Activin-ActRIIa拮抗劑及其促進骨骼生長的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本申請涉及Activin-ActRIIa拮抗劑及其促進骨骼生長的應(yīng)用。在某些方面，本發(fā)明提供了用于促進骨骼生長以及增加骨密度的組合物和方法。
【專利說明】Activin-ActRI Ia括抗劑及其促進骨路生長的應(yīng)用
[0001]本申請是申請?zhí)枮?00680051538.9、申請日為2006年11月22日的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002]相關(guān)申請
[0003]本申請要求2005年11月23號提交的臨時申請?zhí)枮?0/739，462,2006年3月17日提交的臨時申請?zhí)枮?0/783，322,2006年9月15號提交的臨時申請?zhí)枮?0/844，855的優(yōu)先權(quán)權(quán)益，上述申請通過參考整體并入本申請。
【背景技術(shù)】
[0004]骨骼疾病，包括從骨質(zhì)疏松到骨折，代表了一組病理狀態(tài)，極少有可以有效針對這些病理狀態(tài)的藥物制劑。取而代之的是，治療的焦點集中在包括固化、運動和飲食改變物理和行為干涉上。對于治療各種骨骼疾病，有促進骨骼生長以及增加骨骼密度的治療藥劑將是有益的。
[0005]骨骼生長和礦化依賴于成骨細胞和破骨細胞這兩種類型細胞的活性，盡管軟骨細胞和血管細胞也參與了這些過程的關(guān)鍵方面。發(fā)展地，骨骼形成通過兩種機制發(fā)生，軟骨內(nèi)成骨和膜內(nèi)成骨，前者負責縱行骨形成，后者負責拓撲扁平骨如頭骨骨骼的形成。軟骨內(nèi)成骨要求順序形成以及生長板內(nèi)的軟骨結(jié)構(gòu)的降解，所述的生長板作為成骨細胞、破骨細胞、血管細胞的形成以及隨后的礦化的模板。在膜內(nèi)成骨過程中，骨骼在結(jié)締組織中直接形成。這兩種進程要求成骨細胞的浸潤和后續(xù)的基質(zhì)沉積。
[0006]骨折以及其它的骨骼結(jié)構(gòu)性破裂通過一種至少表面上類似骨生成的發(fā)育順序的過程來愈合，所述的骨生成的發(fā)育包括軟骨組織形成以及隨后的礦化。骨折愈合的過程可以以兩種方式發(fā)生。直接或初始 的骨骼愈合的發(fā)生沒有骨痂形成。間接或二級的骨骼愈合的發(fā)生具有骨痂前體階段。骨折的初期愈合涉及橫跨緊密排布破裂的機械連接的改造。在合適的條件下，圍繞破裂的骨骼吸收細胞顯示了隧道吸收應(yīng)答，并構(gòu)建穿刺血管以及隨后的愈合的通路。骨骼的二級愈合以炎癥反應(yīng)、軟骨痂形成、骨痂礦化和骨痂重構(gòu)的順序進行。在炎癥反應(yīng)階段，血腫和出血形成源于損傷位置的骨膜以及骨內(nèi)膜血管的破裂。炎性細胞侵入該區(qū)域。在軟骨痂形成階段，細胞生成新的血管、成纖維母細胞、胞內(nèi)物質(zhì)和支持細胞，在骨折破片間的間隙形成肉芽組織。橫跨破裂的臨床愈合通過纖維狀的或軟骨組織(軟骨痂)建立。成骨細胞形成并調(diào)節(jié)軟骨痂的礦化，然后所述的軟骨痂被板層骨所代替且受限于正常的重構(gòu)過程。
[0007]除了骨折以及骨骼結(jié)構(gòu)的其他物理破裂外，骨骼礦物質(zhì)含量以及骨密度的丟失可由多種不同的條件引起并且可能導致重要的醫(yī)學問題。骨密度的改變以相對可預(yù)期的方式發(fā)生于個體整個壽命期間。大約到30歲的時候，男性和女性的骨骼通過軟骨內(nèi)成骨生長盤的線性生長和徑向生長生長至最大質(zhì)量。在大約30歲(對于松質(zhì)骨，例如，扁平骨諸如椎骨和骨盆)以及40歲(對于皮質(zhì)骨，例如，在肢體中的長骨)，男性和女性均發(fā)生緩慢的骨丟失。在女性中，還存在最后階段的實質(zhì)骨骼丟失，也許是由于絕經(jīng)后缺乏雌激素。在此期間，女性可能在皮質(zhì)骨上額外丟失10%的質(zhì)量，以及在松質(zhì)間隔上額外丟失失25%的質(zhì)量。進行性的骨骼質(zhì)量丟失是否導致病理狀況諸如骨質(zhì)疏松嚴重依賴于個體的初始骨骼質(zhì)量以及是否存在加重的狀況。
[0008]骨丟失有時以正常骨骼重構(gòu)過程的不平衡為特征。健康的骨骼經(jīng)常受限于重構(gòu)。重構(gòu)以骨骼被破骨細胞吸收開始。然后被吸收的骨骼被新的骨骼組織所代替，其特征在于成骨細胞形成膠原并且隨后鈣化。在健康的個體中，吸收和形成的速率是平衡的。骨質(zhì)疏松癥是一種慢性的、進行性的狀況，以朝向吸收的轉(zhuǎn)移為標記，導致骨骼質(zhì)量的全面減少以及骨骼礦化。人體的骨質(zhì)疏松癥先于臨床的骨質(zhì)減少(骨礦物質(zhì)密度在年輕成年人的均值以下大于一個標準差但小于兩個標準差)。世界范圍內(nèi)，大致7億5千萬人具有骨質(zhì)疏松的風險。
[0009]因此，控制破骨細胞和成骨細胞活性的方法對促進骨折和骨骼其它損傷的愈合以及疾病(如骨質(zhì)疏松，與骨骼質(zhì)量的損失以及骨骼礦化相關(guān))的治療是有效的。
[0010]關(guān)于骨質(zhì)疏松癥，雌激素、降鈣素、骨鈣素和維生素K，或大劑量的膳食鈣均用作干預(yù)治療。其它的骨質(zhì)疏松的治療途徑包括雙磷酸酯、甲狀旁腺激素、擬鈣劑(calcimimetic)、他汀類、鑭和鍶的鹽以及氟化鈉。然而，這些治療方法通常與不良副作用相關(guān)聯(lián)。
[0011]因此，本發(fā)明的目的是提供促進骨骼生長和礦化的組合物及方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0012]發(fā)明概述
[0013]部分地，本發(fā)明證明了具有激活素(activin)或激活素IIA型受體(ActRIIa)拮抗劑活性(“activin拮抗劑”和“ActRIIa拮抗劑”)的分子能夠用于增加骨骼密度，促進骨骼生長，并且/或增加骨骼強度。特別地，本發(fā)明證明了 ActRIIa的可溶形式作為activin-ActRIIa信號的抑`制劑，并且在體內(nèi)促進增加的骨骼密度、骨骼生長和骨骼強度。然而，絕大多數(shù)的促進骨骼生長或抑制骨骼損失的藥物制劑或者作為抗-分解代謝制劑(通常也涉及如“分解代謝制劑(如，雙磷酸酯)或者作為合成代謝制劑(如，甲狀旁腺激素，PTH,當劑量適宜時)，可溶性的ActRIIa蛋白顯示雙重活性，具有分解代謝和合成代謝的效果。因此，本發(fā)明確立，activin-ActRIIa信號通路的拮抗劑可以用于增加骨骼密度以及促進骨骼生長。然而可溶性的ActRIIa可能通過除了 activin拮抗以外的機制影響骨骼，盡管如此，本發(fā)明證明了合意的治療劑可以根據(jù)activin-ActRIIa拮抗劑活性來選擇。因此，在某些實施方式中，本發(fā)明了提供了使用activin-ActRIIa拮抗劑的方法來治療與低骨骼密度或低骨骼強度相關(guān)聯(lián)的疾病(如骨質(zhì)疏松癥)或促進有此需要的患者(如在骨折的患者中)的骨骼生長，所述的activin-ActRIIa拮抗劑包括例如激活素結(jié)合IIA型受體(activin-binding ActRIIa)多妝、抗 activin 抗體、抗 ActRIIa 抗體、activin 革巴向或ActRIIa祀向的小分子和核酸適體，以及降低activin和ActRIIa表達的核酸。此外,可溶性的ActRIIa多肽促進骨骼生長而不造成肌肉質(zhì)量的持續(xù)可測量的增加。
[0014]在某些方面，本發(fā)明提供了包括可溶的、結(jié)合至activin的activin-bindingActRIIa多肽的多肽。ActRIIa多肽可以被制成包含activin-binding ActRIIa和藥學上可接受的載體的藥物制劑。優(yōu)選的，activin-binding ActRIIa多肽以小于I個微摩爾或小于100、10或I個納摩爾的Kd結(jié)合至激活素。視情況，相對于⑶Fll和/或⑶F8，activin-binding ActRIIa 選擇性地結(jié)合 activin,優(yōu)選地，activin 的 Kd 至少比 GDFll 和/或GDF8的Kd要低10倍、20倍或50倍。然而不希望束縛于特定的作用機制，預(yù)期的是，activin抑制高于⑶Fll/⑶F8的選擇度說明了在骨骼上的選擇效果不會在肌肉上造成持續(xù)可測量的效果。在一些實施方式中，選擇引起低于15%、低于10%或低于5%的肌肉增長的ActRIIa在骨骼上獲得合意的效果的劑量。優(yōu)選地，組合物的純度至少是95%，有關(guān)其它的多肽成分，通過尺排阻色譜確定，更優(yōu)選地，組合物的純度至少是98%。這樣的制劑中使用的activin-binding ActRIIa多肽可以是本發(fā)明所公開的任意多肽,如具有選自SEQ ID Nos:2、3、7、12或13的氨基酸序列的多肽，或與選自SEQ ID Nos:2、3、7或12的氨基酸序列具有至少80%、85 %、90 %、95 %、97 %或99 %同一性的多肽。Activin-bindingActRIIa多肽可以包括天然的ActRIIa的功能性片段，如包含選自SEQ ID NOs:1_3的序列或SEQ ID Nos:2 (缺少C末端的10到15個氨基酸)的序列的至少10個、20個或30個氨基酸(“尾”)。
[0015]相對于天然存在的ActRIIa多肽,可溶性的、activin-binding ActRIIa多肽可以包括一個或多個氨基酸序列的改變(例如在配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)。改變了的ActRIIa多肽的例子提供在W02006/012627的第59-60頁，在此以引用的方式并入本文。氨基酸序列的改變可以是，例如，當在哺乳動物、昆蟲或其它真核細胞生產(chǎn)時改變多肽的糖基化，或者相對于天然存在的ActRIIa多肽改變多肽的蛋白酶切。
[0016]Activin-binding ActRIIa多肽可以是融合蛋白，其具有ActRIIa多肽的一個結(jié)構(gòu)域(例如ActRIIa多肽的配體結(jié)合部分)和一個或多個另外的提供合意的特性(如改進的藥代動力學、更容易純化、靶向特定的組織等)的結(jié)構(gòu)域。例如，融合蛋白的結(jié)構(gòu)域可以增強體內(nèi)穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期、吸收/施用、組織定位或分配、蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成、融合蛋白的多聚化和/或純化中的一種或多種。Activin-binding ActRIIa融合蛋白可以包括免疫球蛋白Fe結(jié)構(gòu)域(野生型或突變體)或血清白蛋白或其它提供合意特性(諸如改進的藥代動力學、改進的可溶性或改進的穩(wěn)定性)的多肽部分。在一個優(yōu)選的實施方式中，ActRIIa-Fc融合包括相對非結(jié)構(gòu)化連接`子,其位于Fe結(jié)構(gòu)域和ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域之間。這種非結(jié)構(gòu)化的列鍵字可以對應(yīng)于ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域的C末端端點(“尾”)的大致15個氨基酸非結(jié)構(gòu)化區(qū)域，或者其可以是1、2、3、4或5個氨基酸的人工序列，或5個與15、20、
30、50個或更多個二級結(jié)構(gòu)相對自由的氨基酸間的長度，或兩者的混合物。連接子可以是富含甘氨酸和脯氨酸殘基的，并且可以，例如，含有蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的簡單序列或蘇氨酸/絲氨酸和甘氨酸的重復(fù)序列(例如，TG4或SG4單態(tài)或重復(fù)序列)。融合蛋白可以包括純化的子序列，如表位標簽、FLAG標簽、多聚組氨酸序列以及GST融合。視情況，可溶性的激活素結(jié)合IIA型受體多肽包括一個或多個選自下組的修飾的氨基酸殘基:糖基化的氨基酸、聚乙二醇修飾的(PEGylated)氨基酸、法尼基化(farnesylated)的氨基酸、乙?；陌被?、生物素化的氨基酸、耦聯(lián)脂質(zhì)體部分的氨基酸、耦聯(lián)有機衍生物制劑的氨基酸。藥物制劑也可以包括一個或多個附加化合物諸如用于治療骨骼疾病的化合物。優(yōu)選地，藥物制劑大體上是無致熱源的。一般地，優(yōu)選的是ActRIIa蛋白在哺乳動物細胞系中表達，所述的細胞系調(diào)節(jié)ActRIIa蛋白合適地天然糖基化以消除患者的不良免疫反應(yīng)的可能性。人細胞系以及CHO細胞系已被成功地應(yīng)用，并且預(yù)期其它普通的哺乳動物表達系統(tǒng)也是有用的。
[0017]如本發(fā)明所描述的，ActRIIa蛋白指定的ActRIIa-Fc具有合意的特性，包括相對于GDF8和/或GDFll選擇性地結(jié)合激活素，配體結(jié)合的高親和性以及動物模型中大于兩周的血清半衰期。在某些實施方案中，本發(fā)明提供了 ActRIIa-Fc多肽以及包含這樣的多肽和藥學上可接受的賦形劑的藥物制劑。
[0018]在某些方面,本發(fā)明提供了編碼可溶性activin-binding ActRIIa多肽的核酸。分離的多核苷酸可以包含諸如上面所描述的可溶性activin-binding ActRIIa多肽的編碼序列。例如，分離的核酸可以包括ActRIIa的胞外結(jié)構(gòu)域(例如，配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域)的編碼序列，以及編碼部分或全部的跨膜結(jié)構(gòu)域和/或ActRIIa的胞漿結(jié)構(gòu)域的序列，但不編碼位于跨膜結(jié)構(gòu)域中或胞漿結(jié)構(gòu)域中的或位于胞外結(jié)構(gòu)域與跨膜結(jié)構(gòu)域或胞漿結(jié)構(gòu)域之間的終止密碼子。例如，分離的多核苷酸可以包含全長ActRIIa多核苷酸序列諸如SEQ ID NO:4或5，或部分截除的序列，所述的多核苷酸進一步包含在3’末端之前至少600個核苷酸或其它的使得多核苷酸的翻譯導致胞外結(jié)構(gòu)域隨機地融合到部分截短的全長ActRIIa的位置的轉(zhuǎn)錄終止密碼子。優(yōu)選的核酸序列是SEQ ID N0:14。本發(fā)明所公開的核酸可操作地連接到用于表達的啟動子，并且本發(fā)明提供了轉(zhuǎn)化了這樣的重組多核苷酸的細胞。優(yōu)選地，所述的細胞是哺乳動物細胞，諸如CHO細胞。
[0019]在某些方面,本發(fā)明提供了制備可溶性activin-binding ActRIIa多肽的方法。這樣的方法可包括在適宜的細胞(諸如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞)中表達本發(fā)明所公開的任何核酸(例如，SEQ ID NO:4、5或14)。這樣的方法可包括:a)在適宜的條件下培養(yǎng)細胞以表達可溶性的ActRIIa多肽，其中所述的細胞轉(zhuǎn)化有可溶性ActRIIa的表達構(gòu)建物；以及b)復(fù)性所表達的可溶性ActRIIa多肽。可溶性ActRIIa多肽可以作為天然的、部分純化的或高度純化的片段復(fù)性。純化可以通過一系列的純化步驟完成，包括例如，下面所述中的一個、兩個或三個或多個，以任意的順序:蛋白親和層析(protein A chromatography)、陰離子交換層析(例如，Q瓊脂糖)、疏水層析(例如，苯基瓊脂糖)，尺寸排阻層析和陽離子交換層析。
[0020]在某些方面，本發(fā)明所公開的activin-ActRIIa拮抗劑，諸如可溶性的activin-binding ActRIIa多肽，可以用于一種以促進骨骼生長或增加骨骼密度為目的的方法。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了治療低骨骼密度相關(guān)疾病或在有此需求的患者中促進骨骼生長的方法。該方法可以包含對有此需求的對象施用有效劑量的activin-ActRIIa拮抗劑。在某些方面,本發(fā)明提供了使用activin-ActRIIa拮抗劑制備治療上面所述的疾病或狀況的藥物。
[0021]在某些方面，本發(fā)明提供了鑒別刺激骨骼生長或增加骨骼礦化的藥物的方法。所述的方法包括:a)鑒別結(jié)合至activin或ActRIIa多肽的配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域的待測藥物I ;b)評估藥物在骨骼生長或礦化上的效果。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1顯示了 CHO細胞中所表達的ActRIIa-hFc的純化。 純化的蛋白為一個良好峰形的單峰。
[0023]圖2 顯不了 ActRIIa-hFc 結(jié)合至 activin 和 GDFlI,通過 BiaCore 分析檢測。
[0024]圖3顯示了 A-204報告基因分析的示意圖。該圖顯示了報告載體:pGL3 (CAGA) 12 (在 EMB017:3091-3100 中有描述，Dennler 等，1998)。CAGA12 基序出現(xiàn)在TGF-Beta反應(yīng)性基因(PA1-1基因)中，因此該載體通常用于通過Smad2和3信號通路的因子。
[0025]圖4顯示了 A-204報告基因分析中ActRIIa-hFc (菱形)和ActRIIaiFc (方塊)在GDF-8信號上的效果。兩種蛋白都展示了其在皮摩爾濃度幾乎完全抑制GDF-8調(diào)節(jié)的信號。
[0026]圖5顯示了 A-204報告基因分析中三種不同的ActRIIa-hFc制劑在⑶F-11信號上的效果。
[0027]圖6顯示了對照組和ActRIIa-mFc處理的BALB/c小鼠在12周的治療期前(上面)和后(下面)的DEXA(雙能X線吸收測定)圖像的示例。淺色部分顯示了增加了的骨
骼密度。
[0028]圖7顯示了 ActRIIa-mFc在BALB/c小鼠12周治療期間對骨礦密度的效果的定量。治療分為對照(菱形)、2mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (方塊)、6mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (三角形)以及 10mg/kg 劑量的 ActRIIa-mFc (圓圈)。
