共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒及其在腫瘤診治方面的應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及納米藥物載體領(lǐng)域，具體的說涉及一種共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒及其在腫瘤診治方面的應用，采用球狀磁性鐵氧體納米粒子、正硅酸乙酯，通過溶膠凝膠法制備出非對稱磁介孔二氧化硅棒，并對該非對稱磁介孔二氧化硅棒上進行表面功能化修飾，依次裝載化療藥物、包覆陽性高分子聚合物、擔載基因藥物得到目標產(chǎn)品；通過介孔表面功能化連接化療藥物，并賦予其pH響應釋藥的特點，同時增加復合材料的生物相容性和延長體內(nèi)循環(huán)時間，并以靜電吸附形式擔載基因，并將此復合材料靜脈注射到活體，運用其納米粒子的體內(nèi)被動靶向、基因?qū)蚝蚿H響應釋藥，抗多藥耐藥基因和化療藥物協(xié)同性，體外磁靶向，核磁成像等多種技術(shù)用于惡性腫瘤的診斷和治療。
【專利說明】共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒及其在腫瘤診治方面的應用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及納米藥物載體領(lǐng)域，具體的說涉及一種共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒及其在腫瘤診治方面的應用，該非對稱磁介孔二氧化硅棒具備高磁性能和高載藥量，能夠?qū)⒒熕幬锱c腫瘤多藥耐藥基因共載于一種輸送體，并有序可控釋放藥物，集磁熱、核磁成像等診治功能為一體。

【背景技術(shù)】
[0002]目前惡性腫瘤已經(jīng)成為嚴重威脅人類健康的首要疾病。腫瘤化療作為主要的三大治療手段之一，由于靶向性差和多藥耐藥逐漸限制了其臨床應用。傳統(tǒng)的化療靶向性差和毒副作用大，且治療后腫瘤的多藥耐藥成為了患者死亡的主要原因。靶向性差是由于小分子化療藥物進入體循環(huán)后分布于全身，不能靶向富集于腫瘤部位，從而導致機體正常細胞或組織受損，產(chǎn)生毒性或不良反應。因此，提高抗腫瘤藥物的靶向性、降低其對正常組織、器官的毒性，逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥，開發(fā)多模式的腫瘤診治策略具有重大的理論和現(xiàn)實意義，并將產(chǎn)生巨大的社會和經(jīng)濟效益。
[0003]磁性納米藥物輸送體是近幾年發(fā)展起來的一種復合型靶向藥物傳輸系統(tǒng)，由可作為核磁成像造影劑的磁性納米粒子和作為藥物載體的介孔二氧化硅組成，因其獨特的性質(zhì)已成功的用于腫瘤診斷和治療。磁介孔二氧化硅棒(Fe3O4-MSN)，具備生物相容性好、細胞內(nèi)吞率高、腫瘤細胞內(nèi)PH響應性釋藥、增強核磁成像效果、毒性低等特點，因此，通過調(diào)控磁靶向納米藥物輸送體粒徑和外加磁場可達到被動靶向和磁靶向腫瘤細胞作用，另外，鐵和二氧化硅材料生物相容性好，是化療藥物、基因藥物(DNA，RNA, miRNA, dsRNA)、蛋白質(zhì)、生物素、染料和量子點等優(yōu)良的載體，因此，磁介孔二氧化硅棒是理想的藥物載體。
[0004]盡管近年來傳統(tǒng)的核殼狀磁介孔二氧化硅棒在腫瘤診斷和治療中取得了不錯的效果，但是因為二氧化硅的包裹導致磁性能減弱和載藥量降低限制了核殼磁介孔二氧化硅棒的生物應用。因此，急需開發(fā)一種具備高磁性能和載藥量的磁介孔二氧化硅棒應用于腫瘤的診斷和治療。此外，腫瘤的診治呈現(xiàn)多元化趨勢，而將化療藥物與腫瘤多藥耐藥基因共載于一種輸送體并有序可控釋放藥物，集磁熱、核磁成像等診治功能為一體的納米制劑還未見報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種新型的共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒納米藥物載體，該載體具備載藥容量大、生物相容性好、細胞內(nèi)吞率高、腫瘤細胞內(nèi)pH響應性釋藥、磁性能高、增強核磁成像效果、毒性低等特點，可共載化療藥物和基因，在腫瘤細胞內(nèi)有序釋放，降低傳統(tǒng)化療的毒副作用，逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥，同時將這種非對稱磁介孔二氧化硅棒納米藥物載體用于腫瘤的診治，提供一種集化療、基因治療、磁靶向、磁熱、核磁成像等多功能為一體的診斷和治療腫瘤的新體系。
