抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束組合物的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束組合物，尤其是包載難溶性抗腫瘤藥物的抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束組合物。本發(fā)明采用一定比例的兩種生物相容的pH敏感兩親性嵌段聚合物、作為P-gp抑制劑的兩親性聚合物聚乙二醇維生素E琥珀酸酯(TPGS)構(gòu)建抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束，其包載難溶性抗腫瘤藥物。經(jīng)試驗證明，本發(fā)明的聚合物膠束組合物具有pH依賴性的釋放特征，并以高濃度蓄積于腫瘤組織，對腫瘤組織中由于P-糖蛋白過表達(dá)而產(chǎn)生耐藥性的腫瘤細(xì)胞具有特異性抑制生長的作用，為難溶性抗腫瘤藥物和逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞的耐藥性提供了一種新型的載體和制劑策略。
【專利說明】抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束組合物

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物制劑領(lǐng)域，涉及抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束組合物，尤其是 包載難溶性抗腫瘤藥物的抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束組合物。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前臨床上治療腫瘤的常用化療藥物多為疏水性藥物，其在水中的溶解度非常 低，難于制備合適的制劑，往往采取各種方法增加其溶解度，如將其制成鹽類、加入助溶劑 及低分子表面活性劑等增溶。由于表面活性劑易得，所以臨床使用時采用低分子表面活性 劑增溶往往成為首選。但該劑型血液穩(wěn)定性很差，低分子表面活性劑等輔料的毒副作用也 很大，而且釋放行為不易控制。因此，研究開發(fā)難溶性抗腫瘤藥物的載體對臨床腫瘤治療有 著重要的意義。近年來，聚合物膠束載藥系統(tǒng)引起了廣泛地關(guān)注。
[0003] 聚合物膠束是兩親性聚合物在水環(huán)境中自組裝形成的獨特的核-殼結(jié)構(gòu)，能夠增 溶難溶性藥物，并且其納米級粒徑可避免被巨噬細(xì)胞識別和吞噬，通過腫瘤組織EPR效應(yīng) 而增強被動靶向性，減少藥物不良反應(yīng)，被認(rèn)為是最有前景的抗腫瘤藥物傳遞系統(tǒng)之一。然 而，常規(guī)的聚合物膠束存在兩大缺陷：一是膠束在體循環(huán)中過早的釋藥，增加了全身的毒副 作用；二是腫瘤部位藥物的濃度或藥物的蓄積不夠，達(dá)不到有效治療濃度。因此，降低體內(nèi) 循環(huán)時藥物的釋放、控制聚合物膠束到達(dá)腫瘤部位或腫瘤細(xì)胞后再快速釋放藥物是提高抗 腫瘤藥物的有效性和安全性的一種有效方式。具有響應(yīng)外部刺激（如溫度、pH、超聲、酶等） 而觸發(fā)釋放的智能型聚合物膠束傳遞系統(tǒng)在這方面具有十分明顯的優(yōu)勢，并已經(jīng)成為抗腫 瘤藥物制劑的研究熱點，其中pH依賴性釋放藥物的pH敏感聚合物膠束最引人關(guān)注。這是 因為，一方面，實體瘤的細(xì)胞外間質(zhì)pHe為6. 5-7. 2,低于正常組織的pH7. 4 ;細(xì)胞內(nèi)部含有 pH更低的內(nèi)涵體（pH5. 5-6. 0)和溶酶體（pH4. 5-5. 0)。另一方面，聚合物膠束主要通過內(nèi) 吞被細(xì)胞攝取，膠束到達(dá)的細(xì)胞內(nèi)位點是內(nèi)涵體/溶酶體。膠束由胞外內(nèi)化入胞及隨后的 過程要經(jīng)歷pH的梯度變化。當(dāng)外部環(huán)境的pH高于形成聚合物膠束的嵌段聚合物的pK a時， 聚合物膠束以緊密完整的形態(tài)包載藥物，基本不釋放；當(dāng)外部環(huán)境的pH低于形成聚合物膠 束的嵌段聚合物的pK a時，膠束急劇膨脹，甚至解聚，藥物便快速釋放。因此，在腫瘤部位或 入胞后的膠束響應(yīng)其pH環(huán)境的變化釋藥加快。利用這一特性可以實現(xiàn)體內(nèi)特定部位（腫 瘤）或細(xì)胞內(nèi)（內(nèi)涵體、溶酶體、細(xì)胞質(zhì)）靶向給藥。