[0029]圖8顯示了 ActRIIa-mFc在BALB/c小鼠12周治療期間對骨礦含量的效果的定量。治療分為對照(菱形)、2mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (方塊)、6mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (三角形)以及 10mg/kg 劑量的 ActRIIa-mFc (圓圈)。
[0030]圖9顯示了 ActRIIa-mFc對摘除卵巢(OVX)或假手術(shù)6周以上的C57BL6小鼠松質(zhì)骨骨礦密度的效果的定量。治療分為對照(PBS)或10mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (ActRIIa)。
[0031]圖10顯示了 Act`RIIa-mFc在摘除卵巢的(OVX) C57BL6小鼠的12周治療期間對松質(zhì)骨的效果的定量。治療分為對照(PBS，淺色條)或10mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (ActRIIa，深色條)。
[0032]圖11顯示了 ActRIIa-mFc在假手術(shù)的C57BL6小鼠6周或12周治療期后對松質(zhì)骨的效果的定量。治療分為對照(PBS，淺色條)或10mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (ActRIIa，深色條)。
[0033]圖12顯示了摘除卵巢的(OVX)小鼠的12周治療期間的骨骼密度pQCT分析結(jié)果。治療分為對照(PBS,淺色條)或10mg/kg劑量的ActRIIa-mFc (ActRIIa,深色條)。Y軸:mg/c cm
[0034]圖13描述了假手術(shù)的小鼠12周治療期間的骨骼密度pQCT分析結(jié)果。治療分為對照(PBS,淺色條)或 10mg/kg 劑量的 ActRIIa-mFc (ActRIIa,深色條)。Y 軸:mg/ccm
[0035]圖14A和圖14B顯示了 12周治療期后㈧的全身DEXA分析和股骨間接體內(nèi)分析(B)。亮區(qū)描述了高骨骼密度的區(qū)域。
[0036]圖15顯示了 12周治療期后的股骨中段的間接體內(nèi)pQCT分析。治療分為對照(PBS，深色條)和ActRIIa-mFc (淺色條)。左側(cè)的四個條顯示總骨骼密度而右側(cè)的四個條顯示皮質(zhì)骨密度。每四個條的第一對代表了源于摘除卵巢的小鼠的數(shù)據(jù)而第二對代表了源于假手術(shù)小鼠的數(shù)據(jù)。
[0037]圖16顯示了 12周治療期后的股骨中段的間接體內(nèi)pQCT分析和骨干含量。治療分為載體對照(PBS，深色條)或ActRIIa-mFc (淺色條)。左側(cè)的四個條顯示總骨骼含量而右側(cè)四個條顯示皮質(zhì)骨含量。每四個條的第一對代表了源于摘除卵巢的小鼠的數(shù)據(jù)而第二對代表了源于假手術(shù)小鼠的數(shù)據(jù)。[0038]圖17顯示了股骨中段的間接體內(nèi)pQCT分析和股骨皮層厚度。治療分為對照(PBS，深色條)或ACtRIIa-mFC(淺色條)。左側(cè)的四個條顯示骨內(nèi)膜周長而右側(cè)的四個條小時骨膜周長。每四個條的第一對代表了源于摘除卵巢的小鼠的數(shù)據(jù)而第二對代表了源于假手術(shù)小鼠的數(shù)據(jù)。
[0039]圖18描述了 12周治療期后的股骨力學檢測結(jié)果。治療分為對照(PBS，深色條)或ActRIIa-mFc (淺色條)。左側(cè)的兩個條代表了源于摘除卵巢的小鼠的數(shù)據(jù)而后面的兩個條代表了源于假手術(shù)小鼠的數(shù)據(jù)。
[0040]圖19顯示了 ActRIIa-mFc對松質(zhì)骨容積的影響。
[0041]圖20顯示了 ActRIIa-mFc對股骨遠端的松質(zhì)骨結(jié)構(gòu)的影響。
[0042]圖21顯示了 ActRIIa-mFc對皮質(zhì)骨的影響。
[0043]圖22顯示了 ActRIIa-mFc對骨骼力學強度的影響。
[0044]圖23顯示了在三個不同劑量下，不同劑量的ActRIIa-mFc對骨骼特性的影響。
[0045]圖24顯示了組織形態(tài)學測量(histomorphometry)表明ActRIIa-mFc具有雙重的合成代謝和抗吸收活性。
[0046]發(fā)明詳述
[0047]1.綜述
[0048]轉(zhuǎn)化生長因子be ta(TGF-beta)超家族包含多種具有相同的共有序列單元以及結(jié)構(gòu)基序的生長因子。已知這些蛋白對脊椎動物和無脊椎動物的許多類型的細胞發(fā)揮生物學功能。超家族的成員在胚胎發(fā)育期的模式形成以及組織分化中執(zhí)行重要功能，并且能影響多種分化進程，包括脂肪生成、肌肉發(fā)生、軟骨形成、心臟發(fā)生、造血作用、神經(jīng)生成以及上皮細胞分化。這個家族被分為兩個通用分支:BMP/⑶F和TGF-beta/Activin/BMPIO分支，其成員具有不同的、通常是互補的效果。通過操縱TGF-beta家族成員的活性，通?？梢詫е律矬w內(nèi)重要的生理學變化。例如，皮德蒙特(Piedmontese)和比利時藍(Belgian Blue)牛品種帶有GDF8(也叫做肌抑素(myostatin))基因內(nèi)的缺失功能的突變，其導致肌肉質(zhì)量的顯著增長。Grobet等，Nat Genet.1997,17 (I):71_4。此外，在人體，GDF8等位基因的失活與肌肉質(zhì)量的增加以及(據(jù)稱)異常強度相關(guān)。Schuelke等，N Engl J Med2004,350:2682-8.[0049]激活素(activin)是屬于TGF-beta超家族的二聚體多肽生長因子。有三種基本形式(A、B和AB)的activin，其為兩個密切相關(guān)的β亞單位(β Α β Α、β Β β Β和β Α β Β)的同源/異源二聚體。人類基因組也編碼activin C和activin E,其最初在肝臟中表達。在TGF-beta超家族中，activins是可以刺激卵巢內(nèi)以及胎盤細胞中激素產(chǎn)生、支持神經(jīng)細胞存活、依賴細胞類型正性或負性地影響細胞周期進程、以及至少在兩棲動物胚胎中誘導中胚層分化的惟一的以及多功能的因子(DePaolo等，1991, Proc Soc Ep Biol Med.198:500-512 ；Dyson 等，1997, Curr Biol.7:81-84 ；ffoodruff,1998, Biochem Pharmacol.55:953-963)。此外，分離自刺激過的人單核細胞白血病細胞的紅細胞分化因子(EDF)被發(fā)現(xiàn)與 activin A 相同(Murata 等，1988, PNAS, 85:2434)。已經(jīng)表明 activin A 在骨髓腔中作為紅細胞生成的天然的正調(diào)節(jié)因子。在一些組織中，activin信號被其相關(guān)的異二聚體、抑制素所拮抗。例如，在垂體釋放卵泡刺激素(FSH)時，activin促進FSH分泌與合成，而抑制素阻止FSH分泌與合成。其它的可調(diào)節(jié)activin生物活性和/或結(jié)合至activin的蛋白包括卵泡抑制素(FS)、卵泡抑制素相關(guān)蛋白(FSRP)、α2-巨球蛋白、Cerberus和內(nèi)皮糖蛋白(endoglin)。
[0050]TGF-β信號通過I型和II型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體的異聚復(fù)合體調(diào)節(jié)，其通過配體激活而磷酸化以及激活下游的Smad蛋白(Massague, 2000, Nat.Rev.Mo1.CellBiol.1:169-178)。這些I型和II型受體是跨膜蛋白，由帶有富含半胱氨酸區(qū)域的配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和帶有預(yù)知的絲氨酸/蘇氨酸特異性的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成。I型是信號通路所必須的；11型是結(jié)合配體以及表達I型受體所需的。I型和II型activin受體在配體結(jié)合后形成穩(wěn)定的復(fù)合物，導致I型受體被II型受體磷酸化。
[0051]兩種相關(guān)的II型受體，ActRIIa和ActRIIb,已被鑒定為activin的II型受體(Mathews and Vale，1991， Cell65:973-982 ;Attisano 等，1992， Cell68:97-108)。 除activin外，ActRIIa和ActRIIb可以生化地與其它幾種TGF-β家族蛋白相互作用，包括 ΒΜΡ7、Nodal、GDF8 和 GDFll (Yamashita 等，1995，J.Cell Biol.130:217-226 ；Lee 和McPherron,2001, Proc.Natl.Acad.Sc1.98:9306-9311 ；Yeo 和 Whitman, 2001, Mo1.Cell7:949-957 ；0h 等，2002，Genes Dev.16:2749-54)。ALK4 是主要的 activin I 型受體，特別是對activin A而言,并且ALK-7也可以作為activins的受體,特別是對activin B。
[0052]如本發(fā)明所證明的,可溶性的ActRIIa多肽(sActRIIa),其顯示了相對于其它的TGF-beta家族成員諸如⑶F8或⑶FlI基本上優(yōu)先選擇結(jié)合至activin A，可在體內(nèi)有效地促進骨骼生長以及增加骨骼密度。然而不希望受限于任何特定的機制，考慮到通過這些研究中所采用的特定sActRIIa構(gòu)建物所展現(xiàn)的activin非常強的結(jié)合(皮摩爾解離常數(shù))，期望sActRIIa的效果主要是由activin拮抗劑效果所引起的。不考慮機制，這里的數(shù)據(jù)很明顯地表明，ActRIIa-activin拮抗劑確實在正常小鼠以及骨質(zhì)疏松的小鼠模型中增加了骨骼密度。請注意骨骼是動態(tài)組織，其生長或萎縮以及密度的增加或減少依賴于生產(chǎn)骨骼以及刺激礦化(主要是成骨細胞)的因素與破壞以及去除骨骼礦物質(zhì)(主要是破骨細胞)的因素之間的平衡。骨骼的生長和礦化可以通過增加生產(chǎn)性因素或減少破壞性因素或兩者同時進行而增加。術(shù)語“促 進骨骼生長”和“增加骨骼礦化”指的是骨骼的物理學可見的變化并且用來中性地描述骨骼中變化發(fā)生的機制。
[0053]本發(fā)明所描述的研究中采用的骨質(zhì)疏松的小鼠模型以及骨骼生長/密度被認為在人體中是高度預(yù)測具有效果的，因而，本發(fā)明提供了采用ActRIIa多肽以及其它的activin-ActRIIa拮抗劑來在人體中促進骨骼生長和提高骨骼密度。Activin-ActRIIa拮抗劑包括，例如，activin結(jié)合可溶性ActRIIa多肽、結(jié)合至activin (特別是activinA或B亞單位，也指代βΑ或β B)并且中斷ActRIIa結(jié)合的抗體、結(jié)合至ActRIIa并且中斷activin結(jié)合的抗體、選自activin或ActRIIa結(jié)合的非抗體蛋白(參見例如，W0/2002/088171,W0/2006/055689, W0/2002/032925, W0/2005/037989, US2003/0133939,以及US2005/0238646中的這類蛋白的例子以及設(shè)計和選擇相同蛋白的方法)、選自activin或ActRIIa結(jié)合的通常綴合到Fe結(jié)構(gòu)域的隨機肽。兩種具有activin或ActRIIa結(jié)合活性的不同的蛋白(或其它部分)，特別是分別地阻斷I型(例如，可溶性I型activin受體)或II型(例如可溶性II型activin受體)結(jié)合位點的activin結(jié)合子,可以連接起來以產(chǎn)生雙功能性結(jié)合的分子。核酸適體、小分子和其它的抑制activin-ActRIIa信號軸的制劑。各種各樣的蛋白具有activin-ActRIIa拮抗劑活性，包括抑制素(即抑制素α亞單元)(盡管抑制素并不在所有組織中均拮抗activin)、卵泡抑制素(如卵泡抑制素288和卵泡抑制素315)、Cerberus、卵泡抑制素相關(guān)蛋白(FSRP)、內(nèi)皮糖蛋白(endoglin)、activin C、α 2-巨球蛋白和Μ108Α(在108位由甲硫氨酸變?yōu)楸彼?突變activin A。通常地，activin的替代形式，特別是那些在I型受體結(jié)合結(jié)構(gòu)域有變化的，可以結(jié)合至II型受體并且不能形成活性的三重復(fù)合物，因而作為拮抗劑作用。另外，核酸，諸如反義分子，抑制activinA、B、C或E或(特別地)ActRIIa表達的siRNA或核酶,可以用作activin-ActRIIa拮抗劑。優(yōu)選地，所采用的activin-ActRIIa拮抗劑將顯示相對于TGF-beta家族的其它成員(相對于⑶F8和⑶Fll)的抑制activin所調(diào)節(jié)信號的選擇性?？扇苄缘腁ctRIIb結(jié)合至activin,然而，野生型的蛋白并不顯示相對于⑶F8/11的結(jié)合至activin的顯著的選擇性，并且初步實驗顯示，這種不能提供合意的對骨骼的效果，但仍能引起肌肉的顯著生長。然而，具有不同的結(jié)合特性的ActRIIb的改變形式已被鑒定(參見例如，W02006/012627，第55-59頁，通過引用的方式并入本發(fā)明)，并且這些蛋白可以骨骼上的合意的效果。天然的或改變的ActRIIb可以通過稱聯(lián)第二 activin選擇性結(jié)合成分而提供對activin的附加的特異性。
[0054]說明書所用的術(shù)語在本發(fā)明的上下文以及每個術(shù)語所應(yīng)用的特定語境中通常具有其在本領(lǐng)域的普通含義。某些術(shù)語在下文中或在說明書的其它部分被討論，用以在描述本發(fā)明的組合物和方法以及怎樣應(yīng)用上提供給實踐者附加的指導。術(shù)語的任何應(yīng)用的范圍或含義在其所應(yīng)用的特定語境中是清楚的。
[0055]“大約”和“接近”通常意味著考慮測量法的本性和精度時實物量度的可接受的錯誤程度。典型地，示范性的錯誤程度在給定數(shù)值或數(shù)值范圍的20%以內(nèi)，優(yōu)選在10%以內(nèi)，更優(yōu)選地在5%以內(nèi)。
[0056]或者，特定地在生物學系統(tǒng)中，術(shù)語“大約”以及“接近”可能意味著一定數(shù)量級內(nèi)的值，優(yōu)選的是給定數(shù)值5倍以內(nèi)的，更優(yōu)選的是2倍以內(nèi)的。除非另有說明，本發(fā)明給定的數(shù)值是接近的，意味著當沒有明文規(guī)定時，術(shù)語“大約”或“接近”可以推斷。
[0057]本發(fā)明的方法可以包括互相對比序列的步驟，包括野生型的序列與一個或多個突變體(序列變體)比較。這樣的比較通`常包括多聚物序列的比對，例如，采用本領(lǐng)域公知的序列比對程序何/或運算法則(例如，BLAST、FASTA和MEGALIGN，可說出一些)。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易意識到，在這樣的比對中，在一個包含插入或刪除殘基的突變中，比對序列將在不包含插入的或刪除的殘基的多聚物序列中產(chǎn)生“間隙”(gap)(通常以破折號或“A”表示)O
[0058]“同源的”，其所有的語法形式和拼寫變體，指的是具有“共同進化起源”的兩種蛋白之間的關(guān)系，包括來自同種生物體的超家族的蛋白，以及來自不同種的生物體的同源蛋白。這樣的蛋白(及其編碼核酸)具有同源的序列，如由它們的序列相似性反映的，無論從一致性百分比方面或通過特定殘基或基序以及保守位點的存在。
[0059]術(shù)語“序列相似性”，其所有的語法形式，指的是一致性的程度或可能或不可能具有共同進化起源的核酸或氨基酸序列間的對應(yīng)。
[0060]然而，在常見用法和即時申請中，術(shù)語“同源”，當被諸如“高度”這樣的副詞修飾時，可指代序列相似性，并且可能或不可能指代涉及共同進化起源。
[0061]2.ActRIIa 多肽
[0062]在某些方面，本發(fā)明涉及ActRIIa多肽。如本發(fā)明所應(yīng)用的，術(shù)語“ActRIIa”指的是來自任何種屬以及源于通過突變或其它修飾的ActRIIa蛋白變體的激活素IIa型受體家族。本發(fā)明的ActRIIa可以理解為任何現(xiàn)有的鑒別了的形式。ActRIIa家族的成員通常時跨膜蛋白，其由具有富含半胱氨酸區(qū)域的配體結(jié)合胞外結(jié)構(gòu)域、跨膜結(jié)構(gòu)域和具有預(yù)測的絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的細胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
[0063]術(shù)語“ActRIIa多肽”包括包含有任何天然存在的ActRIIa家族成員及其保留有有用活性的任何變體(包括突變體、片段、融合子和擬肽形式)。例如，ActRIIa多肽包括來源于任何至少與ActRIIa多肽具有大約80%—致性的已知ActRIIa的序列的多肽，優(yōu)選地至少85%、90%、95%、97%、99%或更高一致性。例如，本發(fā)明的ActRIIa多肽可以結(jié)合至ActRIIa蛋白和/或activin并抑制其功能。優(yōu)選地，ActRIIa多肽促進骨骼生長和骨礦化。ActRIIa多肽的例子包括人ActRIIa前體多肽(SEQ ID NO:1)以及可溶性的人ActRIIa多肽(例如，SEQ ID NOs:2、3、7 和 12)。
[0064]人ActRIIa前體多肽序列如下:
[0065]MGAAAKLAFAVFLISCSSGAILGRSETQECLFFNANVEKDRT N QTGVEPCYGDKDKRRHCFATffK NISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEG匪CNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPYYNILLYSLVPLMLIAGIVICAFWVYRHHKMAYPPVLVPTQDPGPPPPSPLLGLKPLQLLEVKARGRFGCVWKAQLLNEYVAVKIFPIQDKQSWQNEYEVYSLPGMKHENILQFIGAEKRGTSVDVDLWLITAFHEKGSLSDFLKANVVSffNELCHIAETMARGLA YLHEDIPGLKDGHKPAISHRDIKSKNVLLKNNLTACIADFGLALKFEAGKSAGDTHGQVGTRRYMAPEVLEGAINFQRDAFLRIDM