[0006]本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的:采用堿水解法制備球狀磁性鐵氧體納米粒子，以陽離子表面活性劑和正硅酸乙酯制備出非對稱磁介孔二氧化硅棒，通過介孔表面功能化連接化療藥物，并賦予其pH響應釋藥的特點。然后在非對稱磁介孔二氧化硅棒表面包覆陽性高分子聚合物，增加復合材料的生物相容性和延長體內(nèi)循環(huán)時間，并以靜電吸附形式擔載基因，并將此復合材料靜脈注射到活體，運用其納米粒子的體內(nèi)被動靶向、基因?qū)蚝蚉H響應釋藥，抗多藥耐藥基因和化療藥物協(xié)同性，體外磁靶向，核磁成像等多種技術(shù)用于惡性腫瘤的診斷和治療。
[0007]該共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒是采用球狀磁性鐵氧體納米粒子、正硅酸乙酯，通過溶膠凝膠法制備出非對稱磁介孔二氧化硅棒，并對該非對稱磁介孔二氧化硅棒上進行表面功能化修飾，依次裝載化療藥物、包覆陽性高分子聚合物、擔載基因藥物得到目標產(chǎn)品；所述目標產(chǎn)品棒長lOO-lOOOnm，棒寬50_200nm，比表面積為500-1000m2/g,介孔的孔徑為2-20nm。飽和磁場強度為50-100emu/g,磁響應能力為:對1mL微粒的水溶液，在0.2T的外加磁場下，微粒富集時間在30秒以內(nèi)；是以磁性鐵氧體納米粒子為頭，介孔二氧化硅為棒的球-棒狀非對稱納米載體。
[0008]具體制備步驟如下:
[0009]I)球狀磁性鐵氧體納米粒子的制備:在二甘醇(DEG)溶液中，加入表面包覆材料聚丙烯酸(PAA)和三氯化鐵(FeCl3),在氮氣的保護下攪拌加熱至220°C。30分鐘后加入80°C的氫氧化鈉(NaOH)的二甘醇溶液，攪拌反應I小時；將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、干燥，制備出球狀磁性鐵氧體納米粒子(Fe3O4)15反應物的用量為:按每34mL二甘醇中加入聚丙烯酸0.576g (8mmol),三氯化鐵0.13g(0.8mmol);氫氧化鈉的二甘醇溶液的濃度為0.lg/mL,用量為1.9?5.7mL ;攪拌速度為100?lOOOrpm。
[0010]2)非對稱磁介孔二氧化硅棒制備:將步驟I)制備得到的球狀磁性鐵氧體納米粒子(Fe3O4)分散在去離子水中，加入陽離子表面活性劑，超聲40分鐘后加入氨水，攪拌加熱至40°C。緩慢滴加正硅酸乙酯(TEOS)，攪拌反應30分鐘；將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、干燥，制備出非對稱磁介孔二氧化硅棒。反應物的用量為:反應物摩爾比[TE0SX10_7]/[Fe304]=2:l?7:1 ;陽離子表面活性劑的濃度為10_2?102mg/mL，氨水的用量為0.1?ImL,攪拌速度為100?lOOOrpm。
[0011]所述的陽離子表面活性劑是烷基季銨鹽類CxTAB (X=12?18)中一種或幾種混合。
[0012]3)非對稱磁介孔二氧化硅棒的表面功能化處理:將非對稱磁介孔二氧化硅棒在反應溶劑中超聲分散后，加入功能化有機硅源，攪拌均勻后加入去離子水、鹽酸或者氨水；攪拌反應，將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、干燥后得到表面功能化的非對稱磁介孔二氧化硅棒。所述的反應溶劑選自乙醇、乙二醇、異丙醇、甲苯中一種或大于一種以上。
[0013]所述的功能化有機硅源選自APS、APTS、AEAPS、APTES、GPTES、APDES、APTMS 中一種或大于一種以上。
[0014]所述的攪拌反應溫度為15?250°C，反應時間為I?96小時，攪拌速度為100?100rpm0
[0015]4)裝載化療藥物:將步驟3)中經(jīng)表面功能化的非對稱磁介孔二氧化硅棒分散在一定濃度的細胞毒性抗腫瘤藥物的溶液中，攪拌反應，將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、低溫真空干燥后得到擔載藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒。小分子抗腫瘤藥物的濃度為0.1M?飽和濃度，溶劑為水、甘油、DMSO和異丙醇中的一種或大于一種以上，時間為2?96小時，低溫干燥溫度為_50°C?0°C。通過介孔表面與小分子抗腫瘤藥物將功能基團的偶聯(lián)賦予其pH響應釋藥的特點。
