-半乳糖一次，連續(xù)注射4周，第5周開始每日給小鼠灌胃等量的大豆油及蒸餾水混懸液一次，連續(xù)灌胃4周；藥物處理組每日給小鼠按150mg/kg皮下注射3%的D-半乳糖一次，連續(xù)注射4周，第5周開始分別按以下處理對各組小鼠進(jìn)行灌胃，連續(xù)給藥4周:VE處理組(VE-15mg/kg)每日給小鼠按15mg/kg灌胃0.3%的VE 一次；EGCG處理組(EGCG-lmg/kg)每日給小鼠按lmg/kg灌胃0.02%的EGCG 一次；高劑量EGCG+VE處理組(EGCG-5mg/kg;VE_15mg/kg)每日給小鼠按 5mg/kg 和 15mg/kg 灌胃 0.1% 和 0.3% 的 VE和EGCG的混懸液一次；空白對照組:每日給小鼠皮下注射等體積的生理鹽水一次，連續(xù)注射4周，第5周開始每日給小鼠灌胃等量的生理鹽水一次，連續(xù)灌胃4周。
[0051]其中用于灌胃的油水混懸液制法如下:油溶性的維生素E與I體積的食用油溶液混合，水溶性的EGCG和2體積的蒸餾水混合；上述兩種液體混合后，再加入質(zhì)量為所述食用油質(zhì)量10%的乳化劑,形成油水混懸液。
[0052]行為學(xué)觀察:
[0053]Morris水迷宮試驗(yàn)=Morris水迷宮為不銹鋼圓形水池，直徑120厘米，高60厘米，水池水深為30-40厘米，一個(gè)圓形平臺(tái)直徑為9厘米，藏匿于2厘米的水面下。水池內(nèi)部不得有任何標(biāo)記，水中加入適量的牛奶或奶粉，使水池成為不透明的乳白色。在圓筒的上緣等距離的設(shè)定東南西北4個(gè)標(biāo)記點(diǎn)(E、S、W、N),作為動(dòng)物入水點(diǎn)，以這4個(gè)入水點(diǎn)在水面和水桶底部的投影點(diǎn)，將水面和水桶部分均等的分為4個(gè)象限。按實(shí)驗(yàn)要求，可任意地將平臺(tái)設(shè)置于某一象限的中間，適當(dāng)?shù)暮銣卦O(shè)備使水溫保持在25°C。水迷宮水池應(yīng)配有良好的注水和排水設(shè)備，水池的位置一旦確定，就不要輕易變動(dòng)，尤其在同一輪水迷宮的測試中。水迷宮的圖像自動(dòng)采集和系統(tǒng)，能自動(dòng)地采集動(dòng)物的入水位置、游泳的速度、搜索目標(biāo)的所需時(shí)間、運(yùn)行軌跡和搜索策略等參數(shù)，并可對所采集的各種數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。實(shí)驗(yàn)前一天，水池中不放置平臺(tái)，使小鼠在水中自由游泳2分鐘，使其適應(yīng)環(huán)境。正式實(shí)驗(yàn)包括2個(gè)部分:定向航行試驗(yàn)和空間探索試驗(yàn)。
[0054]定向航行試驗(yàn):進(jìn)行定向航行試驗(yàn)時(shí)，將平臺(tái)放在固定的第二象限，不再移動(dòng)。該試驗(yàn)訓(xùn)練 小鼠每天4次，共5天。訓(xùn)練時(shí)，將小鼠面向池壁從四個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池，記錄鼠入水到找到水下隱蔽平臺(tái)并站立于其上所需時(shí)間，作為逃避潛伏期，用秒表示，并記錄從小鼠如水至找到平臺(tái)通過路徑的總長度，用米表示。小鼠找到平臺(tái)后，讓其在平臺(tái)上站立30秒。若入水后60秒若小鼠仍未能找到平臺(tái)，則將其輕輕從水中引導(dǎo)拖上平臺(tái)，并停留30秒，然后進(jìn)行下一次訓(xùn)練。每只鼠從四個(gè)入水點(diǎn)分別放入水池為一次訓(xùn)練，兩次訓(xùn)練之間間隔120秒。
[0055]空間探索試驗(yàn):在定向航行試驗(yàn)結(jié)束后，也就是試驗(yàn)的第6天，將原來平臺(tái)撤去，使其在水中尋找原平臺(tái)所在位置，時(shí)間共120秒，記錄小鼠在原平臺(tái)所在目的象限的停留時(shí)間，用秒表示，以及小鼠穿越原平臺(tái)的次數(shù)，來評價(jià)小鼠記憶重現(xiàn)的能力。
[0056]被動(dòng)避暗實(shí)驗(yàn):BA-200避暗自動(dòng)測試儀，62厘米X 30厘米X 23厘米的活動(dòng)箱分明暗兩室，兩室之間有一直徑為3.0厘米的洞口，箱底有銅柵。試驗(yàn)分為訓(xùn)練期和正式試驗(yàn)期。訓(xùn)練前將小鼠頭背著洞口放入明室，先適應(yīng)環(huán)境3分鐘，然后給暗室銅柵通36V電流，小鼠進(jìn)入暗室后受到電擊即逃到明室，銅柵持續(xù)通電5分鐘，此為訓(xùn)練過程。24h后進(jìn)行小鼠的記憶測驗(yàn)，記錄小鼠第一次進(jìn)入暗室的時(shí)間(避暗潛伏期)，以秒表示；并記錄5分鐘內(nèi)小鼠進(jìn)入暗室的次數(shù)(避暗錯(cuò)誤次數(shù))。若小鼠5分鐘內(nèi)未進(jìn)入暗室，其潛伏期計(jì)作300秒計(jì)算。
[0057]病理組織形態(tài)學(xué)觀察:
[0058]各組小鼠斷頭處死，迅速取出每組3只小鼠的大腦，放入4%多聚甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，切片，用于免疫組化的檢測。
[0059]生物化學(xué)指標(biāo)的檢測:
[0060]腦內(nèi)SOD、GSH-Px、CAT酶活性及MDA含量的測定:取每組4只小鼠的腦組織，加入預(yù)冷的生理鹽水制成10%的腦勻漿，2000rpm/分鐘離心10分鐘，取上清。蛋白定量后，采用羥胺法按試劑盒說明測定腦組織總超氧化物歧化酶(T-SOD)活性；按試劑盒說明測定谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性；采用硫代巴比妥酸法測定腦組織丙二醛(MDA)含量；采用可見光法按試劑盒說明測定腦組織過氧化氫酶(CAT)活性。[0061]蛋白質(zhì)印跡法觀察D-半乳糖模型小鼠的ΑΡΡ、Αβ、GFAP蛋白表達(dá)水平:
[0062]分別取各組3只小鼠的大腦皮質(zhì)和海馬，立即放入預(yù)冷的RIPA裂解緩沖液(RIPA:PMSf=1000:1)中，冰上超聲勻漿3次，放置5分鐘，4°C，12000 X g離心5分鐘，取上清，用BCA試劑盒測定總蛋白含量，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)品。用10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，蛋白上樣量為每孔50yg。中央泳道加入彩虹Maker5 μ L，用于蛋白帶分子量的確定。濃縮膠電泳約I小時(shí)，分離膠電泳約I小時(shí)后，將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，取出后以磷酸鹽吐溫緩沖液(PBS中加入0.1%(v/v)吐溫20)洗膜液洗膜10分鐘X 3次，將膜放入含5%脫脂奶粉的磷酸鹽吐溫緩沖液中，搖床上室溫封閉120分鐘；磷酸鹽吐溫緩沖液洗膜10分鐘X 3次后，將膜放入一抗APP (1:1000)、Α β (1:1000) ,GFAP (1:1000)、搖床上室溫孵育過夜；磷酸鹽吐溫緩沖液洗膜10分鐘X3次；辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1:3000)、山羊抗鼠IgG(1:3000)室溫?fù)u床上孵育振蕩120分鐘，磷酸鹽吐溫緩沖液洗膜10分鐘X3次；使用發(fā)光液(A:B=1:1)發(fā)光并顯影。將蛋白印跡顯影圖掃描，利用凝膠自動(dòng)分析成FluorChemV2.0軟件(Alpha InnotechCorp., USA)對蛋白帶進(jìn)行灰度值(分別以目的蛋白的整合密度值比內(nèi)參β-tubulin (1:3000)的整合密度值)分析。
[0063]統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用I + s表示，數(shù)據(jù)采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)分析軟件包進(jìn)行統(tǒng)
計(jì)學(xué)處理，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Turkey HSD post hoc test法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；對于不服從正態(tài)分布的數(shù)據(jù)，如動(dòng)物活動(dòng)次數(shù)，穿梭次數(shù)等指標(biāo)，使用非參檢驗(yàn)Kruskal - Wallis H test法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；設(shè)定檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α =0.05, ρ>0.05差異無顯著性，Ρ<0.05差異具有顯著性。
[0064]結(jié)果:
[0065]1.EGCG與VE聯(lián)用對D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠Morris水迷宮結(jié)果的影響
[0066]通過對各組小鼠進(jìn)行為時(shí)5天的訓(xùn)練，可得到各組小鼠在訓(xùn)練連續(xù)5天期間逃避潛伏期(圖1)和尋找平臺(tái)路徑長度(圖2)的趨勢圖。試驗(yàn)結(jié)果顯示，試驗(yàn)開始第I天，高EGCG+VE組的尋找平臺(tái)潛伏期和尋找平臺(tái)路徑長度相對于模型組顯示明顯差異(P〈0.01)。從試驗(yàn)開始第2天至第5天，隨著訓(xùn)練次數(shù)的增加，各組小鼠的尋找平臺(tái)潛伏期和尋找平臺(tái)所經(jīng)過的路徑長度有縮短趨勢，且與空白組相比，模型組小鼠的尋找平臺(tái)潛伏期和尋找平臺(tái)所經(jīng)過的路徑長度均有顯著差異(P〈0.01)，并且隨著訓(xùn)練時(shí)間的延長，模型組小鼠的這兩項(xiàng)指標(biāo)并未呈現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶過程的特征，這意味著D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠產(chǎn)生了明顯的學(xué)習(xí)記憶障礙。另外，與模型組相比，高劑量EGCG+VE處理組(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)的尋找潛伏期和尋找平臺(tái)路徑長度顯著縮短(P〈0.05)，且高劑量EGCG+VE處理組效果明顯優(yōu)于VE處理組、EGCG處理組(Ρ〈0.05)，結(jié)果表明EGCG (5mg/kg)和VE(15mg/kg)聯(lián)合處理可以改善D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠的學(xué)習(xí)與記憶障礙。