[0066]YAMGLVLWELASRCTAADGPVDEYMLPFEEEIGQHPSLEDMQE
[0067]VVVHKKKRPVLRDYffQKHAGMAMLCETIEECffDHDAEARLSAG CVGERITQMQRLTNIITTEDIVTVVTMVTNVDFPPKESSL(SEQ ID NO:1)`[0068]信號肽是以單下劃線標示的；胞外結(jié)構(gòu)域以粗體標示，并且潛在的N-連接糖基化位點以雙下劃線標示。
[0069]人ActRIIa可溶性的(胞外)、加工的多肽序列如下:
[0070]ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPP(SEQ ID NO:2)
[0071]胞外結(jié)構(gòu)域的C-末端“尾”以下劃線標示。刪除了“尾”(Λ15序列)的序列如下:
[0072]ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCffLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEM(SEQ ID NO:3)
[0073]編碼人ActRIIa前體多肽蛋白的核酸序列如下(Genebank登入號_001616的164-1705位核苷酸):
[0074]ATGGGAGCTGCTGCAAAGTTGGCGTTTGCCGTCTTTCTTATCTCCTGTTCTT
[0075]CAGGTGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGC
[0076]TAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGT
[0077]GACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTT
[0078]CCATTGAAATAGTGA' A' ACAAGGTTGTTGGCTGGATGAT' ATCAACTGCTATGA
[0079]CAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGC
[0080]TGTGAGGGCAATATGTGTAATGAAA' AGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAG[0081]TCACACAGCCCACTTCAAATCCAGTTAC' ACCTA' AGCCACCCT' ATTACAACAT
[0082]CCTGCTCTATTCCTTGGTGCCACTTATGTTAATTGCGGGGATTGTCATTTGT
[0083]GCATTTTGGGTGTACAGGCATCACAAGATGGCCTACCCTCCTGTACTTGTTC
[0084]CAACTCAAGACCCAGGACCACCCCCACCTTCTCCATTACTAGGGTTGAAACC
[0085]ACTGCT AGTTATTAGAAGTGAAAGCAAGGGGAAGATTTGGTTGTGTCTGGAAA
[0086]GCCCAGTTGCTTAACGAATATGTGGCTGTCAAAATATTTCCAATACAGGACA
[0087]AACAGTCATGGCAAAATGAATACGAAGTCTACAGTTTGCCTGGAATGAAGCA
[0088]TGAGAACATATTACAGTTCATTGGTGCAGAAAAACGAGGCACCAGTGTTGAT
[0089]GTGGATCTTTGGCTGATCAC' AGCATTTCATGAAAAGGGTTCACTATCAGACT
[0090]TTCTTAAGGCTAATGTGGTCTCTTGGAATGAACTGTGTCATATTGCAGAAAC
[0091]CATGGCTAGAGGATTGGCATATTTACATGAGGATATACCTGGCCTAAAAGAT
[0092]GGCCACAAACCTGCCATATCTCACAGGGACATCAAAAGTAAAAATGTGCTGT
[0093]TGAAAAACAACCTGACAGCTTGCATTGCTGACTTTGGGTTGGCCTTAAAATT
[0094]TGAGGCTGGCAAG TCTGCAGGCGATACCCATGGACAGGTTGGTACCCGGAGG [0095]TACATGGCTCCAGAGGTATTAGAGGGTGCTATAAACTTCCAAAGGGATGCAT
[0096]TTTTGAGGATAGATATGTATGCCATGGGATTAGTCCTATGGGAACTGGCTTC
[0097]TCGCTGTACTGCTGCAGATGGACCTGTAGATGAATACATGTTGCCATTTGAG
[0098]GAGGAAATTGGCCAGCATCCATCTCTTGAAGACATGCAGGAAGTTGTTGTGC
[0099]ATAAAAAAAAGAGGCCTGTTTTAAGAGATTATTGGCAGAAACATGCTGGAAT
[0100]GGCAATGCTCTGTGAAACCATTGAAGAATGTTGGGATCACGACGCAGA/ AGCC
[0101]AGGTTATCAGCTGGATGTGTAGGTGAAAGAATTACCCAGATGCAGAGACTAA
[0102]CAAATATTATTACCACAGAGGACATTGTAACAGTGGTCACAATGGTGACAAA
[0103]TGTTGACTTTCCTCCCAAAGAATCTAGTCTATGA(SEQ ID NO:4)
[0104]編碼人ActRIIa可溶性(胞外)多肽的核酸序列如下:
[0105]ATACTTGGTAGATCAGAAACTCAGGAGTGTCTTTTCTTTAATGCTAATTGGG
[0106]AAAAAGACAGAACCAATCAAACTGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGA
[0107]TAAACGGCGGCATTGTTTTGCTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAA
[0108]ATAGTGAAACAAGGTTGTTGGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTG
[0109]ATTGTGTAGAAAAAAAAGACAGCCCTGAAGTATATTTTTGTTGCTGTGAGGG
[0110]CAATATGTGTAATGAAAAGTTTTCTTATTTTCCAGAGATGGAAGTCACACAG CCCACTTCAAATCCAGTTACACcTAAGCCACCC(SEQ ID NO:5)
[0111]在特定的實施方式中，本發(fā)明涉及可溶性的ActRIIa多肽。如本發(fā)明所描述的，術(shù)語“可溶性ActRIIa多肽”通常指代包含ActRIIa蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域的多肽。這里所用的術(shù)語“可溶性ActRIIa多肽”包括任何ActRIIa蛋白的天然存在的胞外結(jié)構(gòu)域及其任意變體(包括突變體、片段和擬肽形式)。Activin-結(jié)合ActRIIa多肽是保留結(jié)合至activin、特別是activinAA、AB或BB的能力的多肽。優(yōu)選地,activin-結(jié)合ActRIIa多肽以InM或更低的解離常數(shù)結(jié)合至activinAA。人ActRIIa前體蛋白的氨基酸序列提供在下面。ActRIIa蛋白的結(jié)合至activin并且通常是可溶的，并因而稱為可溶性的activin-結(jié)合ActRIIa多肽?？扇苄缘腶ctivin-結(jié)合ActRIIa多肽的例子包括如SEQ ID NOs:2、3、7、12和13所說明的可溶性多肽。SEQ ID NO:7指代ActRIIa-hFc，并在實施例中進一步描述。其它的可溶性的activin-結(jié)合ActRIIa多肽包括除ActRIIa蛋白的胞外結(jié)構(gòu)域外加上一個信號序列，例如，蜜蜂蜂毒肽前導序列(SEQ ID NO:8)，組織纖溶酶原激活劑(TPA)前導(SEQ ID NO:9)或者天然的 ActRIIa 前導(SEQ ID NO:10) ? 在 SEQ ID NO:13 中說明的 ActRIIa-hFc 多肽作為TPA前導應(yīng)用。
[0112]ActRIIa多肽的功能活性片段可以通過篩選由編碼ActRIIa多肽的相應(yīng)核酸片段所產(chǎn)生的多肽而獲得。另外，片段可以通過使用公知的在技術(shù)諸如傳統(tǒng)的Merrifield固相f-Moc或t-Boc化學來化學合成。片段可以被生產(chǎn)(重組地或化學合成)并用于測試鑒別那些能行使ActRIIa蛋白拮抗劑(抑制劑)功能的或被activin調(diào)節(jié)信號的肽酰片段。
[0113]ActRIIa多肽的功能活性的變體可以通過篩選編碼ActRIIa多肽的相應(yīng)的誘變處理核酸所產(chǎn)生的修飾的重組多肽的文庫而獲得。變體可以被生產(chǎn)并用于測試鑒別那些能行使ActRIIa蛋白拮抗劑功能的或被activin調(diào)節(jié)信號的。在某些實施方式中，ActRIIa多肽的功能性變體包括與選自SEQ ID NOs:2或3的氨基酸序列具有至少75%同一性的氨基酸序列。在某些例子中，功能性變體具有與選自SEQ ID NOs:2或3的氨基酸序列具有至少80%,85%,90%,95%,97%,98%,99%^； 100% 同一性的氨基酸序列。
[0114]功能性的變體可以通過為了諸如增強治療功效或穩(wěn)定性(例如，間接體內(nèi)保質(zhì)期以及體內(nèi)的抗蛋白降解的能力)的目的修飾ActRIIa多肽的結(jié)構(gòu)而生成，這樣的修飾過的ActRIIa多肽當被選擇保留activin結(jié)合時,被認為是天然存在的ActRIIa多肽的功能性等同物。修飾的ActRIIa多肽也可以生產(chǎn)，例如，通過氨基酸替代、刪除或添加。例如，可以合理地預(yù)期以異亮氨酸或纈氨酸單獨替代亮氨酸、以谷氨酸單獨替代天冬氨酸、以絲氨酸單獨替代蘇氨酸、或者以結(jié)構(gòu)相關(guān)的氨基酸替代另一個氨基酸(例如，保守突變)不會對所產(chǎn)生的分子的生物學活性帶來大的影響。保守替換是那些在家族內(nèi)的側(cè)鏈相關(guān)的氨基酸之間發(fā)生的替換。ActRIIa多肽氨基酸序列的改變的結(jié)果是否為功能同源容易通過評估ActRIIa多肽變體以類似于野生型的ActRIIa多肽的方式在細胞內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)答的能力來確定。
[0115]在某些實施方式中，本發(fā)明涵蓋了 ActRIIa多肽的特定突變以便改變多肽的糖基化。這樣的突變可以選擇以便引入或消除一個或多個糖基化位點，O-連接或N-連接糖基化位點。天冬酰胺-連接的糖基化識別位點通常包括三肽序列，天冬酰胺-X-蘇氨酸(或天冬酰胺-X-絲氨酸)(這里的X可以是任何氨基酸)，其被適當?shù)募毎腔柑禺惖刈R另O。改造也可以通過一個或多個絲氨酸或蘇氨酸殘基添加或替代至野生型的ActRIIa多肽(對于O-連接的糖基化位點)而進行。在糖基化識別位點的第一個或第三個氨基酸位點的之一或兩者同時的各種氨基酸替換或刪除(和/或在第二個位點氨基酸刪除)導致在修飾的三肽序列的非糖基化。另一在ActRIIa多肽上增加碳水化合物數(shù)目的方法可以通過化學耦合或酶耦合糖苷至ActRIIa多肽。依賴于所采用的耦合模式，糖可以被附加至(a)精氨酸和組氨酸；(b)自由羧基；(c)自由巰基諸如半胱氨酸的自由巰基；(d)自由羥基諸如絲氨酸、蘇氨酸或羥脯氨酸的自由羥基；(e)芳香殘基諸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香殘基；或(f)谷胺酰胺的酰胺基團。這些方法在W087/05330(1987年9月11日公開)以及 Aplin 和 Wriston (1981) CRC Crit.Rev.Biochem.，259-306 頁中有描述，并以引用的方式并入本發(fā)明。可以通過化學和/或酶學的方法完成移除ActRIIa多肽上的一個或多個碳水化合物。化學去糖基化可涉及，例如，ActRIIa多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。這種處理導致除連接的糖(N-乙?；咸烟腔騈-乙酰基半乳糖胺)之外的大部分或所有的糖的切除，而同時保持氣基酸序列的完整?；瘜W去糖基化在Hakimuddin等.(1987)Arch.Biochem.Biophys.259:52 以及 Edge 等.(1981)Anal.Biochem.118: 131 中有進一步的描述。ActRIIa多肽上的碳水化合物的酶學切除可以通過使用由Thotakura等.(1987)Meth.Enzymol.138:350所描述的各種內(nèi)糖苷酶或外糖苷酶來實現(xiàn)。ActRIIa多肽的序列可以適當?shù)卣{(diào)節(jié)，其依賴于所采用的表達體系的類型，如哺乳動物、酵母、昆蟲以及植物細胞均可以引入不同的糖基化模式，其可以被肽的氨基酸序列所影響。通常情況下，用于人類的ActRIIa多肽可以在能提供正確的糖基化的哺乳動物細胞系中表達，如HEK293細胞或CHO細胞系，盡管可以預(yù)期其它的哺乳動物表達細胞系、具有工程的糖基化酶的酵母細胞系以及昆蟲細胞系也可以用于表達。
[0116]本發(fā)明進一步地涵蓋了生成突變子的方法，特別是ActRIIa多肽的成套組合突變體以及截斷突變體的方法；組合突變體的庫對于鑒別功能性的變體序列特別有用。篩選這樣的組合文庫的目的在于產(chǎn)生，例如，或作為激動劑或作為拮抗劑作用的ActRIIa多肽的變體，或替代地，具有所有新活性的突變體。各種篩選方法在下面提供，并且這樣的方法可用于評估變體。例如，ActRIIa多肽的變體可以通過結(jié)合至ActRIIa配體而防止ActRIIa配體結(jié)合至ActRIIa多肽或干擾通過ActRIIa配體引起的信號的能力來篩選。
[0117]ActRIIa多肽或其變體的活性也可以在細胞基礎(chǔ)上或在體內(nèi)測試。例如，可以評估ActRIIa多肽變體在表達涉及骨骼生產(chǎn)或骨骼破壞的基因的效果。如果需要，這可以在一個或多個重組的ActRIIa配體蛋白(例如，activin)的存在時完成，并且細胞可以被轉(zhuǎn)染以生產(chǎn)ActRIIa多肽和/或其變體以及(視情況)ActRIIa配體。同樣地，ActRIIa多肽可以施用給小鼠或其它動物，并且評估一種或多種骨骼特性諸如密度或容積。骨折的治愈率也可以被評估。雙能X射線吸收測定(DEXA)是一種成熟的、非侵入的評估動物中的骨密度的定量技術(shù)。人的中樞DEXA系統(tǒng)可以用于評估脊椎和骨盆的骨密度。這些是總骨骼密度最好的預(yù)測體。外周DEXA系統(tǒng)可以用于評估外周骨骼的密度，包括例如，手、腕、腳踝以及足的骨骼。傳統(tǒng)的X射線圖象系統(tǒng)，包括CAT掃描，可以用于評估骨骼生長以及骨折愈合。骨骼的機械強度也可以被評估。`
[0118]組合來源的變體可以生成，其相對于天然存在的ActRIIa多肽具有選擇性的或通常的增長的潛能。同樣地，突變可以導致變體具有戲劇性地不同于相應(yīng)的野生型ActRIIa多肽的胞內(nèi)半衰期。例如，改變的蛋白對于蛋白水解或其它的導致其被破壞的細胞進程或相反地天然ActRIIa多肽的失活或者更穩(wěn)定或者更不穩(wěn)定。這樣的變體以及編碼它們的基因，可以利用來通過調(diào)節(jié)ActRIIa多肽的半衰期來改變ActRIIa多肽的水平。例如，短半衰期可以導致更多的瞬時生物學效應(yīng)以及可允許更緊密地控制患者體內(nèi)的重組ActRIIa多肽的水平。在Fe融合蛋白中，突變可以是在連接子中(如果有)和/或Fe部分以改變蛋白的半衰期。
[0119]重組文庫可以通過編碼多肽文庫的簡并基因文庫的方式產(chǎn)生，所述的每個多肽均包括至少一部分潛在的ActRIIa多肽序列。例如，合成的寡核苷酸混合物可以酶學地連接入基因序列使得潛在的ActRIIa多肽核苷酸序列的簡并形式可作為單獨的多肽表達，或替代地，作為更大的融合蛋白的形式(例如，噬菌體展示)表達。[0120]有很多中潛在同源物的文庫從簡并寡核苷酸序列中產(chǎn)生的方法。簡并基因序列的化學合成可以在DNA自動合成儀中進行，并且合成的基因隨后被連接入合適的表達用的載體。簡并寡核苷酸的合成在本領(lǐng)域是公知的(參見例如,Narang, SA (1983) Tetrahedron39:3;Itakura 等,(1981)重組 DNA, Proc.3rd Cleveland Sympos.Macromolecules,編輯.AGWalton, Amsterdam:Elsevier273-289 頁；Itakura 等，(1984) Annu.Rev.Biochem.53:323 ；Itakura 等,(1984) Sciencel98:1056 ;Ike 等，(1983)Nucleic Acid Res.11:477)。這些技術(shù)已被應(yīng)用于其它蛋白的定向進化(參見例如，Scott等，(1990)Science249:386-390 ；Roberts 等，(1992)PNAS USA89:2429-2433 ；Devlin 等，(1990)Science249:404-406 ；Cwirla 等，(1990)PNAS USA87:6378-6382 ;以及美國專利 5, 223, 409,5, 198,346 和5，096，815)