[0016]所述的抗腫瘤小分子化學藥物選自阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、硫酸長春新堿、氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、米托蒽醌、環(huán)磷腺苷、環(huán)磷酰胺、硫酸培洛霉素、卡介、亞胺醌、鹽酸阿柔比星、卡莫絲汀、替莫唑胺、洛莫司汀、卡莫氟、替加氟、放線菌素D、絲裂霉素、安吖啶、氨磷汀、順鉬、阿拉瑞林、氨魯米特、鹽酸氮芥、索拉非尼、尼洛替尼、達沙替尼中的一種或大于一種以上；或選擇上述抗腫瘤藥物的衍生物中一種或大于一種以上；或選自上述抗腫瘤藥物與上述抗腫瘤藥物的衍生物中一種或大于一種以上的混合物。
[0017]5)擔載基因:將表面功能化的非對稱磁介孔二氧化娃棒在反應溶劑中超聲分散后，加入陽性高分子聚合物，攪拌均勻后加入去離子水、鹽酸或者氨水；攪拌反應溫度為15?250°C，攪拌速度為100?lOOOrpm。反應時間為I?96小時，將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、干燥后得到陽性高分子聚合物包覆的非對稱磁介孔二氧化硅棒。將陽性高分子聚合物包覆的非對稱磁介孔二氧化硅棒分散在一定濃度的抗腫瘤基因藥物的水溶液中，攪拌反應，將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、低溫真空干燥后得到擔載藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒。抗腫瘤基因藥物的濃度為0.1M?飽和濃度，時間為2?96小時，低溫干燥溫度為-50°C?(TC。
[0018]所述的陽性高分子聚合物包括聚醚酰亞胺、聚酰胺-胺樹形高分子、脫乙酰殼聚糖、透明質(zhì)酸、陽離子多肽、明膠、陽離子聚酯、陽離子聚磷酸酯、聚乙烯基吡啶鹽、聚(二甲氨基)乙基甲基丙烯酸酯的一種或大于一種以上；或選擇上述陽性高分子聚合物的衍生物中一種或大于一種以上；或選自上述陽性高分子聚合物與上述陽性高分子聚合物的衍生物中一種或大于一種以上的混合物。
[0019]所述的抗腫瘤基因藥物包括腫瘤治療用的DNA、siRNA, microRNA中的一種或大于一種以上的混合物。
[0020]針對本發(fā)明的共載化療和基因藥物的非對稱非對稱磁介孔二氧化硅棒,進行如下鑒定和功能確認:
[0021](I)表征、性能鑒定:研究生理環(huán)境對新組裝體系的尺寸、分散度和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響，通過紅外、動態(tài)光散射、透射電鏡，氮氣吸附-脫附曲線表，磁滯回線等方法表征其分子結(jié)構(gòu)、磁學性質(zhì)及其他理化性質(zhì)。
[0022](2)體外載藥和釋藥:取一定量的復合材料與含化療藥物的溶液混合，室溫下攪拌24h，離心后收集上清液。通過紫外可見光吸收光譜法檢測上清液中化療藥物的含量，計算載藥率和包封率。體外釋藥:將復合材料分散于去離子水，裝入的透析袋中，然后放入緩沖溶液中透析。緩沖液溫度為25。。，pH值分別為4.2,5.6,6.5,7.4。每間隔2h取少量緩沖溶液進行紫外可見吸收光譜法測定，測定后再將取出的少量緩沖液倒回至釋放體系。測定24h內(nèi)不同時間點、不同pH值環(huán)境緩沖液吸光度值，計算釋藥率，繪制釋藥曲線。
[0023](3)體內(nèi)抑腫瘤率評價:Nu/nu BAlB/c雄性小鼠背部接種細胞株，待腫瘤大小為60mm3-1OOmm3時開始給藥,分組如下,待腫瘤大小為60_3_100_3時開始給藥,每組10只動物，在dl、d8、dl5和d22靜脈給藥4次。第30d處死動物，通過腫瘤生長容積曲線、腫瘤重量計算不同組別抑瘤率。
[0024](4)體內(nèi)核磁共振成像:選取d0，dl、d8、dl5、d22和d30時間點，用氯胺酮和甲苯噻嗪復合麻醉劑麻醉小鼠。采用1.5T磁共振成像儀,選擇多功能腕關(guān)節(jié)小線圈?？焖僮孕夭?FSE)序列，TlW I(TR400ms, TEllms),T2ff I (R2000ms, TE91ms)，層厚 2mm，層數(shù) 7，視野(FOV) 60mm,矩陣256 X 224，實時評價每組治療腫瘤的效果。
[0025]本發(fā)明具有以下優(yōu)點和積極效果；