[0004] 目前，在公開的現(xiàn)有技術(shù)中，由于生物相容性和生物可降解性的限制，形成pH敏 感聚合物膠束的pH敏感嵌段聚合物的親水鏈段一般僅局限于聚乙二醇（PEG)，而處于膠束 親水表面的PEG可能阻礙膠束的細(xì)胞攝取和隨后的胞內(nèi)過程。此外，pH敏感聚合物膠束的 pH敏感嵌段普遍是疏水鏈段呈現(xiàn)pH敏感性，由其形成膠束的pH敏感區(qū)域在膠束內(nèi)核，其對 外部環(huán)境pH的刺激響應(yīng)較遲緩，因此在弱酸性條件下的釋放雖然快于pH7. 4的情況，但還 是相對緩慢。
[0005] 另一方面，腫瘤細(xì)胞的多藥耐藥（multidrug resistance, MDR)是臨床腫瘤化療 失敗的主因，亦是腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的起因。迄今公認(rèn)的最廣泛的耐藥機制是膜轉(zhuǎn)運蛋白將 腫瘤細(xì)胞內(nèi)的藥物泵出，其中過度表達(dá)的由MDR1基因編碼的P-gp對藥物的外排被認(rèn)為是 最重要的機制之一。因此，過度表達(dá)的P-gp是腫瘤治療的主要障礙。為了克服腫瘤細(xì)胞 的耐藥性，現(xiàn)有技術(shù)往往將抗腫瘤藥物和P-gp抑制劑聯(lián)用，但兩者理化性質(zhì)的不同導(dǎo)致其 藥物動力學(xué)和在腫瘤部位的蓄積差異較大，因而P-gp抑制劑不能很好地發(fā)揮作用。現(xiàn)有技 術(shù)CN102292109A公開了將抗腫瘤藥物和P-gp抑制劑共同包載于聚合物膠束中，但存在的 問題是由于其聚合物膠束非環(huán)境敏感，P-gp抑制劑和抗腫瘤藥物在腫瘤部位釋放行為不一 致，即不能在腫瘤部位有效地快速同時釋放，從而不能很好地協(xié)同發(fā)揮作用。此外，胞內(nèi)藥 物濃度未能及時達(dá)到有效的治療濃度，還可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生多藥耐藥性。因此，快速釋 藥是抗腫瘤藥物有效殺死腫瘤細(xì)胞而又不產(chǎn)生耐藥性的關(guān)鍵。再者，由于P-gp抑制劑藥物 缺少特異性和毒副作用較大，臨床應(yīng)用受限，因此，具有P-gp抑制作用且不良反應(yīng)極低的 非離子表面活性劑藥用輔料備受關(guān)注，其可與pH敏感的嵌段聚合物形成pH敏感的混合聚 合物膠束。其中，TPGS被認(rèn)為是表面活性劑中最具潛力的市售可得的P-gp抑制劑，本發(fā)明 擬選擇TPGS作為P-gp抑制劑。
[0006] 因此，為了降低抗腫瘤藥物對正常細(xì)胞或組織的毒副作用、有效地抑制P-gp的外 排作用以增加藥物在腫瘤組織和細(xì)胞內(nèi)的累積以及促進(jìn)膠束在腫瘤組織和細(xì)胞內(nèi)的快速 釋放，研制一種將P-gp抑制劑和難溶性抗腫瘤藥物被動靶向輸送至腫瘤部位并在腫瘤組 織和胞內(nèi)同時快速釋放的聚合物膠束載體系統(tǒng)，有著廣闊的應(yīng)用前景。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于克服腫瘤細(xì)胞的耐藥性、常規(guī)聚合物膠束過早釋藥以及腫瘤部 位釋放藥物的濃度或藥物的蓄積不夠的問題。
[0008] -方面，本發(fā)明提供一種用于治療耐藥腫瘤的包載難溶性抗腫瘤藥物的pH敏感 聚合物膠束組合物。該組合物包含pH敏感的兩親性嵌段聚合物、作為P-gp抑制劑的聚乙二 醇維生素 E琥珀酸酯（TPGS)和難溶性抗腫瘤活性成分。所述的pH敏感兩親性嵌段聚合物 的親水鏈段是具有pH敏感性的聚（2-烷基-2-噁唑啉）（PAOz)，疏水鏈段選自聚酯（PE)、 聚乙二醇維生素 E琥珀酸酯（TPGS)、維生素 E琥珀酸酯（VES)等；所述的pH敏感兩親性嵌 段聚合物是二嵌段、三嵌段聚合物和/或它們的混合物。其中，所述的親水鏈段PAOz的分 子量為600?20000,優(yōu)選1000?15000,更優(yōu)選4000?10000 ;疏水鏈段中PE的分子量 為800?20000,優(yōu)選1000?15000,更優(yōu)選2000?10000,疏水鏈段中TPGS的聚乙二醇部 分的分子量為200?2000,優(yōu)選400?1500,更優(yōu)選600?1200。
[0009] 所述的聚（2-烷基-2-噁唑啉）（PAOz)嵌段中的烷基是含有1-6個碳原子的烷基， 優(yōu)選1-4個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基，更優(yōu)選基、乙基。