[0121]或者，其它形式的突變可用于產(chǎn)生組合文庫。例如，ActRIIa多肽的變體可以產(chǎn)生并通過采用例如丙氨酸篩選突變以及類似的(Ruf等，(1994)Biochemistry33:1565-1572 ；ffang 等，(1994) J.Biol.Chem.269:3095-3099 ；Balint 等，(1993)Genel37:109-118 ；Grodberg 等，(1993) Eur.J.Biochem.218:597-601 ;Nagashima 等，(1993)J.Biol.Chem.268:2888-2892；Lowman 等，(1991)Biochemistry30:10832-10838 ；和Cunningham 等,(1989) Science244:1081-1085)、通過接頭分區(qū)突變(Gustin 等，(1993)Virologyl93:653-660 ；Brown 等，(1992)Mo1.Cell Biol.12:2644-2652 ；McKnight 等，(1982)Science232:316)、通過飽和突變(Meyers 等，(1986) Science232:613)、通過 PCR突變(Leung等，(1989)Method Cell MoI Bioll:11-19)或通過隨機突變，包括化學突變等(Miller et al., (1992)A Short Course in Bacterial Genetics, CSHL Press, ColdSpring Harbor, NY ；and Greener 等,(1994) Strategies in MoI Biol7:32-34)從文庫中篩選分離出來。接頭分區(qū)突變，特別地是在組合設(shè)定中，是一種有吸引力的鑒別截短(生物活性)形式的ActRIIa多肽的方法。
[0122]用于篩選通過點突`變和截短得到的組合文庫中的基因產(chǎn)品的范圍廣泛的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的，并且，就此而言，對篩選具有某種特性的基因產(chǎn)品的cDNA文庫。這樣的技術(shù)通常適應(yīng)于快速篩選通過ActRIIa多肽的組合突變生成的基因文庫。最廣泛地用于篩選大的基因文庫的技術(shù)通常包括克隆基因文庫入可復(fù)制的表達載體、以獲得的載體文庫轉(zhuǎn)化合適的細胞、并且在檢測合意的活性使得分離編碼所檢測的產(chǎn)物的基因的載體相對容易的條件下表達組合基因。優(yōu)選的方法包括activin結(jié)合分析以及activin調(diào)節(jié)的細胞信號分析。
[0123]在某些實施方式中，本發(fā)明的ActRIIa多肽可以進一步包括翻譯后的修飾任何天然存在于ActRIIa多肽的。這樣的修飾包括但不限于，乙酰化、羧基化、糖基化、磷酸化、月旨質(zhì)化以及?；＝Y(jié)果是，修飾后的ActRIIa多肽可包含非氨基酸元件，諸如聚乙二醇、月旨質(zhì)、多糖或單糖以及磷酸鹽。這樣的非氨基酸元件在ActRIIa多肽的功能上的效果可以如本發(fā)明所述的對于其它的ActRIIa多肽變體那樣測試。當ActRIIa多肽通過剪切ActRIIa多肽的初生形式而在細胞內(nèi)生成時，翻譯后進程對蛋白質(zhì)的正確折疊和/或功能也是重要的。不同的細胞系(諸如CH0、Hela、MDCK、293、WI38、NIH-3T3或HEK293)對于這樣的翻譯后行為具有特異的細胞機器以及特有的機制，并且可被選用來確保正確修飾和ActRIIa多肽的進程。
[0124]在某些方面，ActRIIa多肽的功能性變體或修飾形式包括具有至少一部分ActRIIa多肽和一個或多個融合結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。公知的這樣的融合結(jié)構(gòu)域的例子包括但不限于多聚組氨酸、Glu-Glu、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、硫氧還蛋白、A蛋白、G蛋白、免疫球蛋白重鏈恒定區(qū)(Fe)、麥芽糖結(jié)合蛋白(MBP)或人血清白蛋白?？梢赃x擇融合結(jié)構(gòu)域以賦予合意的特性。例如，一些融合結(jié)構(gòu)域特定地用于通過親和層析分離融合蛋白。為達到親和純化的目的，采用親和層析相關(guān)的基質(zhì)諸如谷胱甘肽、淀粉酶以及鎳綴合或鈷綴合的樹脂。許多這樣的基質(zhì)可以以“試劑盒”的形式獲得，諸如Pharmacia GST純化體系以及QIAexpress?體系(Qiagen)與有用的(HISg)融合伴侶。作為另外的例子，可以選擇融合結(jié)構(gòu)域以有助于檢測ActRIIa多肽。這樣的檢測結(jié)構(gòu)域的例子包括各種熒光蛋白(例如GFP)以及“表位標記”，其通常是可獲得的特異抗體的短肽序列。公知的對于特異單克隆抗體的表位標記容易獲得，包括FLAG、流感病毒血凝素(HA)以及c-myc標記。在一些例子中，融合結(jié)構(gòu)域具有諸如對于Xa因子或凝血酶的蛋白酶切位點，其允許相關(guān)的蛋白酶部分地消化融合蛋白并因而從中釋放重組蛋白。釋放的蛋白然后通過隨后的層析分離而從融合結(jié)構(gòu)域中分離。在某些優(yōu)選的實施方式中，ActRIIa多肽融合有在體內(nèi)穩(wěn)定ActRIIa多肽的結(jié)構(gòu)域(“穩(wěn)定器”結(jié)構(gòu)域)。通過“穩(wěn)定”意味著可以增加血清半衰期的任何物質(zhì)，不考慮其是否是因為降低了破壞、腎臟清除的降低或其它藥物動力學效應(yīng)。已知與免疫球蛋白的Fe部分的融合可賦予范圍廣泛的蛋白以合意的藥物動力學特性。此外，融合人血清白蛋白可賦予合意的特性?？蛇x擇的其它類型的融合結(jié)構(gòu)域包括多聚結(jié)構(gòu)域(例如二聚、四聚)以及功能性結(jié)構(gòu)域(其賦予另外的生物學功能，諸如進一步刺激骨骼生長或肌肉生長，如所希望的那樣)。
[0125]作為特定的例子，本發(fā)明提供了包括融合至Fe結(jié)構(gòu)域(例如SEQ ID NO:6)的ActRIIa的可溶性胞外結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。
[0126]THTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVD(A)VSHEDPEVKF
[0127]NWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK(A)VSNKAL
[0128]PVPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESN
[0129]GQPENNYKTTPPVLDSDGPFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHN(A)HYT 0KSLSLSPGK*
[0130]可選擇地，F(xiàn)e結(jié)構(gòu)域在殘基(諸如天冬氨酸265、賴氨酸322以及天冬酰胺434)中具有一個或多個突變。在某些例子中，具有一個或多個這樣的突變(例如天冬氨酸265突變)的突變體Fe結(jié)構(gòu)域相對于野生型的Fe結(jié)構(gòu)域具有削減的結(jié)合至Fe Y受體的能力。在其它的例子中，具有一個或多個這樣的突變(例如冬酰胺434突變)的突變體Fe結(jié)構(gòu)域相對于野生型的Fe結(jié)構(gòu)域具有增加的結(jié)合至MHC I類相關(guān)Fe受體(FcRN)的能力。
[0131]當然，融合蛋白的不同元件可以以任何與想得到的功能相一致的方式安排。例如，ActRIIa多肽可以置于異源結(jié)構(gòu)域的C末端，或替代地，異源結(jié)構(gòu)域可置于ActRIIa多肽的C末端。ActRIIa多肽結(jié)構(gòu)域和異源結(jié)構(gòu)域不需要在融合蛋白中緊鄰，并且附加的結(jié)構(gòu)域或氨基酸序列可以包括C末端或N末端至兩個結(jié)構(gòu)域之一或處于兩個結(jié)構(gòu)域之間。
[0132]在某些實施方式中，本發(fā)明的ActRIIa多肽含有一個或多個可以穩(wěn)定ActRIIa多肽的修飾。例如，這樣的修飾增強ActRIIa多肽在體內(nèi)的半衰期，增強ActRIIa多肽的循環(huán)半衰期或減少ActRIIa多肽的蛋白降解。這樣的穩(wěn)定修飾包括但不限于融合蛋白(包括，例如，包含ActRIIa多肽和穩(wěn)定器結(jié)構(gòu)域的融合蛋白)、糖基化位點的修飾(包括，例如，附加糖基化位點至ActRIIa多肽)以及碳水化合物的修飾(包括，例如，從ActRIIa多肽中移除碳水化合物)。就融合蛋白而言，ActRIIa多肽融合至諸如IgG分子的穩(wěn)定器結(jié)構(gòu)域(例如Fe結(jié)構(gòu)域)。如同本發(fā)明所應(yīng)用的，術(shù)語“穩(wěn)定器結(jié)構(gòu)域”不僅指代融合蛋白中的融合結(jié)構(gòu)域(例如Fe)，而且包括諸如碳水化合物的非蛋白質(zhì)修飾或諸如聚乙二醇的非蛋白質(zhì)聚合體。
[0133]在某些實施方式中，本發(fā)明使得可獲得分離形式和/或純化形式的ActRIIa多肽，其分離自或相反地基本上從其它蛋白游離。ActRIIa多肽通常通過從重組核酸表達而產(chǎn)生。
[0134]3.編碼ActRIIa多肽的核酸
[0135]在某些方面，本發(fā)明提供了分離的和/或重組的編碼任何ActRIIa多肽(例如可溶性ActRIIa多肽)包括片段、功能性變體和本發(fā)明所公開的融合蛋白的核酸。例如，SEQID NO:4編碼天然存在的人ActRIIa前體多肽，而SEQ ID NO:5編碼ActRIIa的加工的胞外結(jié)構(gòu)域。目標核酸可以是單鏈的或雙鏈的。這樣的核酸可以是DNA分子或RNA分子。這些核酸可以用于，例如，制造ActRIIa多肽的方法或直接的治療劑(例如，在基因治療方法中)。
[0136]在某些方面，應(yīng)進一步了解編碼ActRIIa多肽的目標核酸包括SEQ ID NO:4或5的變體的核酸。變體核苷酸序列包括一個或多個核苷酸取代、添加或刪除的不同的序列，諸如等位基因變體。
[0137]在某些實施方式中，本發(fā)明提供了與SEQ ID NO:4或5具有至少80%、85%、90%、95^^97^^98^^99%或100%同一性的分離的或重組的核酸序列。本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當了解與SEQ ID NO:4或5互補以及與SEQ ID NO:4或5的變體互補的核酸序列都可以包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在進一 步的實施方式中，本發(fā)明的核酸序列可以是分離的、重組的和/或與異源核苷酸序列融合的或在DNA文庫中。
[0138]在其它的實施方式中，本發(fā)明的核酸還可以包括在嚴謹條件下雜交至SEQ ID NO:4或5中指定核苷酸序列、SEQ ID NO:4或5的互補序列或其片段的核苷酸序列。如上面所討論的，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員應(yīng)當容易了解，促進DNA雜交的適宜的嚴謹條件可以變動。例如，可以在6.0x氯化鈉/檸檬酸鈉(SSC)在約45°C進行雜交，隨后在50°C以2.0x SSC洗滌。例如，洗滌步驟的鹽濃度可以選擇從2.0x SSC、50°C的低嚴謹條件至0.2x SSC,50°C的高嚴謹條件。另外，洗滌步驟的溫度可以從約22°C的室溫的低嚴謹條件至約65°C的高嚴謹條件。溫度和鹽都可以變動，或者溫度或者鹽濃度可在另一個可變條件改變是保持恒定。在某些實施方式匯總，本發(fā)明提供了在6x SSC、室溫的低嚴謹條件下雜交、隨后在室溫下以2x SSC洗滌的核酸。
[0139]由于遺傳密碼子的簡并而與SEQ ID NO:4或5中的核酸不同的分離的核酸分子也包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。例如，大量的氨基酸通過不止一個的三聯(lián)密碼子指定。指向相同的氨基酸的密碼子或同義密碼子(例如，CAU和CAC是組氨酸的同義密碼子)可以導致“沉默”突變，其不會影響蛋白質(zhì)的氨基酸序列。然而，我們預(yù)期確實導致目標蛋白的氨基酸序列的變化的DNA序列的多態(tài)性存在于哺乳動物細胞中。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當了解編碼特定蛋白的核酸的在一個或多個核苷酸(至多3-5%的核苷酸)上的變異由于天然的等位變異可以存在于給定種屬的個體黨中。任意或全部的這樣的核苷酸的變異以及導致的氨基酸多態(tài)性都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0140]在某些實施方式中，本發(fā)明的重組核酸可操作的連接到表達構(gòu)建物的一個或多個調(diào)節(jié)核苷酸序列。調(diào)節(jié)何干算序列通常適宜于表達所應(yīng)用的訴諸細胞。本領(lǐng)域公知用于各種宿主細胞的很多類型的適宜的表達載體以及合適的調(diào)節(jié)序列。通常地，所述的一個或多個調(diào)節(jié)核苷酸序列可以包括但不限于啟動子序列、前導或信號序列、核糖體結(jié)合位點、轉(zhuǎn)錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或激活子序列。本領(lǐng)域公知的構(gòu)建的或誘導的啟動子被本發(fā)明所涵蓋。啟動子或者是天然存在的啟動子，或者是一個以上的啟動子組合元件的雜合啟動子。表達構(gòu)建物可存在于細胞內(nèi)的游離體上，諸如質(zhì)粒,或表達構(gòu)建物插入染色體內(nèi)。在一個優(yōu)選的實施方式中，表達載體包含可選擇的標記基因以允許選擇轉(zhuǎn)化宿主?？蛇x擇的標記基因是本領(lǐng)域公知的并且隨采用的宿主細胞而變化。
[0141]在本發(fā)明的某些方面，目標核酸提供在一個包含編碼ActRIIa多肽的核苷酸序列的表達載體內(nèi)，并可操作地連接至至少一個調(diào)節(jié)序列。調(diào)節(jié)序列是本領(lǐng)域公認的以及被選擇來引導ActRIIa多肽的表達。相應(yīng)地，術(shù)語調(diào)節(jié)序列包括啟動子、增強子和其它表達控制元件。示范性的調(diào)節(jié)序列描述于Goeddel ;基因表達技術(shù):酶學方法，Academic Press, SanDiego,CA(1990)。例如，任意大范圍的控制DNA序列表達的表達控制序列，當被可操作地連接時，可用于表達編碼ActRIIa多肽的DNA序列的表達。這樣的有用的表達控制序列包括，例如，SV40的早期或晚期啟動子、tet啟動子、腺病毒或巨細胞病毒立即早期啟動子、RSV啟動子、乳糖操縱子系統(tǒng)、色氨酸系統(tǒng)、TAC或TRC系統(tǒng)、由T7RNA聚合酶引導表達的T7啟動子、λ噬菌體的主要操作和啟動區(qū)域、fd山羊蛋白的控制區(qū)域、3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的啟動子、酸性磷酸酶的啟動子例如Pho5、酵母α -雜交因子的啟動子、桿狀病毒系統(tǒng)的多面體啟動子以及其它已知的控制原核細胞或真核細胞或它們的病毒基因及其各種重組體表達的序列。應(yīng)當了解，表達載體的設(shè)計依賴于諸如待轉(zhuǎn)化的宿主細胞和/或想表達的蛋白類型的選擇的因子。此外，還應(yīng)當考慮載體拷貝的數(shù)量、控制拷貝數(shù)量以及載體所編碼的任何其它蛋白諸如抗生素標記的表達的能力。
[0142]本發(fā)明的重組核酸可以通過連接克隆的基因或其片段入適合或在原核細胞中或在真核細胞(酵母、鳥類、昆蟲或哺乳動物)中或在兩者中表達的載體而生產(chǎn)。重組ActRIIa多肽的生產(chǎn)用表達載體包括質(zhì)粒和其它載體。例如，合適的載體包括下列類型的質(zhì)粒:用于諸如大腸桿菌的原核細胞中 表達的PBR322-來源的質(zhì)粒、pEMBL-來源的質(zhì)粒、pEX-來源的質(zhì)粒、pBTac-來源的質(zhì)粒以及pUC-來源的質(zhì)粒。
[0143]一些哺乳動物表達載體同時包含有助于載體在細菌中繁殖的原核序列以及一個或多個表達于真核細胞的真核轉(zhuǎn)錄單元。PcDNAI/amp、pcDNAI/neo、pRC/CMV、pSV2gpt、pSV2neo、pSV2_dhfr、pTk2、pRSVneo、pMSG、pSVT7、pko-neo 以及 pHyg 來源的載體是適合真核細胞轉(zhuǎn)染的哺乳動物表達載體的例子。這些載體中的一部分被細菌質(zhì)粒來源的序列所修飾，諸如PBR322，以有助于在原核細胞和真核細胞中的復(fù)制以及藥物抗性選擇。另一選擇為，病毒的衍生物諸如牛乳頭瘤病毒(BPV-1)或eb病毒(pHEBo、pREP來源的以及p205)可用于在真核細胞中蛋白的瞬時表達。其它的病毒(包括逆轉(zhuǎn)錄病毒)表達體系的例子可以在下面基因治療導入系統(tǒng)的描述中找到。制備質(zhì)粒以及轉(zhuǎn)化宿主生物體的過程中所采用的各種方法是本領(lǐng)域公知的。其它的同時適合原核以及真核細胞的表達系統(tǒng)以及通常的重組過程，參見 Molecular Cloning A Laboratory Manual,第三版，由 Sambrook,Fritsch 和Maniatis 編輯(Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001)。在某些例子中，米用牛乳頭瘤病毒表達系統(tǒng)來表達重組多肽是合適的。這樣的牛乳頭瘤病毒表達系統(tǒng)的例子包括PVL-來源的載體(諸如PVL1392、pVL1393和pVL941)、pAcUff-漣源的載體(諸如pAcUWl)以及PBlueBac-來源的載體(諸如包含pBlueBacIII的β半乳糖苷酶)。
[0144]在優(yōu)選的實施方式中，載體被設(shè)計為在CHO細胞中生產(chǎn)目標ActRIIa多肽，諸如Pcmv-Script 載體(Stratagene, La Jolla, Calif)、pcDNA4 載體(Invitrogen, Carlsbad,Calif)和pC1-neo載體(Promega,Madison, Wise)。顯然地，目標基因構(gòu)建物可用于引起目標ActRIIa多肽在培養(yǎng)基中繁殖的細胞中的表達，例如，以產(chǎn)生蛋白，包括融合蛋白或突變體蛋白，用于純化。
[0145]本發(fā)明還涉及轉(zhuǎn)染了重組基因的宿主細胞，所述的宿主基因包括編碼一個或多個目標ActRIIa多肽的編碼序列(例如，SEQ ID NO:4或5)。宿主細胞可以是任何的原核或真核細胞。例如，本發(fā)明的ActRIIa多肽克表達在細菌中，諸如大腸桿菌、昆蟲細胞(例如采用牛乳頭瘤病毒表達系統(tǒng))、酵母或哺乳動物細胞。其它合適的宿主細胞是本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的。