[0026]1、本發(fā)明的共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒具備如下優(yōu)點:①生物相容性:藥物載體需采用生物相容性好，可降解，毒性小的材料，延長在血液中的循環(huán)時間，減少或避免單核-巨噬細胞系統(tǒng)的吞噬作用靶向性:載體能通過磁靶向至腫瘤細胞，提高藥物的治療效果，降低毒副作用；③細胞內(nèi)可控釋藥:攜帶藥物的載體進入細胞內(nèi)，并通過pH響應或熱響應、磁響應等機制有效釋放藥物，在時間和空間上可調(diào)控；④協(xié)同治療:一方面攜帶兩種或兩種以上藥物時，藥物間起協(xié)同或相加作用；另一方面利用磁熱反應和化療和基因治療相結(jié)合，產(chǎn)生協(xié)同作用。⑤實時成像:通過核磁成像對治療效果進行實時監(jiān)測。
[0027]2、本發(fā)明的共載化療和基因藥物的非對稱核殼磁介孔二氧化硅棒與傳統(tǒng)的磁性能弱和載藥量低的核殼磁介孔二氧化硅棒相比，具備載藥容量大、生物相容性好、細胞內(nèi)吞率高、腫瘤細胞內(nèi)PH響應性釋藥、磁性能高、增強核磁成像效果、毒性低等優(yōu)點，可共載化療藥物和基因，在腫瘤細胞內(nèi)有序釋放，降低傳統(tǒng)化療的毒副作用，逆轉(zhuǎn)腫瘤的多藥耐藥。
[0028]3、本發(fā)明的共載化療和基因藥物的非對稱核殼磁介孔二氧化硅棒可以擔載化療藥物進行抗腫瘤治療，降低了化療藥物的毒副作用，取得不錯的效果。
[0029]4、本發(fā)明的共載化療和基因藥物的共載化療和基因藥物的非對稱核殼磁介孔二氧化硅棒可以擔載基因藥物進行抗腫瘤治療，提高了基因治療的靶向性，取得不錯的效果。
[0030]5、本發(fā)明的共載化療和基因藥物的非對稱核殼磁介孔二氧化硅棒可以通過交變磁場的產(chǎn)熱效應進行抗腫瘤治療，提高了磁熱治療的效率，取得不錯的效果。
[0031]6、本發(fā)明的共載化療和基因藥物的非對稱核殼磁介孔二氧化硅棒可以通過核磁共振成像實時監(jiān)測抗腫瘤效果，提高了核磁共振的成像效果。
[0032]7、本發(fā)明的共載化療和基因藥物的非對稱核殼磁介孔二氧化硅棒可以同時提供一種集化療、基因治療、磁熱、核磁成像等多功能為一體的診斷和治療腫瘤的新體系。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒的合成圖。
[0034]圖2共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒磁滯回線圖。
[0035]圖3共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅釋藥圖。
[0036]圖4共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅體內(nèi)抑制腫瘤圖。
[0037]圖5共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅核磁成像圖。

【具體實施方式】
[0038]以下實施例僅用于說明本發(fā)明，而并非用于限制本發(fā)明的范圍。
[0039]實施例1:
[0040](I)在34mL 二甘醇(DEG)溶液中，加入0.576g PAA和0.13g FeCl3，在氮氣的保護下攪拌加熱至250°C，20分鐘后加入2.8mL80°C的氫氧化鈉(NaOH)的二甘醇溶液(0.1g/mL)，攪拌反應I小時后將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、干燥，制備出球狀磁性鐵氧體納米粒子(Fe3O4)0
[0041](2)將Fe3O4分散在去離子水中，加入50mg CTAB，超聲40分鐘后加入0.5mL氨水，攪拌加熱至40°C，緩慢滴加15uL TEOS,攪拌反應20分鐘；將反應產(chǎn)物分離純化，得到非對稱磁介孔二氧化硅棒。將其分散在10mL0.5%的硝酸銨乙醇溶液中，攪拌加熱回流三次以除去CTAB。得到球狀磁性鐵氧體納米粒子直徑為lOOnm，介孔二氧化硅棒的棒長200nm，棒寬10nm,比表面積為675m2/g,介孔的孔徑為2nm的非對稱磁介孔二氧化娃棒(Fe3O4-MSN)。
[0042](3)將30mg非對稱磁介孔二氧化娃棒溶于30ml乙醇中超聲20min,加入ImL APS攪拌過夜，105°C回流3-4h，磁吸分離后乙醇洗滌。將產(chǎn)物溶于50mL DMF中，加入0.5g 丁二酸酐攪拌24h。磁吸分離后乙醇洗滌，干燥后得到羧基修飾的非對稱磁介孔二氧化硅棒。將羧基修飾的非對稱磁介孔二氧化娃棒溶于1mL0.5mg/mL阿霉素的PBS溶液中，攪拌24小時后磁吸分離水洗，得到載阿霉素的非對稱磁介孔二氧化硅棒。