[0010] 所述的疏水鏈段選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚丁內(nèi)酯、聚戊內(nèi)酯、聚乙交酯丙交酯、膽 酸、TPGS、維生素 E琥珀酸酯、磷脂、磷脂衍生物。優(yōu)選選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙交酯丙交 月旨、維生素 E琥珀酸酯、磷脂。更優(yōu)選選自聚乳酸、維生素 E琥珀酸酯、磷脂。
[0011] 所述的P-gp抑制劑TPGS中的聚乙二醇部分的分子量為200?6000,優(yōu)選400? 3500,更優(yōu)選 600 ?2000。
[0012] 所述的pH敏感兩親性嵌段聚合物和TPGS的摩爾比為10 : 1-1 : 10,優(yōu)選 10 : 2-1 : 7,更優(yōu)選 10 : 5-1 : 4。
[0013] 所述的難溶性抗腫瘤活性成分選自但不限于紫杉烷類藥物如紫杉醇、喜樹堿類藥 物如9-硝基喜樹堿、蒽環(huán)類藥物如阿霉素、鬼白毒素半合成衍生物類藥物如替尼泊苷、替 尼類藥物如索尼替尼。優(yōu)選選自紫杉醇、多西紫杉醇、阿霉素。
[0014] 另外，本發(fā)明的組合物還可以包含藥學(xué)上可接受的添加劑。
[0015] 本發(fā)明用于治療耐藥腫瘤的包載難溶性抗腫瘤藥物的pH敏感聚合物膠束組合物 可以通過本領(lǐng)域公知的方法制備，例如透析法、薄膜分散法、乳化法、溶劑揮發(fā)法、凍干法、 共溶劑揮發(fā)法、注入法等。膠束的平均粒徑在200nm以下，優(yōu)選100nm以下。
[0016] 另一方面，本發(fā)明還涉及包載難溶性抗腫瘤藥物的抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物 膠束組合物用于治療耐藥腫瘤的用途。
[0017] 為了達(dá)到本發(fā)明的目的，本發(fā)明進(jìn)行了本發(fā)明組合物的體外釋放試驗、細(xì)胞毒試 驗、細(xì)胞攝取試驗、活體成像試驗。體外釋放試驗用于說明本發(fā)明組合物的pH敏感性，細(xì)胞 毒試驗和細(xì)胞攝取試驗用于說明本發(fā)明組合物的抗耐藥性，活體成像試驗用于說明本發(fā)明 組合物的pH敏感性和被動腫瘤靶向性。

【專利附圖】

【附圖說明】 [0018] 參考附圖1-圖7,通過本發(fā)明的以下描述，本發(fā)明的上述及其它目的 和特征將是顯而易見的。
[0019] 附圖1顯示了本發(fā)明實施例8中膠束的粒徑分布。
[0020] 附圖2顯示了本發(fā)明實施例8中膠束的透射電鏡形態(tài)圖。
[0021] 附圖3顯示了本發(fā)明實施例8中膠束的體外釋放圖。
[0022] 附圖4顯示了本發(fā)明實施例8中二嵌段聚合物（實施例1)的細(xì)胞毒性圖。
[0023] 附圖5顯示了本發(fā)明實施例8中膠束對耐藥腫瘤細(xì)胞KBv的細(xì)胞毒性圖。
[0024] 附圖6顯示了本發(fā)明實施例8中膠束被耐藥腫瘤細(xì)胞KBv的細(xì)胞攝取圖。附圖7 顯示了
[0025] 本發(fā)明實施例8中膠束在接種耐藥腫瘤細(xì)胞KBv的裸鼠中的活體成像圖。圖中A 組為包載DiR的PEG5000-PLA3000膠束，B組為包載DiR的對應(yīng)實施例8的膠束。圖中的 1、2、3、4和5所指示的組織分別為腫瘤、心、肝、脾、肺和腎。
[0026] 如上所述，本發(fā)明的組合物具有明顯的pH敏感性、腫瘤細(xì)胞被動靶向性和抗耐藥 性，從而可實現(xiàn)腫瘤治療的有效性和安全性。

【具體實施方式】
[0027] 以下實施例用于進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但絕對不是對本發(fā)明范圍的限制。
[0028] 實施例 1PE0z2000-VES 的合成
[0029] 將對甲苯磺酸甲酯（150mg)和2-乙基-2-卩惡唑啉（5g)溶于乙腈（80mL)，在氮氣 氛下加熱攪拌回流12h。冷卻至室溫后，以NH 3為終止劑，冷乙醚沉淀精制后真空干燥，制備 得到端基為氨基、分子量為2000的PEOz (PE0z-NH2)。取適量VES、EDC和NHS，在二氯甲烷 中反應(yīng)2小時，即得VES的活潑酯（VES-NHS)。然后加入適量摩爾比的PE0z-NH 2，以TEA為 催化劑，反應(yīng)4h后，冷乙醚沉淀精制，真空干燥即得本發(fā)明的PE0z2000-VES。
[0030] 實施例2聚（2-乙基-2-噁唑啉）-聚乳酸-聚（2-乙基-2-噁唑啉） (PE0z5000-PLA3000-PE0z5000)的合成