[0067] EGCG對D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠空間探索試驗(yàn)結(jié)果的影響:通過對各組小鼠進(jìn)行為時(shí)5天的訓(xùn)練后，于第6天撤去原來的平臺(tái)，分別對小鼠在原平臺(tái)所在目的象限時(shí)間(圖3)以及原平臺(tái)所在位置的穿梭次數(shù)(圖4)進(jìn)行觀察，以考察EGCG與VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠記憶再現(xiàn)能力的影響。模型組小鼠的在原平臺(tái)所在目的象限的停留時(shí)間(P〈0.01)以及對原平臺(tái)所在位置的穿梭次數(shù)(P〈0.01)均較空白組小鼠顯著減少，說明D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠的記憶再現(xiàn)能力出現(xiàn)明顯障礙；而高劑量EGCG+VE組(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)小鼠在目的象限的停留時(shí)間(P〈0.01)和在原平臺(tái)所在位置穿梭次數(shù)(P〈0.01)均比模型組小鼠明顯延長，且明顯優(yōu)于VE組、EGCG組(P〈0.05),這說明經(jīng)過EGCG (5mg/kg)和VE(15mg/kg)聯(lián)合處理后可改善D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠的記憶再現(xiàn)能力低下狀況。
[0068]2.EGCG和VE聯(lián)合處理對D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠被動(dòng)避暗試驗(yàn)結(jié)果的影響
[0069]通過被動(dòng)避暗試驗(yàn)對各組小鼠避暗潛伏期(圖5)和明暗箱穿梭錯(cuò)誤次數(shù)(圖6)的檢測，對各組小鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，與空白組相比，模型組小鼠的避暗潛伏期明顯縮短(p〈0.01)，錯(cuò)誤次數(shù)也明顯增加(P〈0.01)，這提示了 D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠存在學(xué)習(xí)與記憶障礙；而與模型組相比，高EGCG+VE處理組(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)小鼠避暗潛伏期明顯延長(Ρ〈0.01)，進(jìn)入暗室的次數(shù)明顯減少(Ρ〈0.01)，且高 EGCG+VE 組明顯優(yōu) 于 VE 組、EGCG 組(P〈0.05)，說明 EGCG (5mg/kg)和 VE(15mg/kg)聯(lián)合應(yīng)用可改善D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙。
[0070]3.EGCG和VE聯(lián)合處理對D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)APP、A β n GFAP表達(dá)的影響
[0071]APP蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示(圖7~8)，與空白組相比，D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病模型組小鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)均可見大量APP陽性細(xì)胞表達(dá)，胞漿著色較深，整合光密度值顯著增高(Ρ〈0.01)，這說明D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)存在APP的異常沉積。與模型組相比，高EGCG+VE處理組(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)小鼠的腦皮質(zhì)和海馬區(qū)APP陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P〈0.01)，胞漿著色變淺，且高EGCG+VE組明顯優(yōu)于VE組、EGCG組(P〈0.05)，說明EGCG (5mg/kg)和VE(15mg/kg)聯(lián)合應(yīng)用可改善D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)APP的異常沉積。