[0043](4)將載阿霉素的非對稱磁介孔二氧化硅棒溶于1mL PBS溶液中，加入10mgEDC和50mg NHS,攪拌反應30分鐘后加入25mg聚酰胺-胺樹形高分子(G2PAMAM)，攪拌反應4小時，磁吸分離水洗得到G2PAMAM包裹的擔載阿霉素的非對稱磁介孔二氧化硅棒。將G2PAMAM包裹的擔載阿霉素的非對稱磁介孔二氧化硅棒。溶于1mL PBS溶液中，加入1uMsiRNA,攪拌24h后，磁吸分離水洗冷凍干燥得到共載阿霉素和P_gp siRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/D0X/G2-siRNA)。
[0044](5)如圖1和2所不,經(jīng)過透射電鏡和磁滯回線表征共載阿霉素和P-gp siRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/D0X/G2-siRNA)，由圖可見該共載阿霉素和P_gp siRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/D0X/G2-siRNA)載體為球-棒狀納米粒子，其棒長200nm,棒寬10nm,磁性能為60emu/g。1mg上述制備得到的共載阿霉素和P_gp siRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/D0X/G2-siRNA)置于透析袋中，加入pH=5.5或7.4的緩沖溶液攪拌，120小時內(nèi)藥物在酸性條件(pH=5.5)下釋放率約為50%，而在中性條件(pH=7.4)下釋放率小于5%，該載體的載藥量約為30%。
[0045]實施例2:
[0046](I)在50mL 二甘醇(DEG)溶液中，加入0.8g PAA和0.2g FeCl3，在氮氣的保護下攪拌加熱至250°C。20分鐘后加入4.0mL80°C的氫氧化鈉(NaOH)的二甘醇溶液(0.1g/mL)，攪拌反應I小時后將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、干燥，制備出球狀磁性鐵氧體納米粒子(Fe3O4)0
[0047](2)將Fe3O4分散在去離子水中，加入50mg CTAB，超聲40分鐘后加入ImL氨水，攪拌加熱至40°C。緩慢滴加25uL TE0S,攪拌反應20分鐘；將反應產(chǎn)物分離純化，得到非對稱磁介孔二氧化硅棒。將其分散在10mL0.5%的硝酸銨乙醇溶液中，攪拌加熱回流三次以除去CTAB。得到球狀磁性鐵氧體納米粒子直徑為lOOnm，介孔二氧化硅棒的棒長300nm，棒寬10nm,比表面積為800m2/g,介孔的孔徑為2nm的非對稱磁介孔二氧化娃棒(Fe3O4-MSN)。
[0048](3)將30mg非對稱磁介孔二氧化娃棒溶于30ml乙醇中超聲20min,加入ImL APTS攪拌過夜，105°C回流3-4h，磁吸分離后乙醇洗滌。將產(chǎn)物溶于50mL DMF中，加入0.5g 丁二酸酐攪拌24h。磁吸分離后乙醇洗滌，干燥后得到羧基修飾的非對稱磁介孔二氧化硅棒。將羧基修飾的非對稱磁介孔二氧化硅棒溶于1mL0.3mg/mL長春新堿的PBS溶液中，攪拌24小時后磁吸分離水洗，得到載長春新堿的非對稱磁介孔二氧化硅棒。
[0049](4)將載長春新堿的非對稱磁介孔二氧化硅棒溶于1mLPBS溶液中，加入10mgEDC和50mg NHS，攪拌反應30分鐘后加入40mg聚醚酰亞胺(PEI)，攪拌反應4小時，磁吸分離水洗得到PEI包裹的擔載長春新堿的非對稱磁介孔二氧化硅棒。將PEI包裹的擔載長春新堿的非對稱磁介孔二氧化硅棒溶于1mL PBS溶液中，加入20uM mir_21，攪拌24h后，磁吸分離水洗冷凍干燥得到共載聚醚酰亞胺和miRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe 304-MSN/VCR/PE1-mi RNA)。
[0050](5)將1mg上述制備得到的共載聚醚酰亞胺和miRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/VCR/PEI_miRNA)。置于透析袋中，加入pH=5.5或7.4的緩沖溶液攪拌，如圖3所示，120小時內(nèi)藥物在酸性條件(pH=5.5)下釋放率約為60%，而在中性條件(pH=7.4)下釋放率小于5%，該載體的載藥量為40%。
[0051]實施例3:
[0052](I)在50mL 二甘醇(DEG)溶液中，加入0.6g PAA和0.15g FeCl3，在氮氣的保護下攪拌加熱至250°C。20分鐘后加入3.0mL80°C的氫氧化鈉(NaOH)的二甘醇溶液(0.1g/mL)，攪拌反應I小時后將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、干燥，制備出球狀磁性鐵氧體納米粒子(Fe3O4)0