[0031] 在裝有攪拌器的三口燒瓶中，加入2-乙基-2-噁唑啉（10g，150mm〇l)、乙腈 (40mL)、對甲苯磺酸甲酯（0. 47g)，在80°C的油浴溫度下、氮氣氛攪拌反應(yīng)30h。冷卻后，力口 入KOH的甲醇溶液后，繼續(xù)反應(yīng)4h。除去溶劑，殘余物用THF溶解，過硅膠柱，流出液倒入 過量的冷乙醚中沉淀、抽濾，真空干燥12h。將得到PEOz-OH粉末（4g)溶于氯苯（80mL)， 在氮氣氛下加入D，L-丙交酯（6. 3g)和辛酸亞錫（0.63g)，在140°C溫度下反應(yīng)24h。將 反應(yīng)液倒入過量的乙醚中沉淀、過濾，在室溫下真空干燥12h。將得到的PE0z-PLA(0. 47g) 和4-二甲氨基吡啶（0.47g)溶于二氯甲烷中，并用冰水混合物冷卻至0°C，然后將交 聯(lián)劑己二酰氯（〇.47g)的二氯甲烷溶液滴入上述溶液中，回流反應(yīng)48h ;反應(yīng)后的溶 液用水洗滌兩次，無水硫酸鎂干燥，乙醚中沉淀，真空干燥即得本發(fā)明的三嵌段共聚物 PE0z5000-PLA3000-PE0z5000 〇
[0032] 實施例3聚乳酸-聚（2-乙基-2-噁唑啉）-聚乳酸（PLA2000-PE0z8000-PLA2000) 的合成
[0033] 將2-乙基-2-噁唑啉（9. 9g)和1，4-二溴-2- 丁烯（420mg)溶于丙酮（40mL)，在 氮氣氛下于100°c攪拌回流20h。冷卻至室溫后，向反應(yīng)瓶中加入0. lmol/L Κ0Η的甲醇溶液 (40mL)后，繼續(xù)反應(yīng)4h。過硅膠柱，流出液倒入過量的冷乙醚中沉淀、抽濾，真空干燥24h。 將得到HO-PEOz-OH粉末（2g)溶于氯苯（20mL)，在氮氣氛下加入D，L-丙交酯（0. 58g)和 辛酸亞錫（30mg)，在140°C溫度下反應(yīng)24h。將反應(yīng)液倒入過量的乙醚中沉淀、過濾，在室溫 下真空干燥12h，得到本發(fā)明的三嵌段共聚物PLA2000-PE0z8000-PLA2000。
[0034] 實施例4聚丙交酯乙交酯-聚（2-乙基-2-噁唑啉）-聚丙交酯乙交酯 (PLGA3000-PE0z 10000-PLGA3000)的合成
[0035] 將 2-乙基-2-噁唑啉（9. 9g)和 1，4-二溴-2- 丁烯（0· 47g)溶于丙酮（40mL)， 在氮氣氛下于100°c攪拌回流20h。冷卻至室溫后，向反應(yīng)瓶中加入0. lmol/L Κ0Η的甲 醇溶液（40mL)后，繼續(xù)反應(yīng)4h。過硅膠柱，流出液倒入過量的冷乙醚中沉淀、抽濾，真 空干燥24h。將得到HO-PEOz-OH粉末（2g)溶于氯苯（20mL)，在氮氣氛下加入D，L-丙 交酯（1.26g)、乙交酯（0.51g)和辛酸亞錫（30mg)，在140°C溫度下反應(yīng)24h。將反應(yīng) 液倒入過量的乙醚中沉淀、過濾，在室溫下真空干燥12h，得到本發(fā)明的三嵌段共聚物 PLGA3000-PE0z10000-PLGA3000。
[0036] 實施例5聚（2-乙基-2-噁唑啉）-聚乳酸（PE0z5700-PLA2000)的合成
[0037] 在裝有攪拌器的三口燒瓶中，加入2-乙基-2-噁唑啉（10g，150mmol)、乙腈 (40mL)、對甲苯磺酸甲酯（0. 47g)，在80°C的油浴溫度下、氮氣氛攪拌反應(yīng)30h。冷卻后，力口 入Κ0Η的甲醇溶液后，繼續(xù)反應(yīng)4h。除去溶劑，殘余物用THF溶解，過硅膠柱，流出液倒入過 量的冷乙醚中沉淀、抽濾，真空干燥12h。將丙交酯用乙酸乙酯重結(jié)晶3次，室溫下真空干 燥，測定其熔點為127°C。將得到的PEOz-OH粉末置于100ml圓底燒瓶中，加入約70ml甲 苯，采用分水器共沸除水，使揮發(fā)出來的甲苯變澄清后停止加熱。然后加入需要量的重結(jié)晶 后的丙交酯和催化劑辛酸亞錫，抽真空通氮氣保護(hù)，140°C下反應(yīng)36h。旋蒸除去甲苯后，用 二氯甲烷復(fù)溶，滴加至劇烈攪拌的〇°C的無水乙醚中沉淀、過濾，沉淀復(fù)溶后，再用冷乙醚沉 淀、真空干燥得到本發(fā)明的二嵌段共聚物PE0z5700-PLA2000。
[0038] 實施例 6 PE0z400-TPGS1000 的合成
[0039] 將2-溴丙酸乙酯（40mg)和2-乙基-2-噁唑啉（10g)溶于乙腈（100mL)，在氮氣 氛下加熱攪拌回流12h。冷卻至室溫后，以氫氧化鉀的甲醇溶液為終止反應(yīng)，冷乙醚沉淀、抽 濾，真空干燥后得端基分別為羧基和羥基、分子量為400的PEOz(HOOC-PEOz-OH)。
[0040] 取適量的HOOC-PEOz-OH、EDC和NHS，在二氯甲烷中反應(yīng)2h后，得到PEOz-OH的 活潑酯。然后加入適量摩爾比的TPGS1000,反應(yīng)過夜，冷乙醚沉淀精制，真空干燥即得 PE0z400-TPGS1000。