[0146]相應(yīng)地，本發(fā)明進一步地涉及生產(chǎn)目標ActRIIa多肽的方法。例如，轉(zhuǎn)化了編碼ActRIIa多肽的表達載體可在適宜的條件下培養(yǎng)以允許ActRIIa多肽表達。ActRIIa多肽可從細胞以及包含ActRIIa多肽的基質(zhì)的混合物中分泌并分離出來。另外的選擇是，ActRIIa多肽可留在細胞質(zhì)中或作為膜組分并收獲細胞、溶解并分離蛋白。細胞培養(yǎng)物包括宿主細胞、基質(zhì)和其它副產(chǎn)品。合適的細胞培養(yǎng)基質(zhì)是本領(lǐng)域公知的。目標ActRIIa多肽可從細胞培養(yǎng)基質(zhì)、宿主細胞或同時從兩者中分離，采用本領(lǐng)域公知的技術(shù)純化蛋白，包括離子交換層析、凝膠過濾層析、超濾、電泳、采用特異于ActRIIa多肽的特定表位的抗體的免疫親和純化以及采用結(jié)合至融合到ActRIIa多肽的結(jié)構(gòu)域的制劑的親和純化(例如，A蛋白柱可用于純化ActRIIa-Fc融合蛋白)。在一個優(yōu)選的實施方式中，ActRIIa多肽是包含有助于純化的結(jié)構(gòu)域的融合蛋白。在一個優(yōu)選的實施方式中，純化通過一系列的柱層析步驟而達到，包括，例如，以任何順序的三個或多個的以下步驟:A蛋白層析、Q瓊脂糖層析、苯基瓊脂糖層析、尺寸排阻層析以及陽離子交換層析。純化可以通過病毒過濾和緩沖交換而完成。如本發(fā)明所證明的，ActRIIa-hFc蛋白純化至以尺寸阻排層析確定大于98%而以SDS PAGE確定大于95%的純度。這樣的純度`對于在小鼠的骨骼上獲得想要的效果以及在小鼠、大鼠和非人靈長類中的可接受的藥物安全性來說是足夠的。
[0147]在另一實施方式中，編碼純化前導序列的融合基因，諸如重組ActRIIa多肽合意部分N末端位置的多聚_(組氨酸)/腸激酶切割位點序列，可允許采用Ni2+金屬樹脂通過親和層析純化所表達的融和蛋白。純化前導序列隨后通過腸激酶處理而移除以提供純化的ActRIIa 多妝(例如，參見 Hochuli 等，(1987) J Chromatography411:177 ;以及 Janknecht等，PNAS USA88:8972)。
[0148]制備融合蛋白的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。本質(zhì)上，編碼不同的多肽序列的各種DNA片段的連接是通過相應(yīng)的傳統(tǒng)技術(shù)完成的，采用blunt-ended或stagger-ended末端來連接、限制性酶消化以提供合適的末端、適當?shù)那闆r下填補粘性末端、堿性磷酸酶處理以避免不想要的連接，以及酶連接。在另一實施方式中，融合基因可以通過傳統(tǒng)技術(shù)包括自動DNA合成儀來合成?；蛘撸蚱蔚腜CR擴增可采用接頭引物來執(zhí)行，所述的接頭引物使兩個連續(xù)的可隨后退火以產(chǎn)生嵌合基因序列的基因片段之間互補懸垂(參見例如，CurrentProtocols in Molecular Biology, Ausubel 等編輯，John Wiley&Sons:1992)。[0149]4.選擇性的Activin和ActRIIa拮抗劑
[0150]本發(fā)明所提供的數(shù)據(jù)證明了 activin-ActRIIa信號的拮抗劑可用于促進骨骼生長以及骨礦化。盡管可溶性的ActRIIa多肽，特別是ActRIIa-Fc，是優(yōu)選的拮抗劑，并且盡管這樣的拮抗劑可通過不止activin拮抗的機制來影響骨骼(例如，activin抑制可以具有抑制光譜分子活性趨向的指示劑，包括，可能的，TGF-beta超家族的其它成員，并且這樣的群體抑制可能導致所希望的骨骼上的效果)，可以預(yù)期其它類型的activin-ActRIIa拮抗劑是有效的，包括抗_activin(例如A、B、C或E)抗體、抗ActRIIa抗體、反義物、抑制ActRIIa生產(chǎn)的RNAi或核酶核酸以及其它的activin或ActRIIa的抑制劑，特別是那些破壞activin-ActRIIa結(jié)合的抑制劑。
[0151]特異地與ActRIIa多肽(例如，可溶性的ActRIIa多肽)反應(yīng)的抗體、以及或者競爭性結(jié)合而與ActRIIa多肽配合的或者相反地抑制ActRIIa調(diào)節(jié)的信號的物質(zhì)可用作ActRIIa多肽活性的拮抗劑。此外，特異地與activinA多肽反應(yīng)的抗體以及破壞ActRIIa結(jié)合的抗體也可用作拮抗劑。
[0152]采用來自ActRIIa多肽或activin多肽的免疫原，可通過標準方法(參見，例如，A Laboratory Manual 由 Harlow 和 Lane 編輯(Cold Spring Harbor Press:1988))制備抗-蛋白/抗-多肽抗血清或單克隆抗體。哺乳動物，諸如小鼠、倉鼠或家兔可用ActRIIa多肽的免疫原形式、能夠引發(fā)抗體反應(yīng)的抗原性片段或融合蛋白免疫。賦予蛋白或多肽免疫原性的技術(shù)包括綴合載體或其它本領(lǐng)域公知的技術(shù)。ActRIIa或activin多肽的免疫原性部分可在佐劑存在的情況下施用。免疫過程可通過檢測抗體在血漿或血清中的滴度來檢測。標準ELISA或其它的免疫方法可與作為抗原的免疫原一起使用以評估抗體水平。
[0153]在以ActRIIa多肽的抗原性制劑免疫動物之后，得到抗血清，如果需要，可以從血清中分離多克隆抗體。為產(chǎn)生單克隆抗體，可從免疫的動物收集抗體產(chǎn)生細胞(淋巴細胞)并通過標準的體細胞融合步驟與諸如骨髓瘤細胞的永生化細胞融合以生產(chǎn)雜交瘤細胞。這樣的技術(shù)是本領(lǐng)域公知`的，包括，例如，雜交瘤技術(shù)(最開始由Kohler和Milstein開發(fā)，(1975) Nature, 256:495-497)、人類 B 細胞雜交瘤技術(shù)(Kozbar 等，(1983) ImmunologyToday，4:72)以及EBV-雜交瘤技術(shù)來生產(chǎn)人單克隆抗體(Cole等，(1985)單克隆抗體和癌癥治療，Alan R.Liss, Inc.77_96頁)。雜交瘤細胞可以通過免疫化學篩選以生產(chǎn)與ActRIIa多肽特異性反應(yīng)的抗體，并且單克隆抗體從包含這樣的雜交瘤細胞的培養(yǎng)基中分離。
[0154]本發(fā)明所用的術(shù)語“抗體”旨在包括那些也能與目標多肽特異性反應(yīng)的片段?？贵w可采用傳統(tǒng)的技術(shù)片段化，并且用上面所描述的用于全抗體的同樣的方法篩選片段。例如，？(&13)2片段可以通過以胃蛋白酶處理生成。產(chǎn)生的F(ab)2片段可以處理以較少二硫橋鍵來生產(chǎn)Fab片段。本發(fā)明的抗體進一步旨在包括雙特異的、單鏈的、嵌合的、人源化以及由至少一個抗體⑶R區(qū)域賦予的ActRIIa或activin多肽親和性的全長人類分子?？贵w可進一步包括另外附加并能夠被檢測的標簽(例如，標簽可以是放射性同位素、熒光化合物、酶或輔酶因子)。
[0155]在某些實施方式中，抗體是重組抗體，其術(shù)語包括了任意的部分地以分子生物學技術(shù)產(chǎn)生的抗體，包括CDR移植的抗體或嵌合抗體、人的或組裝自文庫選擇的抗體結(jié)構(gòu)域的抗體、單鏈抗體以及單結(jié)構(gòu)域抗體(例如，人Vh蛋白或camelid Vhh蛋白)。在某些實施方式中，本發(fā)明的抗體是單克隆抗體，并且在某些實施方式中，本發(fā)明使得生產(chǎn)新抗體的方法成為可能。例如，一種生產(chǎn)特異地結(jié)合至ActRIIa多肽或activin多肽的單克隆抗體的方法，包括給小鼠施用一定劑量的包含有效量的刺激可檢測的免疫反應(yīng)的抗原多肽的免疫原組合物，從小鼠中獲得抗體生產(chǎn)細胞(例如，脾臟中的細胞)并將抗體生產(chǎn)細胞與骨髓瘤細胞融合以獲得抗體生產(chǎn)雜交瘤，檢測抗體生產(chǎn)雜交瘤以鑒別可以生產(chǎn)特異性結(jié)合抗原的單克隆的雜交瘤。一旦獲得，從細胞培養(yǎng)基中繁殖雜交瘤，視情況在雜交瘤來源的生產(chǎn)特異性結(jié)合抗原的細胞的培養(yǎng)條件下。單克隆抗體可從細胞培養(yǎng)基中純化。
[0156]形容詞“特異地與之反應(yīng)”在此指代抗體，意思是，如本領(lǐng)域通常理解的那樣，抗體在特定生物樣品中的感興趣的抗原(例如，ActRIIa多肽)和其它的非感興趣的抗原之間具有充分的選擇性的。在某些采用抗體的方法中，諸如治療應(yīng)用中，結(jié)合的高度特異性是必要的。單克隆抗體通常具有更大的趨向(與多克隆抗體相比)有效地在合意的抗原以及交叉反應(yīng)的多肽間區(qū)別。影響抗體:抗體相互作用特異性的特征是抗體對抗原的親和力。盡管所希望的特異性可達到不同親和力的范圍，通常優(yōu)選的抗體具有約ιο_6、?ο-7,10_8、?ο-9或更少的親和力(解離常數(shù))。給定activin和ActRIIa之間的格外緊密的結(jié)合，我們預(yù)期中和性的抗activin抗體或抗ActRIIa抗體通常具有10,或更少的解離常數(shù)。
[0157]另外，用于篩選抗體以鑒定合意的抗體的技術(shù)可影響獲得的抗體的特性。例如，如果抗體用于在溶液中結(jié)合抗原，測試溶液結(jié)合可能是合適的。各種不同的技術(shù)可用于測試抗體與抗原之間的相互作用以鑒別特定期望的抗體。這樣的技術(shù)包括ELISAs、表面等離子體共振結(jié)合分析(例如，the Biacore? binding assay, Biacore AB, Uppsala,Sweden)、夾心法(例如，the paramagnetic bead system of IGEN International, Inc.,Gaithersburg, Maryland)、western免疫印跡、免疫沉淀反應(yīng)以及免疫組化。
[0158]Activin或ActRIIa拮抗劑的核酸化合物種類的例子包括反義核酸、RNAi構(gòu)建物以及催化核酸構(gòu)建物。核酸化合物可以是單鏈的或雙鏈的。雙鏈核酸化合物還可以包括懸臂或非互補的區(qū)域，其中一個或另外一個片段是單鏈。單鏈化合物可包括自身互補的區(qū)域，意味著化合物形成稱為“發(fā)夾” 或“莖環(huán)”結(jié)構(gòu)，具有一個雙鏈螺旋結(jié)構(gòu)的區(qū)域。核酸化合物可包括互補于包含全長ActRIIa核酸序列或activin β A或activin β B核酸序列的不超過1000、不超過500、不超過250、不超過100或不超過50、35、30、25、22、20或18個核苷酸的區(qū)域的核苷酸序列。優(yōu)選的互補區(qū)域至少是8個核苷酸，視情況地至少10個或至少15個核苷酸，并且視情況地在15到25個核苷酸之間?；パa區(qū)域可屬于內(nèi)含子、靶轉(zhuǎn)錄子的編碼序列或非編碼序列諸如編碼序列部分。通常地，核酸化合物具有8到約500個核苷酸或堿基對的長度，視情況長度可以是約14到約50個核苷酸。核酸可以是DNA(特定地作為反義核酸使用)、RNA或RNA =DNA雜合物。任何一條鏈可包括DNA和RNA的混合物，以及不容易被區(qū)分為DNA或RNA的修飾的形式。此外，雙鏈化合物可以是DNA:DNA,DNA =RNA或RNA:RNA,并且任何一條鏈可以包括DNA和RNA的混合物，以及不容易被區(qū)分為DNA或RNA的修飾的形式。核酸化合物可以包括任意的各種修飾，包括骨架(天然核酸的糖-磷酸部分，包括核苷間鍵合)或堿基部分(天然核酸的嘌呤或嘧啶部分)的一個或多個修飾。反義核酸化合物優(yōu)選具有約15到約30核苷酸長，并通常包含一個或多個修飾以改善諸如血清中的穩(wěn)定性、在細胞中或在化合物可能的給藥位置的特性，所述的給藥位置為諸如胃部(在口服給藥的情況下)以及肺臟(對于吸入化合物)。在RNAi構(gòu)建物的情況下，互補至靶轉(zhuǎn)錄子的鏈通常是RNA或其修飾。其它鏈可以是RNA、DNA或任何其它的變體。雙鏈或單鏈“發(fā)夾”RNAi構(gòu)建物的雙相部分優(yōu)選地為18到40個核苷酸長度，視情況為約21到23個核苷酸長度，只要其可作為Dicer底物起作用。催化的或酶促核酸可以是核酶或DNA酶，并還可包含修飾的形式。核酸化合物在生理條件下，以無義或有義控制基本不產(chǎn)生或不產(chǎn)生效果的濃度，與細胞相接觸，可抑制約50^^75^^90%或更多的靶的表達。優(yōu)選的檢測核酸化合物的效果的濃度是1、5以及10個微摩爾。核酸化合物可用于測試例如在骨骼生長以及骨礦化上的效果。
[0159]5.篩選方法
[0160]在某些方面，本發(fā)明涉及采用ActRIIa多肽(例如，可溶性ActRIIa多肽)以及activin多肽來鑒定能夠激動或拮抗activin-ActRIIa信號通路的化合物(藥物)。通過這種篩選鑒定藥劑可測試以評估它們在體內(nèi)調(diào)節(jié)骨骼生長和骨礦化的能力，視情況，這些化合物可以進一步地在動物中測試以評估它們在體內(nèi)調(diào)節(jié)組織生長的能力。
[0161]有非常多的用于篩選通過靶定activin和ActRIIa多肽以調(diào)節(jié)組織生長的治療劑的途徑。在某些實施方式中，化合物的高通量篩選可用于鑒別干擾activin或ActRIIa在骨骼上的調(diào)節(jié)效果的藥劑。在某些實施方式中，該方法用于篩選和鑒定特異性抑制或減少ActRIIa多肽結(jié)合至activin的化合物?；蛘?，該方法用于鑒定增強ActRIIa多肽結(jié)合至activin的化合物。在另一個實施方式中，化合物可通過其與activin或ActRIIa多肽相互作用的能力來鑒定。
[0162]各種方法的版本是足夠的并在本發(fā)明公開的范圍內(nèi)，然而那些本發(fā)明沒有清楚地描述的可被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員領(lǐng)會。如同本發(fā)明所描述的，本發(fā)明的檢測化合物(藥劑)可通過任何的組合化學方法制造?；蛘?，目標化合物可以是天然存在的在體內(nèi)或體外合成的生物分子。待測其作為組織生長調(diào)節(jié)劑能力的化合物(藥劑)可通過例如細菌、酵母、植物或其它生物體(例如，天然產(chǎn)品)生產(chǎn)，或化學生產(chǎn)(例如，小分子，包括擬肽)，或重組地生產(chǎn)。本發(fā)明所涵蓋的檢測化合物包括非肽有機分子、肽、多肽、擬肽、糖、激素和核酸分子。在特定的實施方式中，檢 測藥劑是分子量小于約2000道爾頓的小有機分子。
[0163]本發(fā)明的檢測化合物可以是單個的、離散的實體，或是具有更大復(fù)雜度的文庫，諸如以組合化學制備的庫。這些庫可包括，例如，乙醇、烷基鹵化物、胺、酰胺、酯、醛、醚以及其它類別的有機化合物。檢測化合物在檢測系統(tǒng)中的存在可以是單獨形式的或以化合物的混合物的形式，特別是在起始篩選步驟中。視情況，化合物可視情況與其它化合物衍生以及衍生群體有助于化合物分離。非限制性的衍生物群體的例子包括生物素、熒光素、地高辛、綠色熒光蛋白、同位素、多聚組氨酸、磁珠、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)、光學激活交聯(lián)劑(photoactivatible crosslinkers)或其任意的組合。
[0164]在許多檢測化合物庫以及天然提取物的藥物篩選程序中，高通量的方法是為了在給定時間內(nèi)最大化檢測化合物數(shù)量所需要的。這種在無細胞環(huán)境下的方法，諸如可到處純化或半純化蛋白的，通常優(yōu)選作為“主要的”篩選方法，其允許快速發(fā)展以及相對容易地檢測被檢測化合物調(diào)節(jié)的靶分子的改變。此外，檢測化合物的細胞毒性或生物利用度在體外系統(tǒng)中可以忽視，該方法轉(zhuǎn)而主要集中在藥物在靶分子上的效果，其可表現(xiàn)在ActRIIa多肽和activin的結(jié)合親和力的改變上。
[0165]僅僅是舉例說明，在本發(fā)明的示例性篩選方法中，感興趣的化合物與分離并純化的通?？山Y(jié)合至activin的ActRIIa多肽相接觸?；衔锱cActRIIa多肽的混合物中隨后加入包含ActRIIa配體的組合物。ActRIIa/activin復(fù)合物的檢測和定量提供了一種確定化合物抑制(或加強)ActRIIa多肽與activin之間的復(fù)合物形成效力的方法?；衔锏男Я赏ㄟ^采用測試化合物的各種濃度獲得的數(shù)據(jù)而生成的劑量反應(yīng)曲線而評估。此外，對照分析可用于提供比較的基準。例如，在對照分析中，分離并純化的activin加入至包含ActRIIa多肽的組合物中，在沒有測試化合物的情況下定量ActRIIa/activin復(fù)合物。應(yīng)當了解，通常的，反應(yīng)物混合的順序可以變化，并且可以同時混合。此外，代替純化蛋白的細胞提取物和溶解物可用于提供合適的無細胞分析系統(tǒng)。
[0166]ActRIIa多肽與activin的復(fù)合物的形成可以由各種技術(shù)檢測。例如，復(fù)合物形成的調(diào)節(jié)可采用例如可檢測標記的蛋白諸如放射性標記的(例如，32P、35S、14C或3H)、熒光素標記(例如FITC)的或酶標記的ActRIIa多肽或activin，通過免疫測定或?qū)游鰴z測來定量。
[0167]在某些實施方式中，本發(fā)明涵蓋了熒光偏振法以及熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)在直接或間接測量ActRIIa多肽與其結(jié)合蛋白的相互作用上的應(yīng)用。進一步的，其它的檢測模式，諸如基于光波導的(PCTPublication W096/26432以及美國專利5，677，196)、表面等離子體共振(SPR)、表面電荷傳感以及表面受力傳感，都與本發(fā)明的許多實施方式相一致。
[0168]此外，本發(fā)明涵蓋了相互作用陷阱方法(也被叫做“雙雜交方法”)的應(yīng)用，以鑒定破壞或加強ActRIIa多肽與其結(jié)合蛋白的相互作用的藥劑。參見例如，美國專利 5,283, 317 ；Zervos 等(1993)Cell72:223-232 ；Madura 等(1993)J Biol Chem268:12046-12054 ；Bartel 等(1993)Biotechniquesl4:920-924 ;以及 Iwabuchi 等(1993)0ncogene8:1693_1696。在特定的實施方式中，本發(fā)明涵蓋了應(yīng)用反向雙雜交系統(tǒng)以鑒定分離ActRIIa多肽與其結(jié)合蛋白的相互作用的化合物(例如，小分子或肽)。參見例如，Vidaland Legrain, (1999)Nucleic Acids Res27:919-29 ;Vidal 和 Legrain，(1999)TrendsBiotechnoll7:374-81 ;以及美國專利 5，525，490 ；5, 955，280 ;和 5，965，368。