[0053](2)將Fe3O4分散在去離子水中，加入40mg CTAB，超聲40分鐘后加入0.8mL氨水，攪拌加熱至40°C。緩慢滴加50uL TE0S,攪拌反應20分鐘；將反應產(chǎn)物分離純化，得到非對稱磁介孔二氧化硅棒。將其分散在10mL0.5%的硝酸銨乙醇溶液中，攪拌加熱回流三次以除去CTAB。得到球狀磁性鐵氧體納米粒子直徑為lOOnm，介孔二氧化硅棒的棒長400nm,棒寬150nm,比表面積為1000m2/g,介孔的孔徑為2nm的非對稱磁介孔二氧化娃棒(Fe3O4-MSN)。
[0054](3)將30mg非對稱磁介孔二氧化娃棒溶于30ml乙醇中超聲20min,加入ImL APTMS攪拌過夜，105°C回流3-4h，磁吸分離后乙醇洗滌。將產(chǎn)物溶于50mL DMF中，加入0.5g 丁二酸酐攪拌24h。磁吸分離后乙醇洗滌，干燥后得到羧基修飾的非對稱磁介孔二氧化硅棒。將羧基修飾的非對稱磁介孔二氧化娃棒溶于1mL0.lmg/mL多西紫杉醇的PBS溶液中，攪拌24小時后磁吸分離水洗，得到載多西紫杉醇的非對稱磁介孔二氧化硅棒。
[0055](4)將載多西紫杉醇的非對稱磁介孔二氧化硅棒溶于1mLPBS溶液中，加入10mgEDC和50mg NHS，攪拌反應30分鐘后加入30mg功能化透明質(zhì)酸(HA-ADH)，攪拌反應4小時，磁吸分離水洗得到HA包裹的擔載多西紫杉醇的非對稱磁介孔二氧化硅棒。將HA包裹的擔載多西紫杉醇的非對稱磁介孔二氧化硅棒溶于1mL PBS溶液中，加入1uM siRNA，攪拌24h后，磁吸分離水洗冷凍干燥得到共載多西紫杉醇和Bcl-2siRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/TAX/HA-siRNA)。
[0056](5)將1mg上述制備得到的共載多西紫杉醇和Bcl_2siRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/TAX/HA_siRNA)置于透析袋中，加入pH=5.5或7.4的緩沖溶液攪拌，120小時內(nèi)藥物在酸性條件(pH=5.5)下釋放率約為75%，而在中性條件(pH=7.4)下釋放率小于5%，該載體的載藥量為40%。
[0057]實施例4:采用實施例1的共載阿霉素和P-gp siRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/D0X/G2-siRNA)治療耐藥乳腺癌 Nu/nu BAlB/c 雌性小鼠模型。Nu/nu BAlB/c雌性小鼠背部接種耐阿霉素MCF-7/D0X細胞株，待腫瘤大小為60mm3-100mm3時開始給藥，分組如下:
[0058]①Fe304-MSN/D0X/G2_siRNA
[0059]②Fe3O4-MSN 組
[0060]③siRNA 組
[0061]④Dox對照組
[0062]⑤生理鹽水組
[0063]每組10只動物，在dl、d8、dl5和d22靜脈給藥4次。第30d處死動物，通過腫瘤生長容積曲線、腫瘤重量計算得到Fe304-MSN/D0X/G2-siRNA的抑瘤率為70%，高于siRNA和Dox 組的 10% 和 20%ο
[0064]實施例5:采用實施例2的共載長春新堿和miRNA-21的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/VCR/PE 1-mi RNA)治療耐藥肝癌 Nu/nu BAlB/c 雄性小鼠模型。Nu/nu BAlB/c 雄性小鼠背部接種耐長春新堿IfepG2/VCR細胞株，待腫瘤大小為60mm3-100mm3時開始給藥，分組如下:
[0065]①Fe304-MSN/VCR/PE1-miRNA
[0066]②Fe3O4-MSN 組
[0067]③miRNA 組
[0068]④VCR對照組
[0069]⑤生理鹽水組
[0070]每組10只動物，在dl、d8、dl5和d22靜脈給藥4次。第30d處死動物，通過腫瘤生長容積曲線、腫瘤重量計算得到Fe304-MSN/VCR/PEI_miRNA的抑瘤率為60%，高于miRNA和VCR 組的 20% 和 25%。
[0071]實施例6:采用實施例3的共載多西紫杉醇和bcl_2siRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/TAX/HA-siRNA)治療耐藥肝癌 Nu/nu BAlB/c 雄性小鼠模型。Nu/nu BAlB/c雄性小鼠背部接種耐多西紫杉醇A549/TAX細胞株，待腫瘤大小為60mm3-100mm3時開始給藥，分組如下:
[0072]①Fe304-MSN/TAX/HA-siRNA
[0073]②Fe3O4-MSN 組
[0074]③siRNA 組
[0075]④TAX對照組