[0041] 實施例7包載紫杉醇的pH敏感聚合物膠束的制備
[0042] 采用薄膜分散法。將lmg紫杉醇、200mg的PE0z2000-VES充分溶于適量甲醇中，在 50°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加預(yù)溫50°C的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0. 2 μ m的 微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合物，加入適量的PEG2000,凍干可得膠束粉末。
[0043] 實施例8包載紫杉醇的抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束的制備
[0044] 采用薄膜分散法。將lmg紫杉醇、210mg的PE0z2000-VES和TPGS1000 (與 PE0z2000-VES和TPGS1000的摩爾比為1 : 1)充分溶于適量甲醇中，在50°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去 除溶劑，加預(yù)溫50°C的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0. 2 μ m的微孔濾膜過濾即得 本發(fā)明膠束組合物，加入適量的PEG2000，凍干可得膠束粉末。
[0045] 將透析制得的膠束溶液采用Malvern使Zetasizer Nano ZS儀進(jìn)行進(jìn)行動態(tài)光 散射（Dynamic Light Scattering，DLS)分析，測定膠束的粒徑及其分布。儀器的激光束 波長設(shè)定為525nm，入射光與散射光束的夾角為173°，測定溫度為25°C。測定結(jié)果見附圖 1。由圖可見，該實施例的本發(fā)明膠束的平均粒徑為31nm，粒度分布均勻，多分散性指數(shù)小于 0· 20。
[0046] 采用醋酸雙氧鈾負(fù)染法，用透射電子顯微鏡觀察聚合物膠束的形態(tài)。結(jié)果見圖2。 由圖可見，該實施例的本發(fā)明膠束呈球形，大小較均勻。
[0047] 實施例9包載阿霉素的抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束的制備
[0048] 采用透析法。預(yù)先將鹽酸阿霉素（D0X · HC1)溶于DMS0中，加入過量三乙 胺（與D0X*HC1摩爾比為3 : 1)，避光攪拌過夜，使鹽酸與三乙胺充分反應(yīng)。然后將 PE0z5700-PLA2000溶于DMS0中，加入上述D0X溶液，藥材比為2 : 10,混合均勻后裝入透析 袋（MWC0 = 3500)中，用透析袋夾封住兩端，浸入1000mL去離子水的透析液中并攪拌。透 析持續(xù)12h，每隔2?3h換水一次。透析完成后按比例加入TPGS1100水溶液（TPGS1100與 PE0z5700-PLA2000的摩爾比為1 : 3)，避光攪拌lh，經(jīng)0. 45 μ m濾膜過濾即得本發(fā)明膠束 組合物。
[0049] 實施例10包載多西紫杉醇的抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束的制備
[0050] 采用薄膜分散法制備。將2mg多西紫杉醇、100mg的PE0z5000-PLA3000-PE0z5000 和TPGS1200(摩爾比為1 : 0.5)充分溶于適量甲醇中，在50°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加預(yù) 熱50°C的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0. 2 μ m的微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組 合物，加入適量的PEG6000,凍干可得膠束粉末。
[0051] 實施例11包載替尼泊苷的抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束的制備
[0052] 采用薄膜分散法制備。將lmg替尼泊苷、100mg的PE0z400-TPGS1000和 TPGS1200(摩爾比為1 : 2)充分溶于適量甲醇中，在50°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑，加預(yù)熱 50°C的水，渦旋振蕩5min使薄膜完全水化，經(jīng)0. 2 μ m的微孔濾膜過濾即得本發(fā)明膠束組合 物，凍干可得膠束粉末。