[0169]在某些實施方式中，目標化合物通過其與本發(fā)明的ActRIIa或activin多肽相互作用的能力來鑒定?；衔锱cAct`RIIa或activin多肽之間的相互作用是共價的或非共價的。例如，這種相互作用可以采用體內(nèi)生物化學方法在蛋白水平上鑒定，
[0170]所述的生物化學方法包括光交聯(lián)、同位素標記的配體結(jié)合以及親和層析(JakobyWB et al., 1974,Methods in Enzymology46:1)。在某些例子中，化合物可通過某些機制為基礎(chǔ)的諸如檢測結(jié)合到activin或ActRIIa多肽的化合物的方法來篩選。這可包括固相或液相結(jié)合?；蛘撸幋aactivin或ActRIIa多肽的基因可與報告系統(tǒng)(例如，β半乳糖苷酶、熒光素酶或綠色熒光蛋白)一同轉(zhuǎn)染入細胞中并優(yōu)選地以高通量篩選來篩選文庫，或與文庫中的個體一同轉(zhuǎn)染。其它基于結(jié)合方法的機制可用于，例如，檢測自由能變化的結(jié)合分析。結(jié)合分析可與固定至孔、珠子或芯片或被固定化的抗體俘獲或被毛細管電泳所分解的靶一同進行。被限制住的化合物通?？刹捎帽壬ɑ驘晒饣虮砻娴入x子體共振來測量。
[0171]在某些方面，本發(fā)明提供了調(diào)節(jié)(刺激或抑制)骨骼形成以及增加骨骼質(zhì)量的方法和藥劑。因此，任何鑒定的化合物可在全細胞或組織中、在體外或體內(nèi)測試，以確定其調(diào)節(jié)骨骼生長或骨礦化的能力。各種本領(lǐng)域公知的方法可用于這個目的。
[0172]例如，ActRIIa或activin多肽或檢測化合物在骨骼或軟骨生長上的效果可通過在細胞基礎(chǔ)上測量Msx2的誘導或骨母細胞分化為成骨細胞來確定(參見例如，(Daluiski等，Nat Genet.2001,27(1):84-8 ;Hino 等，F(xiàn)ront Biosc1.2004，9:1520-9)。其它細胞基礎(chǔ)上分析的例子包括分析目標ActRIIa或activin多肽的成骨活性以及在間質(zhì)祖細胞以及成骨細胞中測試化合物。舉例說明,表達activin或ActRIIa多肽的重組腺病毒可構(gòu)建用于感染多能間質(zhì)祖細胞C3H10T1/2、成骨細胞前體C2C12以及成骨細胞TE-85。成骨活性隨后通過測量堿性磷酸酶、骨鈣素以及基質(zhì)礦化的誘導來確定(參見，例如，Cheng等，J boneJoint Surg Am.2003，85-A(8):1544-52)。
[0173]本發(fā)明還涵蓋了體內(nèi)檢測骨骼或軟骨生長的方法。例如，Namkung-Matthai等，Bone, 28:80-86(2001)公開了一種大鼠骨質(zhì)疏松模型，其研究了骨折后早期的骨骼修復(fù)。Kubo 等，Steroid Biochemistry&Mo lecular Biology, 68:197-202 (1999)也公開了一種大鼠骨質(zhì)疏松模型，其研究了骨折后晚期的骨骼修復(fù)。Andersson等，J.Endocrinol.170:529-537公開了小鼠的骨質(zhì)疏松模型，小鼠是去除卵巢的，其導致小鼠丟失實質(zhì)骨礦含量和骨礦密度，其中松質(zhì)骨丟失了大概50%的骨礦密度。去除卵巢的小鼠的骨骼密度可以通過施用一些諸如甲狀旁腺激素的因子來提高。在某些方面，本發(fā)明施用了本領(lǐng)域公知的骨折治愈方法。這些方法包括骨折技術(shù)、組織學分析和生物力學分析，其在例如美國專利6，521，750中有描述，以引用的形式整體地將其所公開的建立以及測量骨折的程度和修復(fù)進程的實驗方法并入本發(fā)明。
[0174]6.示范性治療應(yīng)用
[0175]在某些實施方式中，本發(fā)明的activin-ActRIIa拮抗劑(例如，ActRIIa多肽)可被用于治療或防治與骨骼損傷相關(guān)的疾病或狀況，所述的損傷無論是例如，通過斷裂、損失或脫礦物質(zhì)。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了通過給個體施用治療有效劑量的activin-ActRIIa拮抗劑(特別是ActRIIa多肽)來治療或預(yù)防有此需要的個體的骨骼損傷的方法。在某些實施方式中，本發(fā)明提供了通過給個體施用治療有效劑量的activin-ActRIIa拮抗劑(特別是ActRIIa多肽)來促進有此需要的個體的骨骼生長或礦化的方法。這些方法優(yōu)選地著眼于動物的治療以及預(yù)防性治療，更優(yōu)選地，著眼于人。在某些實施方式中，本發(fā)明提供`了 activin-ActRIIa拮抗劑(特別是可溶性的ActRIIa多肽以及靶向activin或ActRIIa的中和性抗體)在治療與低骨骼密度或降低的骨骼強度相關(guān)的疾病中的應(yīng)用。
[0176]如本發(fā)明所應(yīng)用的，“預(yù)防”疾病或狀況的治療劑指的是在一個統(tǒng)計學樣本中，相對于未治療樣本，可減少治療樣本的疾病或狀況發(fā)生的化合物，或者相對于未治療樣本，延遲發(fā)作或減輕疾病或狀況的一個或多個癥狀的嚴重程度的化合物。本發(fā)明所用的術(shù)語“治療”包括預(yù)防指定的狀況或一旦這種狀況確定時改善或消除這種狀況。在兩者之中任何一種情況下，預(yù)防或治療以及預(yù)期的治療劑施用結(jié)果由作診斷的醫(yī)師來考慮。
[0177]本發(fā)明提供了包括骨骼和/或軟骨形成、預(yù)防骨骼丟失、增加骨礦化或預(yù)防骨骼脫礦的方法。例如，目標activin-ActRIIa拮抗劑已應(yīng)用于治療骨質(zhì)疏松以及骨折的治愈和人或動物中的軟骨缺損。ActRIIa或activin多肽對診斷為亞臨床低骨骼密度的患者是有效的，其作為對抗骨質(zhì)疏松發(fā)展的保護性措施。
[0178]在一個特異的實施方式中，本發(fā)明的方法和組合物具有在人和其它動物的骨折愈合以及軟骨缺損中的醫(yī)療效用。目標方法和組合物在閉合的以及開放的骨折復(fù)位以及人工關(guān)節(jié)的改良固定中還具有預(yù)防性的應(yīng)用。成骨藥劑誘導的De novo骨骼形成有助于先天性的、外傷引起的或腫瘤切除引起的顱面畸形的修復(fù)，在醫(yī)療美容中也是有效的。在某些例子中，目標activin-ActRIIa拮抗劑可提供一種吸引骨骼形成細胞的環(huán)境，刺激骨骼形成細胞的生長或誘導骨骼形成前體細胞的分化。本發(fā)明的activin-ActRIIa拮抗劑在骨質(zhì)疏松的治療中也是有效的。
[0179]本發(fā)明的方法和組合物可被應(yīng)用于以骨骼損失為或?qū)е鹿趋罁p失為特征的狀況，諸如骨質(zhì)疏松(包括繼發(fā)性骨質(zhì)疏松)、甲狀旁腺功能亢進、庫欣病(Cushing' sdisease)、柏哲氏病(Paget’s disease)、甲狀腺功能允進、慢性痢疾或吸收不良、腎小管性酸中毒或神經(jīng)性厭食。
[0180]骨質(zhì)疏松可由各種因素引起或與之相關(guān)。對女性來說，特別是絕經(jīng)后的女性，體重低，以及致使的久坐行為都是骨質(zhì)疏松(丟失骨礦密度，致使骨折風險)的風險因素。具有任一下列特征的人可作為以ActRIIa拮抗治療的候選人:絕經(jīng)后的并且沒有攝食雌激素或其它的激素替代療法的女性；高(超過5英尺7英寸)或瘦(少于125磅)的絕經(jīng)后的女性；具有骨骼損失相關(guān)的臨床狀況的男性；應(yīng)用已知可導致骨骼損失的藥物的人，包括諸如強的松(Prednisone?)的糖皮質(zhì)激素、各種抗抽搐藥物諸如苯妥英鈉(Dilantin?)以及某些巴比妥鹽，或高劑量的甲狀腺替代藥物；具有I型糖尿病、肝臟疾病、腎臟疾病或具有骨質(zhì)疏松家族史的人；具有高骨轉(zhuǎn)換(例如，尿樣中膠原過多)的人；具有甲狀腺狀況諸如甲狀腺功能亢進的人；輕度外傷后骨折的人；具有脊椎骨折或骨質(zhì)疏松的其它現(xiàn)象的X射線證據(jù)的人。
[0181]如同上面所提到的，骨質(zhì)疏松也可以是與另一種疾病相關(guān)或與某種藥物的使用相關(guān)的狀況。藥物導致的或其它醫(yī)療狀況導致的骨質(zhì)疏松被稱為繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。在一種叫庫欣病(Cushing' s disease)的狀況中，身體所產(chǎn)生的過多的皮質(zhì)醇導致骨質(zhì)疏松和骨折。最通常的與繼發(fā)性骨質(zhì)疏松相關(guān)的藥物是糖皮質(zhì)激素，一類像皮質(zhì)醇一樣作用的藥物，一種天然的由腎上腺產(chǎn)生的激素。盡管甲狀腺激素(其由甲狀腺產(chǎn)生)的適當水平是骨骼發(fā)育所必須的，過量的甲狀腺激素可持續(xù)地降低骨量。當腎臟有問題的特別是透析的人攝入高劑量的包含 鋁的抗酸劑時可導致骨丟失。其它的可導致繼發(fā)性骨質(zhì)疏松的藥劑包括用于預(yù)防癲癇的 苯妥英(苯妥英鈉(Dilantin))和巴比妥鹽；甲氨喋呤(Rheumatrex, Immunex, Folex PFS),—種用于一些類型的關(guān)節(jié)炎、癌癥或免疫疾病的藥物；環(huán)孢毒素(Sandimmune, Neoral),—種用于治療一些自身免疫性疾病以及在器官移植的患者體內(nèi)抑制免疫系統(tǒng)的藥物；促黃體激素釋放激素激動劑(Lupron，Zoladex)，用于治療前列腺癌和子宮內(nèi)膜異位癥；肝磷脂(Calciparine, Liquaemin),抗凝血藥物；以及消膽胺(Questran)和colestipol (Colestid),用于治療高膽固醇。癌癥治療導致的骨丟失被廣泛地認識并被成為癌癥治療誘導的骨丟失(CTIBL)。骨轉(zhuǎn)移可在骨骼上造成空穴，其可通過以activin-ActRIIa拮抗劑治療和修正。
[0182]在一個優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明所公開的activin-ActRIIa拮抗劑,特別是可溶性的ActRIIa，可應(yīng)用與癌癥患者。具有某種腫瘤的患者(例如，前列腺的、乳腺的、多發(fā)性骨髓瘤或任何引起甲狀腺功能亢進的腫瘤)，由于腫瘤誘導的骨丟失以及骨轉(zhuǎn)移和治療劑的原因而具有骨丟失的高風險。甚至是在缺乏骨丟失或骨轉(zhuǎn)移的證據(jù)的情況下，這樣的患者可以以activin-ActRIIa拮抗劑治療。還可以監(jiān)測患者的骨丟失或骨轉(zhuǎn)移的證據(jù)，當指示器顯示風險上升時以activin-ActRIIa拮抗劑治療。通常地，采用DEXA(雙能X射線骨密度測量研究)掃描評估骨密度的改變，而骨骼重構(gòu)的指示器可用于評估骨轉(zhuǎn)移的可能性。可監(jiān)測血清標記。骨骼特異的堿性磷酸酶(BSAP)是一種在成骨細胞中存在的酶。骨轉(zhuǎn)移以及其它導致骨骼重構(gòu)增加的狀況的患者的BSAP血液水平是上升的。骨鈣素以及原骨膠原肽同樣與骨骼形成和骨轉(zhuǎn)移相關(guān)。在具有前列腺癌導致的骨轉(zhuǎn)移的患者中，檢測到BSAP的上升，并且不同程度的存在與乳腺癌導致的骨轉(zhuǎn)移中。高水平的骨骼形態(tài)發(fā)生蛋白7(BMP-7)存在于已骨轉(zhuǎn)移至骨骼的前列腺癌中，但是不存在于膀胱、皮膚、肝臟或肺臟癌癥引起的骨轉(zhuǎn)移中。I型羧基末端肽(ICTP)是一種在骨骼吸收期間形成的膠原中發(fā)現(xiàn)的交聯(lián)劑。由于骨骼持續(xù)地被破壞以及改造，ICTP在全身都能找到。然而，在骨轉(zhuǎn)移發(fā)生的位置，其水平將顯著的高于在正常骨骼的區(qū)域。ICTP的高水平發(fā)現(xiàn)于前列腺、肺臟以及乳腺癌引起的骨轉(zhuǎn)移中。另一種膠原交聯(lián)劑，I型氨基末端肽(NTx)，在骨轉(zhuǎn)換時與ICTP—同產(chǎn)生。在很多種不同癌癥包括肺臟、前列腺以及乳腺癌引起的骨轉(zhuǎn)移中，NTx的量是上升的。并且，NTx水平的上升伴隨著骨轉(zhuǎn)移的發(fā)展進程。因此，這個標記可用于檢測骨轉(zhuǎn)移以及衡量疾病的程度。其它的吸收標記包括吡啶醚和脫氧吡啶醚。吸收標記以及骨轉(zhuǎn)移標記的任何增長表明了患者需要activin-ActRIIa拮抗劑的治療。
[0183]Activin-ActRIIa拮抗劑可與其它藥物制劑聯(lián)合施用。聯(lián)合施用可通過單一的復(fù)合配方、通過同時施用或間隔時間施用來完成。Activin-ActRIIa拮抗劑如果與其它的骨骼激活劑一同施用，會有特別的優(yōu)點?；颊呖蓮腶ctivin-ActRIIa拮抗劑與攝取補?丐劑、維生素D、適宜的鍛煉和/或(某些情況下)其它的藥物聯(lián)合施用中受益。其它的藥物的例子包括，雙膦酸鹽(阿侖膦酸鈉、伊班膦酸鈉和利塞膦酸鈉)、降鈣素、雌激素、甲狀旁腺素以及雷洛昔芬。雙膦酸鹽(阿侖膦酸鈉、伊班膦酸鈉和利塞膦酸鈉)、降鈣素、雌激素、甲狀旁腺素以及雷洛昔芬影響骨骼重構(gòu)周期并被歸類為抗吸收藥物。骨骼重構(gòu)由兩個不同的階段:骨骼吸收和骨骼形成。抗吸收藥物減緩或停滯骨骼重構(gòu)周期的骨骼吸收部分但不減緩周期的骨骼形成部分。結(jié)果是，新的形成速率持續(xù)大于吸收速率，骨骼密度一直增加。甲狀旁腺素片段，甲狀旁腺激素的一種形式，其增加骨骼重構(gòu)循環(huán)中的骨骼形成速率。阿侖膦酸鈉已被認可用于絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松的預(yù)防(5毫克每天或每周一次35毫克)和治療(10毫克每天或每周一次70毫克)。阿侖膦酸鈉減少骨丟失，增加骨密度以及降低脊柱、腕和髖的骨折風險。阿侖膦酸鈉還 被認可用于治療男性和女性中的作為長期應(yīng)用這些藥物(即強的松和可的松)所導致的糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松以及用于男性中的骨質(zhì)疏松的治療。阿侖膦酸鈉加上維生素D被認可用于治療女性的絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松(每周一次70毫克，加上維生素D)，并用于治療以改善患有骨質(zhì)疏松的男性的骨量。伊班膦酸鈉被認可用于預(yù)防和治療絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松。每月服用一次(150毫克)，伊班膦酸鈉必須在每月的同一天服用。伊班膦酸鈉減少骨丟失，增加骨密度以及減少脊柱骨折的風險。利塞膦酸鈉被認可用于預(yù)防和治療絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松。每天服用(5毫克的劑量)或每周服用(35毫克劑量或35毫克劑量加上鈣)，利塞膦酸鈉減緩骨丟失，增加骨骼密度以及減少脊柱骨折和非脊柱骨折的風險。利塞膦酸鈉還被認可用于男性和女性以預(yù)防和/或治療長期施用這些藥物(即強的松和可的松)所導致的糖皮質(zhì)激素誘導的骨質(zhì)疏松。降鈣素是一種天然存在涉及鈣調(diào)節(jié)和骨骼新陳代謝的激素。在絕經(jīng)期5年以后的女性，降鈣素減緩骨丟失，增加脊柱骨密度并可能減輕骨折相關(guān)的疼痛。降鈣素減少脊柱骨折的風險。降鈣素可作為注射劑(50-100IU每天)或鼻噴入(200IU每天)使用。雌激素治療(ET)/荷爾蒙治療(HT)被認可用于預(yù)防骨質(zhì)疏松。ET如所顯示的那樣減少骨丟失，增加脊柱和髖的骨骼密度，并減少絕經(jīng)后的女性的髖和脊柱骨折的風險。ET施用最常見是以藥丸或皮膚貼劑的形式，其釋放約0.3毫克每天的低劑量或約0.625毫克每天的標準劑量，并且即使70歲之后才開始也仍然有效。當單獨攝入雌激素時，其可增加女性發(fā)展宮頸壁癌癥(子宮內(nèi)膜癌)的風險。為消除這種風險，醫(yī)療服務(wù)提供者開出的處方是孕酮荷爾蒙與雌激素組合用于那些具有完整子宮的女性。ET/HT減輕絕經(jīng)期癥狀并顯示對骨骼健康具有有益效果。副作用包括陰道流血、乳房觸痛、情緒擾動以及膽囊疾病。雷洛昔芬，60毫克每天，被認可用于預(yù)防和治療絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松。它來源于一系列的叫做選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(SERMs)的藥物，其被發(fā)展成為提供雌激素的有益效果而沒有潛在的缺陷。雷洛昔芬增加估量并且減少脊柱骨折的風險。仍未獲得數(shù)據(jù)以證明雷洛昔芬可以減少髖和非其它非脊柱骨折的風險。這種藥物刺激新骨骼的形成并且顯著地增加骨礦密度。在絕經(jīng)后的女性中，脊柱、髖、足、肋骨以及腕的骨折復(fù)位是顯著的。男性中，脊柱中的骨折復(fù)位是顯著的，但沒有足夠的數(shù)據(jù)來評估其它位置的骨折復(fù)位。甲狀旁腺素片段是自施用的，如同一天24小時注射一樣。
[0184]7.藥物組合物
[0185]在某些實施方式中，本發(fā)明的activin-ActRIIa拮抗劑(例如,ActRIIa多肽)與藥學上可接受的載體配方。例如，ActRIIa多肽可單獨施用或作為制劑配方(治療組合物)的成分。目標化合物可以任何適于應(yīng)用于人類或獸醫(yī)的途徑配方施用。
[0186]在某些實施方式中，本發(fā)明的治療方法包括全身性地施用組合物或作為種植體或設(shè)備局部施用。施用時，用于本發(fā)明的治療組合物理所當然是無熱原的、生理學上可接受的形式。除ActRIIa拮抗劑之外的治療有效藥劑可視情況地包括入上面所描述的組合物，在本發(fā)明的方法中其可與目標化合物(例如，ActRIIa多肽)同時或相繼地施用。
[0187]通常地，ActRIIa拮抗劑在腸胃外施用。適合胃腸外給藥的藥物組合物包括一個或多個ActRIIa多肽與一種或多種藥學上可接受的無菌等滲水溶液或非水溶劑、分散劑、懸液或乳劑、或可重組到前面所用的無菌可注射溶液或分散體的無菌粉末相組合，其可包含抗氧化劑、緩沖劑、抗菌劑、賦予配方與將來的受者的血液等張的溶質(zhì)或懸浮或增稠的藥物。合適的應(yīng)用于本發(fā)明的藥物組合物的水載體或非水載體的例子包括水、乙醇、多羥基化合物(諸如甘油、丙二醇、聚乙二醇，等等)及其合適的混合物，植物油(諸如橄欖油)，以及可注射的有機酯(諸如油酸乙酯)?？杀３诌m當?shù)牧鲃有?，例如，通過應(yīng)用包被物質(zhì)(諸如卵磷脂)，在分散體的情況下通過保持所要求的顆粒大小，以及通過應(yīng)用表面活性劑。