[0076]⑤生理鹽水組
[0077]每組10只動物，在dl、d8、dl5和d22靜脈給藥4次。第30d處死動物，如圖4所示，通過腫瘤生長容積曲線、腫瘤重量計算得到Fe304-MSN/TAX/HA-siRNA的抑瘤率為80%，高于siRNA和TAX組的25%和30%。
[0078]實施例7:采用實例I的共載阿霉素和P-gp siRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/D0X/G2-siRNA)進行荷瘤小鼠的核磁成像檢測。采用1.5T磁共振成像儀，選擇多功能腕關(guān)節(jié)小線圈?？焖僮孕夭?FSE)序列，TlW I (TR400ms, TEllms), T2WI (R2000ms, TE91ms)，層厚 2_，層數(shù) 7，視野(FOV) 60mm,矩陣 256 X 224。如果 5 所示，結(jié)果顯示給藥后較給藥前腫瘤區(qū)域的T2信號明顯增強，取得了良好的核磁成像增強效果。
[0079]實施例8:采用實例I的共載阿霉素和P-gp siRNA的非對稱磁介孔二氧化硅棒(Fe304-MSN/D0X/G2-siRNA)進行荷瘤小鼠化療、基因治療和熱療三位一體的治療模式。Nu/nu BAlB/c雌性小鼠背部接種耐阿霉素MCF-7/D0X細胞株，待腫瘤大小為60mm3-100mm3時開始給藥，分組如下:
[0080]①Fe304-MSN/D0X/G2_siRNA+ 磁熱
[0081]②Fe304-MSN/D0X
[0082]③Fe304-MSN/G2_siRNA
[0083]④Fe3O4-MSN+ 磁熱
[0084]⑤DOX
[0085]⑥Fe3O4-MSN 組
[0086]⑦生理鹽水組
[0087]每組10只動物，在dl、d8、dl5和d22靜脈給藥4次，加磁熱組每次給藥后利用交變磁場發(fā)生儀器在腫瘤部位進行一次磁熱治療。第30d處死動物，通過腫瘤生長容積曲線、腫瘤重量計算得到Fe304-MSN/D0X/G2-siRNA+磁熱的抑瘤率為90%，高于其他組別。
【權(quán)利要求】
1.一種共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒，其特征在于:它是采用球狀磁性鐵氧體納米粒子、正硅酸乙酯，通過溶膠凝膠法制備出非對稱磁介孔二氧化硅棒，并對該非對稱磁介孔二氧化硅棒上進行表面功能化修飾，依次裝載化療藥物、包覆陽性高分子聚合物、擔載基因藥物得到目標產(chǎn)品；所述目標產(chǎn)品棒長lOO-lOOOnm，棒寬50_200nm，比表面積為500-1000m2/g,介孔的孔徑為2-20nm,飽和磁場強度為50-100emu/g,磁響應能力為:對1mL微粒的水溶液，在0.2T的外加磁場下，微粒富集時間在30秒以內(nèi)；是以磁性鐵氧體納米粒子為頭，介孔二氧化硅為棒的球-棒狀非對稱納米載體。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒的制備方法，其特征在于:該方法的具體步驟如下: 1)球狀磁性鐵氧體納米粒子的制備:在二甘醇DEG溶液中，加入表面包覆材料聚丙烯酸PAA和三氯化鐵FeCl3,在氮氣的保護下攪拌加熱至220°C，30分鐘后加入80°C的氫氧化鈉NaOH的二甘醇溶液，攪拌反應I小時；將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、干燥，制備出球狀磁性鐵氧體納米粒子Fe3O4,反應物的用量為:按每34mL 二甘醇中加入聚丙烯酸0.576g,三氯化鐵0.13g ;氫氧化鈉的二甘醇溶液的濃度為0.lg/mL,用量為1.9?5.7mL ;攪拌速度為100 ?100rpm ； 2)非對稱磁介孔二氧化硅棒制備:將步驟I)制備得到的球狀磁性鐵氧體納米粒子Fe3O4分散在去離子水中，加入陽離子表面活性劑，超聲40分鐘后加入氨水，攪拌加熱至400C，緩慢滴加正硅酸乙酯TE0S，攪拌反應30分鐘；將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、干燥，制備出非對稱磁介孔二氧化硅棒，反應物的用量為:反應物摩爾比TE0SX10_7/Fe304=2:l?7:1 ;陽離子表面活性劑的濃度為10_2?102mg/mL，氨水的用量為0.1?lmL，攪拌速度為100?100rpm ； 3)非對稱磁介孔二氧化娃棒的表面功能化處理:將非對稱磁介孔二氧化娃棒在反應溶劑中超聲分散后，加入功能化有機硅源，攪拌均勻后加入去離子水、鹽酸或者氨水；攪拌反應，將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、干燥后得到表面功能化的非對稱磁介孔二氧化硅棒； 4)裝載化療藥物:將步驟3)中經(jīng)表面功能化的非對稱磁介孔二氧化硅棒分散在一定濃度的細胞毒性抗腫瘤藥物的溶液中，攪拌反應，將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、低溫真空干燥后得到擔載藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒，小分子抗腫瘤藥物的濃度為0.1M?