[0053] 試驗例1抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束的體外釋放試驗
[0054] 為了評價本發(fā)明膠束組合物的pH敏感性，如下對實施例8中的本發(fā)明組合物在不 同pH下的體外釋放進(jìn)行考察。
[0055] 采用透析袋法。分別吸取一定體積的載藥膠束溶液置于活化好的透析袋（MWC0: 3500)中，并用透析夾密封，然后置于裝有35mL、pH分別為5. 0、6. 5、7. 4的PBS緩沖液 (10mM，含0.2%的Tween 80)的50mL三角瓶中，于37°C、100rpm的水浴搖床中振蕩。分別 在1、2、4、8、12和24h取出lmL釋放液，同時補充lmL新鮮的釋放介質(zhì)。將各時間點的釋放 液樣品經(jīng)0. 22 μ m濾膜過濾后，用HPLC方法分析測定紫杉醇的含量，并計算藥物的累積釋 放百分?jǐn)?shù)數(shù)。結(jié)果見圖3。
[0056] 結(jié)果顯示，實施例8中的本發(fā)明膠束組合物的體外釋放具有pH依賴性，說明實施 例8中的本發(fā)明膠束組合物在到達(dá)腫瘤部位或進(jìn)入腫瘤細(xì)胞內(nèi)能快速釋放。
[0057] 試驗例2形成膠束的主要材料的細(xì)胞毒性試驗
[0058] 為了評價形成本發(fā)明膠束組合物的主要材料對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用，如下對 形成實施例8中的本發(fā)明膠束組合物的實施例1的二嵌段聚合物進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗。
[0059] 采用SRB法。將融合達(dá)到90 %的耐藥腫瘤細(xì)胞KBv消化后計數(shù)。按照5 X 104細(xì) 胞/ml的密度接種于96孔板中。將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，移去培養(yǎng)液，每孔加 入不同濃度的實施例5中的二嵌段聚合物待測液，每個濃度設(shè)6個平行孔，以RPMI-1640完 全培養(yǎng)液為對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h，移去待測液，每孔加入10% TCA溶液200 μ L，于4°C靜置 固定lh。移去TCA溶液，用去離子水清洗5次，在40°C下烘干，每孔加入0.4% SRB的1% 醋酸溶液lOOuL，室溫靜置染色30min。移去SRB染液，用1%乙酸沖洗5次，40°C烘干。每 孔加入10mM Tris緩沖液150 μ L，37°C震蕩30min，在酶標(biāo)儀上540nm處測定各孔吸光度值 (0D值），計算細(xì)胞相對存活率。結(jié)果見圖4。
[0060] 結(jié)果顯示，實施例1的二嵌段聚合物的濃度高達(dá)10mg/mL時，仍未顯示出明顯的細(xì) 胞毒性，說明該材料本身對細(xì)胞的毒性較小。
[0061] 試驗例3抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束的細(xì)胞毒性試驗
[0062] 為了評價本發(fā)明膠束組合物對腫瘤細(xì)胞生長的抑制作用，如下對實施例8中的本 發(fā)明組合物進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗，并以游離的紫杉醇和實施例7作為對照。
[0063] 采用SRB法。將融合達(dá)到90 %的耐藥腫瘤細(xì)胞KBv消化后計數(shù)。按照5 X 104細(xì) 胞/ml的密度接種于96孔板中。將96孔板置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，移去培養(yǎng)液，每孔加 入不同體積的實施例7的膠束待測液，每個濃度設(shè)6個平行孔，以1640完全培養(yǎng)液為空白 對照組。繼續(xù)培養(yǎng)24h，移去待測液，每孔加入10% TCA溶液200μ L，于4°C靜置固定lh。 移去TCA溶液，用去離子水清洗5次，在40°C下烘干，每孔加入0. 4% SRB的1 %醋酸溶液 100 μ L，室溫靜置染色30min。移去SRB染液，用1 %乙酸沖洗5次，40°C烘干。每孔加入10mM Tris緩沖液150 μ L，37°C震蕩30min，在酶標(biāo)儀上540nm處測定各孔吸光度值（0D值），計 算細(xì)胞相對存活率。結(jié)果見圖5。