[0188]此外，組合物可被裝入膠囊或注射為釋放至靶組織位置(例如，骨骼)的形式。在某些實施方式中，本發(fā)明的組合物包括可以釋放一種或多種治療化合物(例如ActRIIa多肽)至靶組織位置(例如，骨骼)的基質(zhì)，為發(fā)育中的組織提供一種結(jié)構(gòu)并且，最理想地，能被吸收入體內(nèi)。 例如，基質(zhì)可提供ActRIIa多肽的緩慢釋放。這樣的基質(zhì)可由現(xiàn)有的用于其它植入醫(yī)藥應(yīng)用的物質(zhì)形成。
[0189]基質(zhì)物質(zhì)的選擇基于生物適應(yīng)度、生物降解能力、機械特性、外觀以及界面特性。目標組合物的特定應(yīng)用將確定適宜的配方。潛在的用于組合物的基質(zhì)是生物可降解的以及化學上清楚的硫酸鈣、磷酸三鈣、羥基磷灰石、聚乳酸以及聚酸酐。其它潛在的物質(zhì)是生物可降解的并且生物學上非常清楚的，諸如骨骼或真皮膠原。其它的基質(zhì)包括純蛋白或細胞外基質(zhì)成分。其它潛在的基質(zhì)是非生物可降解的以及化學上清楚的，諸如燒結(jié)的羥基磷灰石、生物玻璃、鋁酸鹽或其它陶瓷?；|(zhì)可由上面所提到的任何類型的物質(zhì)的組合(諸如聚乳酸和羥基磷灰石或膠原和磷酸三鈣)組成。生物陶瓷可在組合物中改變，諸如在鈣-鋁-磷酸中以及在改變孔徑、顆粒大小、顆粒形狀以及生物降解能力的處理中。
[0190]在某些實施方式中，本發(fā)明的方法可以是口服給藥，例如，以膠囊、cathets、藥丸、藥片、含片(采用調(diào)味基質(zhì)，通常是蔗糖和阿拉伯樹膠或黃芪膠)、粉末、顆粒或作為水或非水溶劑中的溶液或懸濁液、或作為油包水或作為水包油的液體乳劑、或作為酏劑或糖衆(zhòng)劑、或作為錠劑(采用惰性基質(zhì)，諸如凝膠和甘油，或蔗糖和阿拉伯樹膠)和/或漱口劑等等的形式，每種都包含預(yù)先確定量的作為活性成分的藥劑。藥劑也可作為丸劑、沖劑或糊劑的形式施用。
[0191]在口服給藥的固態(tài)劑量形式(膠囊、藥片、藥丸、糖衣丸、粉末、顆粒等等)中，本發(fā)明的一種或多種治療化合物可與一種或多種藥學上可接受的載體(諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣)混合，和/或任何的下面的物質(zhì):(I)填料或稀釋劑，諸如淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和/或硅酸；(2)粘合劑，諸如，例如，甲基纖維素、藻酸鹽、凝膠、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和/或阿拉伯樹膠；(3)保濕劑，諸如甘油；(4)崩解劑，諸如瓊脂-瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯淀粉或木薯淀粉、褐藻酸、某些硅酸鹽、以及碳酸鈉；(5)溶液緩釋劑，諸如石蠟；(6)吸收促進劑，諸如季胺化合物；(7)潤濕劑，諸如，例如，十六醇以及甘油單硬脂酸酯；(8)吸收劑，諸如高嶺土和膨潤土；(9)滑潤劑，諸如滑石、硬脂酸鈣、應(yīng)制酸鎂和固體聚乙二醇、硫酸十二烷基鈉及其混合物；(10)著色劑。在膠囊劑、藥片以及藥丸的情況下，藥物組合物可包含緩沖藥劑。相似類型的固態(tài)組合物也可用于使用諸如乳糖或奶糖以及高分子量聚乙二醇等等作為輔料的軟填充以及硬填充明膠膠囊的填料。
[0192]用于口服給藥的液態(tài)劑型包括藥學上可接受的乳液、微乳液、溶液、糖漿和酏劑。除活性成分外，液態(tài)劑型包含本領(lǐng)域常用的惰性稀釋劑(諸如水或其它溶劑)、助溶劑和乳化劑(諸如酒精、異丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯丙醇、苯甲酸芐酯、丙二醇、1，3_ 丁二醇、油(特別地，棉籽、落花生、玉米、胚芽、橄欖、蓖麻以及芝麻油)、甘油、四氫呋喃甲醇、聚乙二醇以及山梨聚糖的脂肪酸酯及`其混合物。除惰性稀釋劑外，口服組合物還包括諸如潤濕劑、乳化和懸浮劑、甜味劑、香料、著色劑、加香以及防腐劑的助劑。
[0193]懸浮劑，除了活性化合物外,包含諸如乙氧基異硬脂醇(ethoxylated isostearylalcohols)、聚氧乙烯山梨醇以及脫水山梨糖醇、微晶纖維素、偏氫氧化招(aluminummetahydroxide)、膨潤土、瓊脂-瓊脂和黃苗膠及其混合物的助懸劑。
[0194]本發(fā)明組合物還可包含助劑，諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑和分散劑。可通過包含各種抗菌藥和抗真菌藥(例如，帕拉膠、氯丁醇、苯酚等等)來確保微生物活動的防止。必要的時候組合物中還包括等滲劑，諸如糖、氯化鈉等等。此外，可注射藥物的延長吸收可通過延遲吸收的藥劑諸如單硬脂酸鋁和凝膠的夾雜而帶來。
[0195]當然，給藥方案經(jīng)過主治醫(yī)師考慮各種改變本發(fā)明的目標化合物(例如，ActRIIa多肽)作用的因素后作出。所述的各種因素包括但不限于，需要形成的骨骼重量，骨密度丟失的程度，骨損傷的位置，損傷骨骼的狀況，患者的年齡、性別和飲食，任何促進骨丟失的疾病的嚴重程度、施用時間以及其它臨床因素。視情況，劑量可根據(jù)重建中使用的基質(zhì)類型以及組合物中的化合物類型而變動。其它加到最終的組合物當中的已知的生長因子也可影響劑量。進程可通過骨骼生長和/或修復(fù)的定期評估(例如，X射線(包括DEXA)、組織形態(tài)測定以及四環(huán)素標記)來監(jiān)測。
[0196]小鼠實驗證明了當化合物每次間隔給藥而且劑量足夠達到0.2微克/千克或更高的血藥濃度時，ActRIIa-Fc在骨骼上的效果是可檢測的，，并且血清藥物水平為I微克/千克或2微克/千克或更高是獲得骨骼密度和強度的顯著效果所必須的。盡管沒有更高劑量的ActRIIa-Fc由于會導致副作用而不合需要的跡象，治療方案被設(shè)計為達到0.2與15微克/千克之間的血藥濃度，視情況為I到5微克/千克之間。在人類中，0.2微克/千克的血清藥物水平可通過0.1毫克/千克或更高的單次劑量達到，I微克/千克的血清藥物水平可通過0.3毫克/千克或更高的單次劑量達到。觀察到的分子的血清半衰期在約20天到30天之間，大體上長于大多數(shù)的Fe融合蛋白，并因此獲得持久有效的血清藥物水平，例如，通過每周或雙周基礎(chǔ)上的0.2-0.4毫克/千克的劑量，或更高的劑量與劑量間更長的時間間隔。例如，1-3毫克/千克的劑量可用于每月或雙月基礎(chǔ)上，并且骨骼上的效果足夠持久，這樣的劑量對于僅僅是每3、4、5、6、9、12或更多個月一次所必須的。
[0197]在某些實施方式中，本發(fā)明還提供了體內(nèi)產(chǎn)生ActRIIa多肽的基因療法。這樣的療法可通過在患有上面所列的疾病的細胞或組織中引入ActRIIa多核苷酸序列而達到其治療效果。ActRIIa多核苷酸序列的遞送可通過使用重組表達載體諸如嵌合病毒或膠態(tài)分散體系來完成。優(yōu)選用于ActRIIa多核苷酸序列治療性遞送的是靶向脂質(zhì)體的使用。
[0198]本發(fā)明所教導的各種可用于利用來基因治療的病毒載體包括腺病毒、皰疹病毒、牛痘，或優(yōu)選地，RNA病毒諸如逆轉(zhuǎn)錄病毒。優(yōu)選地，逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是小鼠或鳥類逆轉(zhuǎn)錄病毒的衍生物。可插入單個外源基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒的例子包括但不限于:莫洛尼小鼠白血病病毒(MoMuLV)、哈維鼠肉瘤病毒(HaMuSV)、鼠乳腺腫瘤病毒(MuMTV)以及勞斯肉瘤病毒(RSV)。大量其它的逆轉(zhuǎn)錄病毒可合并多個基因。所有這些載體可轉(zhuǎn)移或合并基因以選擇性標記使得轉(zhuǎn)導的細胞可被鑒定和生成。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體可通過粘附例如糖、糖脂或蛋白質(zhì)而制成靶特異性的。優(yōu)選靶 向通過采用抗體達到。本領(lǐng)域技術(shù)人員可意識到特異的多核苷酸序列可插入到逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組或粘附到病毒包膜蛋白以允許包含ActRIIa多核苷酸的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體靶特異性地遞送。在一個優(yōu)選的實施方式中，載體靶向骨骼或軟骨。
[0199]或者，組織結(jié)構(gòu)細胞可通過常規(guī)的鈣磷酸鹽轉(zhuǎn)染直接以編碼逆轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)基因gag、pol和env的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。然后這些細胞以包含感興趣的基因的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。得到的細胞釋放逆轉(zhuǎn)錄病毒載體至培養(yǎng)基中。
[0200]另一個ActRIIa多核苷酸祀向釋放系統(tǒng)是膠體分散系統(tǒng)。膠體分散系統(tǒng)包括大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球體、珠子以及脂質(zhì)體系統(tǒng)包括油包水乳劑、膠束、混合膠束以及脂質(zhì)體。本發(fā)明優(yōu)選的膠體分散系統(tǒng)是脂質(zhì)體。脂質(zhì)體是人工膜囊泡，其可有效地作為體外或體內(nèi)的分散載體。RNA、DNA以及完整的病毒顆粒可與內(nèi)部水溶液一同封裝，并以生物活性形式分散質(zhì)細胞(參見，例如，F(xiàn)raley,等，Trends Biochem.Sc1., 6:77,1981)。采用脂質(zhì)體載體高效轉(zhuǎn)染基因的方法是本領(lǐng)域公知的，參見例如，Mannino,等，Biotechniques, 6:682，1988。脂質(zhì)體組合物通常是磷脂的組合，通常與類固醇特別是膽固醇組合。也可以使用其它的磷酸酯或其它的脂質(zhì)。脂質(zhì)體的物理特性依賴于pH、離子強度以及二價陽離子的存在。
[0201]可用于生產(chǎn)脂質(zhì)體的脂質(zhì)的例子包括磷脂?；衔?，諸如磷脂酰甘油、卵磷脂、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂、腦苷脂和神經(jīng)節(jié)苷脂。示例性的磷脂的例子包括蛋黃卵磷脂、二棕櫚酰磷脂酰膽堿和二硬脂酰磷脂酯膽堿。脂質(zhì)體的靶向也可能基于，例如，器官特異性、細胞特異性以及細胞器特異性以及本領(lǐng)域已知的其它。
【具體實施方式】
[0202]實施例
[0203]本發(fā)明在這里是一般性的描述，通過參照下述實施例將更容易理解，所包括的實施例僅僅用于解釋某些實施方式以及本發(fā)明的某些實施方式，并不打算用于限制本發(fā)明。
[0204]實施例1 =ActRIIa-Fc融合蛋白
[0205] 申請人:構(gòu)建了具有融合至人或小鼠Fe結(jié)構(gòu)域的人ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域的可溶性ActRIIa融合蛋白，兩者間有最小限度的連接子。構(gòu)建物分別指的是ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc。
[0206]純化自CHO 細胞系的 ActRIIa-hFc (SEQ ID NO:7)如下:
[0207]ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSI
[0208]EIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEV
[0209]TOPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEV
[0210]TCVVVDVSHEDPEVKFNffYVDGVEVHNAKTKPREEOYNSTYRVVSVLTVL
[0211]HODffLNGKEYKCKVSNKALPVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTK
[0212]NOVSLTCLVKG`FYPSDIAVEffESNGOPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTV DKSRffOOGNYFSCSYMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
[0213]ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc蛋白表達在CHO細胞系中?？紤]了三種不同的前導序列:
[0214](i)蜜蜂蜂毒肽(HBML):MKFLVNVALVFMVVYISYIYA (SEQ ID NO:8)
[0215](ii)組織型纖溶酶原激活物(TPA):MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSP(SEQ ID NO:9)
[0216](iii)天然的:MGAAAKL AFAVFLISCS SGA(SEQ ID NO:10)
[0217]所選擇的形式采用TPA前導并具有以下未被加工的氨基酸序列:
[0218]MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSPGAAILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQT
[0219]GVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSIEIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKD
[0220]SPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMEVTQPTSNPVTPKPPTGGGTHTCPPCPA[0221 ]PELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVE
[0222]VHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPVPIE
[0223]KTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEffESNG
[0224]QPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNH YTQKSLSLSPGK(SEQ IDNO:13)
[0225]該肽由下面的核苷酸序列所編碼:
[0226]ATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAG
[0227]CAGTCTTCGTTTCGCCCGGCGCCGCTATACTTGGTAGATCAGAAACTCAG
[0228]GAGTGTCTTTTTTTAATGCTAATTGGGAAAAAGACAGAACCAATCAAAC
[0229]TGGTGTTGAACCGTGTTATGGTGACAAAGATAAACGGCGGCATTGTTTTG
[0230]CTACCTGGAAGAATATTTCTGGTTCCATTGAATAGTGAAACAAGGTTGTT[0231 ] GGCTGGATGATATCAACTGCTATGACAGGACTGATTGTGTAGAAAAAAA
[0232]AGACAGCCCTGAAGTATATTTCTGTTGCTGTGAGGGCAATATGTGTAATG
[0233]AAAAGTTTTCTTATTTTCCGGAGATGGAAGTCACACAGCCCACTTCAAAT
[0234]CCAGTTACACCTAAGCCACCCACCGGTGGTGGAACTCACACATGCCCAC
[0235]CGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCC
[0236]CCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACAT
[0237]GCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTG
[0238]GTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGA
[0239]GGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTG
[0240]CACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACA[0241 ] AAGCCCTCCCAGTCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCA
[0242]GCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGAGGAGATG
[0243]ACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCA
[0244]GCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACT
[0245]ACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTAT [0246]AGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCT
[0247]CATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAG CCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGAATTC(SEQ ID NO:14)
[0248]ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc都顯著性地順應(yīng)重組表達。如圖1所示，蛋白質(zhì)純化為單一的良好的蛋白峰形。N末端測序揭示了 ILGRSETQE(SEQ ID NO:11)的單一序列。純化可通過一系列的柱層析步驟達到，包括，例如，三個或多個以下的步驟，以任意的順序:A蛋白層析、Q瓊脂糖層析、苯基瓊脂糖層析、尺寸阻排層析以及陽離子交換層析。純化可通過病毒過濾以及緩沖交換而完成。ActRIIa-hFc蛋白純化至以尺寸阻排層析確定大于98%而以SDS PAGE確定大于95%的純度。