飽和濃度，溶劑為水、甘油、DMSO和異丙醇中的一種或大于一種以上，時間為2?96小時,低溫干燥溫度為_50°C?0°C，通過介孔表面與小分子抗腫瘤藥物將功能基團的偶聯(lián)賦予其pH響應釋藥的特點； 5)擔載基因:將表面功能化的非對稱磁介孔二氧化娃棒在反應溶劑中超聲分散后，加入陽性高分子聚合物，攪拌均勻后加入去離子水、鹽酸或者氨水；攪拌反應溫度為15?2500C，攪拌速度為100?lOOOrpm，反應時間為I?96小時，將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、干燥后得到陽性高分子聚合物包覆的非對稱磁介孔二氧化硅棒；將陽性高分子聚合物包覆的非對稱磁介孔二氧化硅棒分散在一定濃度的抗腫瘤基因藥物的水溶液中，攪拌反應，將反應產(chǎn)物磁吸分離、水洗、低溫真空干燥后得到擔載藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒，抗腫瘤基因藥物的濃度為0.1M?飽和濃度，時間為2?96小時，低溫干燥溫度為-50°C?0°C。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒的制備方法，其特征在于:步驟2)中所述的陽離子表面活性劑是烷基季銨鹽類CxTAB中一種或幾種混合，其中X=12?18。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒的制備方法，其特征在于:步驟3)中所述的反應溶劑選自乙醇、乙二醇、異丙醇、甲苯中一種或大于一種以上；所述的功能化有機硅源選自APS、APTS、AEAPS, APTES, GPTES, APDES, APTMS中一種或大于一種以上；所述的攪拌反應溫度為15?250°C,反應時間為I?96小時,攪拌速度為100?lOOOrpm。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒的制備方法，其特征在于:步驟4)中所述的抗腫瘤小分子化學藥物選自阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、硫酸長春新堿、氟脲嘧啶、甲氨蝶呤、米托蒽醌、環(huán)磷腺苷、環(huán)磷酰胺、硫酸培洛霉素、卡介、亞胺醌、鹽酸阿柔比星、卡莫絲汀、替莫唑胺、洛莫司汀、卡莫氟、替加氟、放線菌素D、絲裂霉素、安吖啶、氨磷汀、順鉬、阿拉瑞林、氨魯米特、鹽酸氮芥、索拉非尼、尼洛替尼、達沙替尼中的一種或大于一種以上；或選擇上述抗腫瘤藥物的衍生物中一種或大于一種以上；或選自上述抗腫瘤藥物與上述抗腫瘤藥物的衍生物中一種或大于一種以上的混合物。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒的制備方法，其特征在于:步驟5)中所述的陽性高分子聚合物包括聚醚酰亞胺、聚酰胺-胺樹形高分子、脫乙酰殼聚糖、透明質(zhì)酸、陽離子多肽、明膠、陽離子聚酯、陽離子聚磷酸酯、聚乙烯基吡啶鹽、聚二甲氨基乙基甲基丙烯酸酯的一種或大于一種以上；或選擇上述陽性高分子聚合物的衍生物中一種或大于一種以上；或選自上述陽性高分子聚合物與上述陽性高分子聚合物的衍生物中一種或大于一種以上的混合物；所述的抗腫瘤基因藥物包括腫瘤治療用的DNA、siRNA、microRNA中的一種或大于一種以上的混合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒應用于制備診治腫瘤共載化療藥物或/和基因藥物的載體。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種共載化療和基因藥物的非對稱磁介孔二氧化硅棒應用于制備集化療、基因治療、磁靶向、磁熱和核磁成像多功能為一體的腫瘤診治藥物的載體。
【文檔編號】A61K47/24GK104225599SQ201310234847
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2013年6月14日 優(yōu)先權(quán)日:2013年6月14日
【發(fā)明者】陳立, 董文飛, 李晶, 邵丹 申請人:吉林大學