[0064] 結(jié)果顯示，游離紫杉醇的IC50為145. 23±5. 23 μ g/mL，實施例7中膠束的IC50為 45. 48±4. 29 μ g/mL，實施例8中膠束的IC50為23. 47±3. 59 μ g/mL，表明實施例8中的膠 束組合物具有顯著的抗腫瘤細(xì)胞耐藥性。
[0065] 試驗例4抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束的細(xì)胞攝取試驗
[0066] 為了評價本發(fā)明膠束組合物被腫瘤細(xì)胞攝取作用，如下對實施例8中的本發(fā)明組 合物進(jìn)行細(xì)胞攝取試驗。為了便于測定，以P-gp底物羅丹明123 (R123)代替紫杉醇，按照 實施例7和8的方法制備膠束，并以游離的R123和實施例7的組合物作為對照。
[0067] 用無血清的RPMI-1640培養(yǎng)液分別復(fù)溶實施例7、實施例8的凍干膠束粉末，使 R123的濃度皆為5 μ mol/L，并以游離的R123作為對照。
[0068] 將處于對數(shù)生長期的耐藥腫瘤細(xì)胞KBv用0. 25%胰酶消化，離心后制成單細(xì)胞懸 液并接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔培養(yǎng)液體積為3mL，細(xì)胞數(shù)為8X 105個/孔，在37°C、 5 % C02的條件下培養(yǎng)24h，使細(xì)胞貼壁。棄去培養(yǎng)液，將2mL上述各待測液分別加入相應(yīng)孔 中，繼續(xù)培養(yǎng)相應(yīng)時間后，吸去培養(yǎng)液，用3mL冷PBS輕洗細(xì)胞3次，每孔加入0. 4mL0. 25% 胰蛋白酶消化液，置于37°C培養(yǎng)箱中孵育5min，待細(xì)胞消化成圓球狀后，每孔加入0. 6mL含 血清培養(yǎng)液終止消化并吹打成單細(xì)胞懸液，轉(zhuǎn)移至1. 5mL離心管中。1500rpm離心5min，用 預(yù)冷的PBS漂洗兩次并用lmL PBS重懸細(xì)胞，吹打成單細(xì)胞懸液。將上述細(xì)胞懸液過300 目細(xì)胞篩后轉(zhuǎn)移至流式管中，用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞攝取的R123的熒光強度（激發(fā)波長 485nm/測定波長530nm)，比較各測試樣品在細(xì)胞內(nèi)的攝取情況。每次分析所用細(xì)胞數(shù)不少 于1〇 5,收集的細(xì)胞數(shù)為10000個。數(shù)據(jù)使用FCS Express V3軟件進(jìn)行分析。結(jié)果見圖6。
[0069] 結(jié)果顯示，對于耐藥細(xì)胞KBv，實施例7的細(xì)胞攝取明顯高于游離R123,實施例8 的細(xì)胞攝取明顯高于實施例7,表明實施例8中的膠束組合物具有顯著抗腫瘤細(xì)胞耐藥性。
[0070] 試驗例5抗腫瘤耐藥的pH敏感聚合物膠束的活體成像試驗
[0071] 為了評價本發(fā)明膠束組合物的腫瘤細(xì)胞靶向性，如下對本發(fā)明實施例8的組合物 進(jìn)行活體成像試驗。為了便于觀察，以熒光探針DiR代替紫杉醇如下制備對應(yīng)于實施例8 的膠束組合物，并以非pH敏感的聚乙二醇-聚乳酸（PEG5000-PLA3000)包載的DiR作為對 照。
[0072] DiR溶液的配制：精密稱取5mg DiR至50mL容量瓶中，加入無水甲醇定容，制備得 到濃度為〇. lmg/mL的DiR甲醇儲備液，錫箔紙包裹于4°C避光保存待用。
[0073] 包載DiR的PEG5000-PLA3000的膠束的制備：采用薄膜分散法。精密稱取適量的 PEG5000-PLA3000溶于甲醇中，加入適量體積的DiR儲備液，使最終的藥材比為1 : 250(w/ w)，混合均勻后在50°C下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑。加入5ml預(yù)先加溫到50°C的水水化，渦旋振 蕩5min，經(jīng)0. 2 μ m的微孔濾膜過濾后即得膠束溶液，避光于4°C保存待用。
[0074] 對應(yīng)于實施例8的DiR膠束的制備：采用薄膜分散法。精密稱取適量的 PE0z2000-VES和TPGS1000 (摩爾比為1 : 1)溶于甲醇中，加入適量體積的DiR儲備液，使 最終的藥材比為1 : 250(w/w)，混合均勻后在5(TC下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)揮干溶劑。加入5mL預(yù)熱 50°C的水水化，渦旋振蕩5min，經(jīng)0. 2 μ m的微孔濾膜過濾后即得膠束溶液，避光于4°C保存 待用。