[0249]ActRIIa-hFc 和 ActRIIanFc 顯不了與配體特別是 activinA 的高親和性。GDF-1l或ActivinA(“ACA”)采用標準的氨基酸耦聯(lián)程序固定在Biacore CM5芯片上。ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc蛋白加載至系統(tǒng)，并測量其結(jié)合。ActRIIa-hFc以5 X 10_12的解離常數(shù)(Kd)結(jié)合至activin,而蛋白質(zhì)以9.96X 10-9的Kd結(jié)合至⑶FlI。參見圖2。ActRIIa-mFc的情況類似。
[0250]A-204報告基因分析通過⑶F-1l和ActivinA來評估ActRIIa-hFc蛋白在信號傳遞上的效果。細胞系:人橫紋肌肉瘤(來源于肌肉)。報告載體:pGL3 (CAGA) 12 (Describedin Dennler 等，1998，EMB017:3091-3100.)參見圖 3。CAGA12 基序存在于 TGF-beta 反應(yīng)性基因(PA1-1基因)，因此這個載體通常用于通過Smad2和3的信號因子。
[0251]第一天:分離A-204細胞入48孔板。
[0252]第二天:A-204 細胞與 IOyg pGL3(CAGA)12 或pGL3 (CAGA) 12 (10 μ g)+pRLCMV (I μ g)和 Fugene 一同轉(zhuǎn)染。
[0253]第三天:加入因子(稀釋入0.1 % BSA基質(zhì))。抑制劑需要在加至細胞前與因子預(yù)孵育I小時。6小時候，細胞以PBS洗滌，并溶解細胞。
[0254]隨后是熒光素酶分析。通常在該方法中，沒有任何的抑制劑的存在，ActivinA顯示出刺激約10倍的報告基因表達并且ED50~2納克/毫升。⑶F-1l:16倍刺激，ED50:~
1.5納克/毫升。⑶F-8顯示類似⑶F-1I的效果。
[0255]如圖4中顯示的，ActRIIa-hFc和ActRIIa-mFc在皮摩爾濃度下抑制GDF-8調(diào)節(jié)的信號。如圖5所示，三種不同的ActRIIa-hFc制劑與接近200pM的IC50—起抑制⑶F-1l信號。
[0256]ActRIIa-hFc在藥代動力學分析中非常穩(wěn)定。大鼠給藥lmg/kg、3mg/kg或10mg/kg的ActRIIa-hFc多肽，并且蛋白的血漿藥物水平在24、48、72、144以及168小時測量。在一個單獨的研究中，大鼠的給藥劑量是lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg。在大鼠中,ActRIIa-hFc具有11-14天的血清半衰期并且藥物的循環(huán)水平在2周后非常高(llyg/ml、110yg/ml或304 μ g/ml,分別對于lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg的起始劑量)。在食蟹猴中，血衆(zhòng)半衰期基本上大于14天并且藥物的循環(huán)水平是25 μ g/ml >304 μ g/ml或1440 μ g/ml (分別對應(yīng)于lmg/kg、10mg/kg或30mg/kg的起始濃度)。人類中的初步結(jié)果顯示，血清藥物藥物半衰期在約20至30天之間。
[0257]實施例2 =ActRIIa-hFc在體內(nèi)促進骨骼生長
[0258]正常的雌性小鼠(BALB/c)給予lmg/kg/劑、3mg/kg/劑或10mg/kg/劑水平的ActRIIa-mFc，每周給藥2次，骨礦密度和骨礦含量通過DEXA確定，參見圖6。
[0259]在雌性BALB/c中，DEXA掃描顯示作為ActRIIa-mFc的治療結(jié)果，骨礦密度和含量的顯著增加(> 20% )。參見圖7和8。
[0260]因此，ActRIIa的拮抗劑引起正常雌性小鼠的骨密度和含量的增加。作為后續(xù)步驟，檢測了 ActRIIa-mFc在去`除卵巢的小鼠模型上的效果。
[0261]Andersson等(2001)，確定去除卵巢的小鼠經(jīng)受相當?shù)墓莵G失(在術(shù)后6周大概丟失了 50 %的松質(zhì)骨)，并且這些小鼠中的骨丟失可通過候選治療劑諸如甲狀旁腺激素治療。
[0262] 申請人:采用4-5周齡的去除卵巢的(OVX)雌性C57BL6小鼠或假手術(shù)雌性小鼠。術(shù)后8周，開始用ActRIIa-mFc (10mg/kg，每周兩次)或?qū)φ?PBS)來治療。通過CT掃描來衡
量骨密度。
[0263]如圖9顯示的，在6周后，相對于假手術(shù)的小鼠，未治療的、去除卵巢的小鼠顯示相當?shù)乃少|(zhì)骨密度損失。ActRIIa-mFc處理組保留了假手術(shù)組水平的骨密度。在6周和12周的治療時，ActRIIa-mFc引起OVX小鼠松質(zhì)骨相當?shù)脑鲩L。參見圖10。在6周的治療后，相對于PBS對照組，骨密度增加了 24%。在12周后，增加為27%。
[0264]在假手術(shù)小鼠中，ActRIIa-mFc也引起了松質(zhì)骨的相當?shù)脑黾?。參見圖11。在6周和12周后，相對于對照，治療產(chǎn)生了 35%的增長。
[0265]在另外一組實驗中，如上所述的去除卵巢(OVX)小鼠或假手術(shù)小鼠以ActRIIa-mFc (10mg/kg，每周兩次)或?qū)φ?PBS)處理12周以上。類似于上面描述的ActRIIa-mFc的結(jié)果，接受ActRIIa-mFc的OVX小鼠展示松質(zhì)骨密度早在處理4周的時候增加了 15%，而在12周的處理后增加了 15% (圖12)。接受ActRIIa-mFc的的假手術(shù)小鼠同樣顯示松質(zhì)骨密度早在處理4周的時候增加了 25%，而在12周的處理后增加了 32% (圖13)。
[0266]在以ActRIIa-mFc處理12周后，全身以及間接體內(nèi)股骨DEXA分析顯示，處理在去除卵巢小鼠以及假手術(shù)小鼠(圖14A和圖14B，分別地)中均誘導了骨骼密度的增長。這些結(jié)果也被股骨中段的間接體內(nèi)PQCT分析所支持，其證明了在以ActRIIa-mFc處理12周后，總骨骼密度以及皮質(zhì)骨密度均顯著上升。載體處理的對照去除卵巢小鼠展示的骨骼密度與載體處理的對照假手術(shù)小鼠相比較(圖15)。除骨骼密度之外，骨量也隨ActRIIa-mFc處理而增加。股骨中段的間接體內(nèi)PQCT分析證明在以ActRIIa-mFc處理12周后總骨量以及皮質(zhì)骨量均顯著上升，而去除卵巢的小鼠以及假手術(shù)的載體對照處理的小鼠均展示了可比較的骨量(圖16)。股骨中段的間接體內(nèi)pQCT分析還顯示，ActRIIa-mFc處理的小鼠沒有顯示骨膜周長的變化，而ActRIIa-mFc處理導致骨內(nèi)膜周長的減小表明皮質(zhì)厚度的增加是由股骨內(nèi)表面的生長引起的(圖17)。股骨的力學測試確定ActRIIa-mFc可以增加骨骼的外在特性(最大載荷、剛度以及斷裂能)，其有助于骨骼內(nèi)在特性(極限強度)的顯著增加。以ActRIIa-mFc處理的去除卵巢的小鼠展示了高于假手術(shù)的、載體處理的對照水平的增加的骨骼強度，表明骨質(zhì)疏松表現(xiàn)型的完全逆轉(zhuǎn)(圖18)。[0267]這些數(shù)據(jù)證明activin-ActRIIa拮抗劑可在雌性小鼠中增加骨密度，并且，此外，在骨質(zhì)疏松的小鼠模型中更正骨密度、骨含量以及最大骨骼強度的缺陷。
[0268]在另一組實驗中，小鼠在第4周去除卵巢或假手術(shù)，在第12周開始的時候接受安慰劑或ActRIIa-mFc (2次每周，10mg/kg)(如圖19-24中的RAP-11)，再進行12周。評估各種骨骼參數(shù)。如圖19所示，ActRIIa-mFc增加OVX和假手術(shù)組的脊椎松質(zhì)骨容積與總?cè)莘e的比例(BV/TV)。ActRIIa-mFc也改善松質(zhì)骨的結(jié)構(gòu)(圖20)，增加骨膜厚度(圖21)以及改善骨骼強度(圖22)。如圖23所示，ActRIIa-mFc在從lmg/kg到10mg/kg的劑量范圍內(nèi)產(chǎn)生令人滿意的效果。
[0269]骨骼的組織形態(tài)測量在假手術(shù)小鼠的2周時間點進行。在圖24中呈現(xiàn)的這些數(shù)據(jù)，證明ActRIIa-mFc具有雙重效果，抑制骨骼吸收以及促進骨骼生長。因此，ActRIIa-mFc促進骨骼生長(合成代謝效果)以及抑制骨骼吸收(抗分解代謝效果)。
[0270]實施例4:替代的ActRIIa-Fc蛋白
[0271]一種替代的構(gòu)建物可刪除ActRIIa胞外結(jié)構(gòu)域C末端尾(最后的)的15個氨基酸。這樣的構(gòu)建物的序列如下:(Fe部分以下劃線標出)(SEQ ID NO:12):
[0272]ILGRSETQECLFFNANWEKDRTNQTGVEPCYGDKDKRRHCFATWKNISGSI
[0273]EIVKQGCWLDDINCYDRTDCVEKKDSPEVYFCCCEGNMCNEKFSYFPEMTG
[0274]GGTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV
[0275]KFNffYYDGYEYHNAKTKPREEOYNSTYRYYSYLTYLHODffLNGKEYKCK
[0276]VSNKALPVPIEKTISKAKGOPREPOVYTLPPSREEMTKNOVSLTCLVKGFYPS
[0277]DIAVEffE S NG OPE NN YKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKS RffOOGNVFSCSVMHEALHNHYTOKSLSLSPGK
[0278]參考文獻的整合
[0279]本發(fā)明所提到的所有出版物和專利整體地以參考文獻的形式并入本發(fā)明，如同每個出版物或?qū)＠貏e地且單獨地指示以參考文獻并入。
[0280]盡管已對目標事物的特定實施例進行了討論，上面的說明書是示例性而且是非限制性的。通過閱讀上面的說明書和后面的權(quán)利要求，諸多變動對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的。本發(fā)明全部的保護范圍應(yīng)當參照權(quán)利要求與其相當?shù)谋Ｗo范圍以及說明書與這樣的變動來確定。
【權(quán)利要求】
1.activin或ActRIIa拮抗劑多肽在制備用于促進骨骼生長、增加骨骼密度、抑制骨骼吸收、或增加骨骼強度的藥物中的用途。
2.權(quán)利要求1的用途,其中所述activin或ActRIIa拮抗劑是activin或ActRIIa拮抗劑多肽。
3.權(quán)利要求2的用途，其中所述的多肽包含與SEQID NO:3具有至少90%同一性的氨基酸序列。
4.權(quán)利要求3的用途，其中所述的多肽包含與SEQID NO:3具有至少95%同一性的氨基酸序列。
5.權(quán)利要求4的用途，其中所述的多肽包含SEQID NO:3的氨基酸序列。
6.權(quán)利要求2至5中任一項的用途，其中所述的多肽包含與SEQID NO:2具有至少90%同一性的氨基酸序列。
7.權(quán)利要求6的用途，其中所述的多肽包含與SEQID NO:2具有至少95%同一性的氨基酸序列。
8.權(quán)利要求7的用途，其中所述的多肽包含SEQID NO:2的氨基酸序列。
9.權(quán)利要求2至8中任一項的用途，其中所述的多肽包含與SEQID NO:7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
10.權(quán)利要求9的用途 ，其中所述的多肽包含與SEQID NO:7具有至少95%同一性的氨基酸序列。
11.權(quán)利要求10的用途，其中所述的多肽包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
12.權(quán)利要求2至11中任一項的用途，其中所述的多肽具有一個或多個下述的特性: i)以至少KT7M的Kd結(jié)合至ActRIIa配體；并且 ?)在細胞中抑制ActRIIa信號。
13.權(quán)利要求2-8或12中任一項的用途，其中所述的多肽是融合蛋白，包括，除ActRIIa多肽的結(jié)構(gòu)域外的一個或多個多肽部分，所述的多肽部分增強體內(nèi)穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期、攝取/施用、組織定位或分配、蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成和/或純化中的一個或多個。
14.權(quán)利要求13的用途，其中所述的融合蛋白包括選自下組的多肽部分:免疫球蛋白Fe結(jié)構(gòu)域和血清白蛋白。
15.權(quán)利要求2-14中任一項的方法，其中所述的多肽包括一個或多個選自下面組的修飾的氨基酸殘基:糖基化的氨基酸、聚乙二醇化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙?；陌被?、生物素化的氨基酸、耦聯(lián)至脂質(zhì)部分的氨基酸以及耦聯(lián)至有機衍生物的氨基酸。
16.activin或ActRIIa拮抗劑多肽在制備用于治療或預(yù)防骨骼相關(guān)疾病的藥物中的用途。
17.權(quán)利要求16的用途,其中所述的activin或ActRIIa拮抗劑是activin或ActRIIa拮抗劑多肽。
18.權(quán)利要求17的用途，其中所述的多肽包含與SEQID NO:3具有至少90%同一性的氨基酸序列。
19.權(quán)利要求18的用途，其中所述的多肽包含與SEQID NO:3具有至少95%同一性的氨基酸序列。
20.權(quán)利要求19的用途，其中所述的多肽包含SEQID NO:3的氨基酸序列。
21.權(quán)利要求18至20中任一項的用途，其中所述的多肽包含與SEQID NO:2具有至少90%同一性的氨基酸序列。
22.權(quán)利要求21的用途，其中所述的多肽包含與SEQID NO:2具有至少95%同一性的氨基酸序列。
23.權(quán)利要求22的用途，其中所述的多肽包含SEQID NO:2的氨基酸序列。
24.權(quán)利要求18至23中任一項的用途，其中所述的多肽包含與SEQID NO:7具有至少90%同一性的氨基酸序列。
25.權(quán)利要求24的用途，其中所述的多肽包含與SEQID NO:7具有至少95%同一性的氨基酸序列。
26.權(quán)利要求25的用途，其中所述的多肽包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
27.權(quán)利要求18至26中任一項的用途，其中所述的多肽具有一個或多個以下的特性: i)以至少KT7M的Kd結(jié)合至ActRIIa配體；并且 ?)在細胞中抑制ActRIIa信號。
28.權(quán)利要求18-23和27中任一項的用途，其中所述的多肽是融和蛋白，包括，除ActRIIa多肽的結(jié)構(gòu)域外的一個或多個多肽部分，所述的多肽部分增強體內(nèi)穩(wěn)定性、體內(nèi)半衰期、攝取/施用、組織定位或分配、蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成和/或純化中的一個或多個。
29.權(quán)利要求28的用途，其 中所述的融合蛋白包括選自下組的多肽部分:免疫球蛋白Fe結(jié)構(gòu)域和血清白蛋白。
30.權(quán)利要求18-29中任一項的用途，其中所述的多肽包括一個或多個選自下面組的修飾的氨基酸殘基:糖基化的氨基酸、PEG化的氨基酸、法尼基化的氨基酸、乙酰化的氨基酸、生物素化的氨基酸、耦聯(lián)至脂質(zhì)部分的氨基酸以及耦聯(lián)至有機衍生物的氨基酸。
31.權(quán)利要求17-30中任一項的用途，其中所述的骨骼相關(guān)的疾病選自下面的組:原發(fā)性骨質(zhì)疏松和繼發(fā)性骨質(zhì)疏松。
32.權(quán)利要求17-30中任一項的用途，其中所述的骨骼相關(guān)的疾病選自下面的組:絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松、性腺功能低下的骨丟失、腫瘤引發(fā)的骨丟失、癌癥治療引發(fā)的骨丟失、骨轉(zhuǎn)移瘤、多發(fā)性骨髓瘤以及柏哲氏病。
33.權(quán)利要求1-32中任一項的用途，其中所述的方法還包括施用第二種骨骼活化劑。
34.權(quán)利要求33的用途，其中所述的骨骼活化劑選自下面的組:雙膦酸酯、雌激素、選擇性的雌激素受體調(diào)節(jié)劑、甲狀旁腺激素、降血鈣素、補鈣劑和維生素D補充劑。
35.權(quán)利要求17至34中任一項的用途，其中所述的對象具有與骨轉(zhuǎn)移瘤相關(guān)的癌癥。
36.權(quán)利要求17-35中任一項的用途，其中所述的對象對骨密度丟失、骨骼吸收或骨轉(zhuǎn)移瘤的指示劑是陽性的。
37.權(quán)利要求17-36中任一項的用途，其中所述的對象是與骨丟失相關(guān)的癌癥治療方案的受者。
38.權(quán)利要求17-37中任一項的用途，其中所述的對象具有與骨丟失相關(guān)的癌癥。
39.權(quán)利要求1-38中任一項的用途，其中所述的方法導致患者骨骼肌質(zhì)量小于10%的增長。
40.權(quán)利要求1-39中任一項的用途,其中所述的activin或ActRIIa拮抗劑施用使得患者體內(nèi)的血藥濃度至少達到0.2 μ g/kg。
41.權(quán)利要求1-40中任一項的用途,其中所述的activin或ActRIIa拮抗劑具有15到30天之間的血清半衰期。
42.權(quán)利要求1-41中任一項的用途,其中所述的activin或ActRIIa拮抗劑施用給患者不超過每周一次。
43.權(quán)利要求1-41中任一項的用途,其中所述的activin或ActRIIa拮抗劑施用給患者不超過每月一次。`
【文檔編號】A61P19/08GK103479994SQ201310316553
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2006年11月22日 優(yōu)先權(quán)日:2005年11月23日
【發(fā)明者】J.克諾普夫, J.西拉 申請人:阿塞勒隆制藥公司