[0072]Ai^4tl蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示(圖9~10)，與空白組相比，D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠皮質(zhì)和海馬均可見大量棕黃色陽性細(xì)胞表達(dá)，胞漿著色較深，整合光密度值顯著增高(P〈0.01)，這說明D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)存在Aii1,的異常沉積。與模型組相比，高劑量EGCG+VE處理組(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)小鼠的腦皮質(zhì)和海馬區(qū)A β H0陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(Ρ〈0.01)，且胞漿著色變淺，明顯優(yōu)于VE組和EGCG組(Ρ〈0.05)，說明EGCG (5mg/kg)和VE(15mg/kg)聯(lián)合應(yīng)用可改善D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)Αβ !_40的異常沉積。
[0073]GFAP蛋白免疫組化染色結(jié)果顯示(圖11~12)，與空白組相比，D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠皮質(zhì)和海馬均可見大量GFAP細(xì)胞表達(dá)，胞漿著色較深，整合光密度值顯著增高(Ρ〈0.01)，這說明D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠腦內(nèi)存在星形膠質(zhì)細(xì)胞的異常激活。與模型組相比，高劑量EGCG+VE處理組(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)小鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)明顯減少(P〈0.01)，且高EGCG+VE組明顯優(yōu)于VE組、EGCG組(P〈0.05)，說明EGCG (5mg/kg)和VE(15mg/kg)聯(lián)合應(yīng)用可改善D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠皮質(zhì)和海馬內(nèi)異常的炎癥反應(yīng)。
[0074]4.EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病小鼠生物化學(xué)指標(biāo)的影響
[0075]如表1及圖13~16所示，與空白組相比，模型組小鼠腦組織CAT、GSH-Px活性明顯降低(P〈0.01)，SOD活性也有所降低(P〈0.05)，MDA含量明顯升高(P〈0.01)，與模型組相比，高劑量EGCG+VE處理組(EGCG-5mg/kg ；VE-15mg/kg)能顯著提高小鼠腦組織SOD和GSH-Px、CAT的活性(Ρ〈0.05)，顯著降低MDA含量(Ρ〈0.01)，且高EGCG+VE組優(yōu)于VE組、EGCG組(P〈0.05)，說明EGCG (5mg/kg)和VE (15mg/kg)聯(lián)合應(yīng)用可以通過抗神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激改善與癡呆相關(guān)的學(xué)習(xí)記憶功能障礙。
[0076]表1EGCG和VE聯(lián)合應(yīng)用對D-半乳糖誘導(dǎo)阿爾茨海默病模型小鼠生物化學(xué)指標(biāo)的
影響(-1 +S, n=4)
[0077」
【權(quán)利要求】
1.一種治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑，其特征在于:所述治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑的主要成分包括表沒食子兒茶素沒食子酸酯和維生素E ； 油溶性的維生素E與I體積的食用油溶液混合，水溶性的EGCG和2體積的蒸餾水混合；上述兩種液體混合后，再加入質(zhì)量為所述食用油質(zhì)量10%的乳化劑,形成油水混懸液，EGCG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.02-0.1%，維生素E的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.3%。
2.按照權(quán)利要求1所述的治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑，其特征在于:所述的表沒食子兒茶素沒食子酸酯為綠茶中提取的多酚成分或化學(xué)合成。
3.按照權(quán)利要求1所述的治療阿爾茨海默病的藥物復(fù)合制劑，其特征在于:所述的乳化劑為大豆磷脂或卵磷脂。
【文檔編號(hào)】A61P25/28GK103948584SQ201310356333
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2013年8月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月14日
【發(fā)明者】魏敏杰, 劉明妍, 鐘欣, 姚維范, 王爽, 王崴, 趙琳, 何苗, 趙海山 申請人:魏敏杰