[0075] 荷瘤裸鼠模型的建立：將生長達(dá)到90%匯合的KBv細(xì)胞用0. 25%胰酶進(jìn)行消化， 中和離心后棄去上清液，用空白1640培養(yǎng)基將細(xì)胞重新吹打分散懸浮，調(diào)整細(xì)胞濃度至 1X10 7個/mL。取200yL細(xì)胞懸液（2X106個）皮下注射到雌性BALB/c裸鼠右側(cè)腋下，接 種后每天觀察記錄腫瘤體積變化，生長約一周后，腫瘤體積達(dá)到約200mm 3即可給藥進(jìn)行活 體成像觀察。
[0076] 活體成像試驗：待腫瘤體積達(dá)到約200mm3給藥，采用尾靜脈注射，分別用生理鹽水 將DiR標(biāo)記的膠束稀釋至一定濃度，使最大注射體積不大于0. 2mL，給藥劑量為50ng/g，每 組3只。分別在給藥3、6、9、12、24、48和72h后，將裸鼠用異氟烷麻醉，放入Kodak活體成 像系統(tǒng)載物臺上進(jìn)行熒光及X光成像，采用多光譜活體成像系統(tǒng)照相。72h后處死各組裸 鼠，并解剖取出不同器官（心，肝，脾，肺，腎，腫瘤），用生理鹽水漂洗后成像。結(jié)果見圖7。 [0077] 結(jié)果顯示，在各個時間點，B組（實施例8)在腫瘤部位的熒光強度都明顯高于A組 (PEG-PLA膠束），說明實施例8的膠束具有顯著的pH敏感性，從而具有被動腫瘤靶向性。
[0078] 雖然已利用上述具體的實施方案對本發(fā)明進(jìn)行了描述，但應(yīng)認(rèn)識到，本領(lǐng)域的技 術(shù)人員還可進(jìn)行各種的改進(jìn)和改變，而且它們也應(yīng)如權(quán)利要求書限定的本發(fā)明的范圍之 內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 一種聚合物膠束組合物，其包含難溶性抗腫瘤藥物、pH敏感的兩親性嵌段聚合物、 作為P-gp抑制劑的聚乙二醇維生素 E琥珀酸酯（TPGS)及任選的可藥用輔料。
2. 如權(quán)利要求1所述的聚合物膠束組合物，其中的pH敏感兩親性嵌段聚合物和TPGS 的摩爾比為10 : 1-1 : 10,優(yōu)選10 : 2-1 : 7,更優(yōu)選10 : 5-1 : 4。
3. 如權(quán)利要求1-2任一項所述的聚合物膠束組合物，其中的pH敏感兩親性嵌段聚合物 的親水鏈段是600?20000Da，優(yōu)選1000?15000,更優(yōu)選4000?10000分子量的聚（2-烷 基-2-噁唑啉）（PAOz)，疏水鏈段選自聚酯（PE)、TPGS、維生素 E琥珀酸酯（VES)、膽酸、磷 脂和磷脂衍生物，優(yōu)選選自聚乳酸、聚己內(nèi)酯、聚乙交酯丙交酯、維生素 E琥珀酸酯、磷脂， 更優(yōu)選選自聚乳酸、維生素 E琥珀酸酯、磷脂；并且所述的兩親性嵌段聚合物是二嵌段聚合 物、三嵌段聚合物和/或它們的混合物。
4. 如權(quán)利要求3所述的聚合物膠束組合物，其中的親水鏈段PAOz中的烷基是含有1-6 個碳原子的烷基，優(yōu)選1-4個碳原子的烷基，例如甲基、乙基、正丙基、正丁基，更優(yōu)選甲基、 乙基。
5. 如權(quán)利要求3-4所述的聚合物膠束組合物，其中的疏水鏈段選自分子量為800? 20000,優(yōu)選1000?15000,更優(yōu)選2000?10000的聚酯，以及聚乙二醇部分的分子量為 200 ?2000,優(yōu)選 400 ?1500,更優(yōu)選 600 ?1200 的 TPGS。
6. 如權(quán)利要求1-5任一項所述的聚合物膠束組合物，其中的P-gp抑制劑TPGS中的聚 乙二醇部分的分子量為200?6000,優(yōu)選400?3500,更優(yōu)選600?2000。
7. 如權(quán)利要求1-6任一項所述的聚合物膠束組合物，其中的難溶性抗腫瘤藥物選自紫 杉烷類藥物如紫杉醇、喜樹堿類藥物如9-硝基喜樹堿、蒽環(huán)類藥物如阿霉素、鬼白毒素半 合成衍生物類藥物如替尼泊苷、替尼類藥物如索尼替尼。優(yōu)選選自紫杉醇、多西紫杉醇、阿 霉素。
8. 如權(quán)利要求1-7任一項所述的聚合物膠束組合物，其中所述膠束的平均粒徑在 200nm以下，優(yōu)選100nm以下。
9. 如權(quán)利要求1-8任一項所述的聚合物膠束組合物用于制備治療耐藥性腫瘤的藥物 的用途。
【文檔編號】A61K47/34GK104116711SQ201310141558
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年4月23日 優(yōu)先權(quán)日:2013年4月23日
【發(fā)明者】劉艷, 張超, 李馨儒, 周艷霞 申請人:北京大學(xué)