專利名稱：崗松總黃酮的制備及其質(zhì)量控制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種黃酮提取物制備領(lǐng)域，具體涉及一種崗松總黃酮的制備及其質(zhì)量控制方法。
背景技術(shù)：
天然植物提取物是以植物為原料，按照提取的目的需要，經(jīng)過物理化學(xué)提取分離過程，定向獲取和濃集植物中的某一種或多種有效成分，而不改變其有效成分結(jié)構(gòu)而形成的產(chǎn)品。與傳統(tǒng)草藥和中成藥相比，中藥提取物至少知道一種或一類有效成分，有明確的定量指標(biāo)，有害成分大部分被除去，從而在安全性上比傳統(tǒng)植物藥和中成藥大大提高。此外，中藥提取物還融合了現(xiàn)代制藥新技術(shù)，屬于新型中藥產(chǎn)品，具有廣闊的國際市場空間，其產(chǎn)業(yè)化有良好的發(fā)展前景，體現(xiàn)了中藥產(chǎn)業(yè)的技術(shù)進(jìn)步，適應(yīng)了中藥現(xiàn)代化的要求。崗松為桃金娘科植物崗松feecfca frutescens L.帶有花果的干燥莖葉,現(xiàn)收載于《廣西壯族自治區(qū)壯藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)匯編》第一卷，曾收載于《中國藥典》1977版。其功能主治為清利濕熱，殺蟲止癢。用于泄瀉，腹痛，急性胃腸炎；外治滴蟲性陰道炎，皮膚濕疹。研究表明崗松主要成分含有黃酮、有機(jī)酸、揮發(fā)油等類化合物，黃酮是植物中具有生物活性的一大類化合物，崗松含6，8- 二甲基山奈酚-3-0- α -鼠李糖苷、槲皮素、槲皮素-3-0- α -鼠李糖苷、楊梅素、楊梅素-3-0-α -鼠李糖苷等黃酮成分(題名崗松中的一個新黃酮醇苷類化合物作者盧文杰，牙啟康，陳家源，劉布鳴，廣西中醫(yī)藥研究院刊名藥學(xué)學(xué)報，2008年，40 (10)，1032 1035)，槲皮素含量達(dá)O. 1% (題名高效液相色譜法測定崗松藥材中槲皮素的含量作者林霄，劉布鳴，陳明生.等，廣西中醫(yī)藥研究院刊名時珍國醫(yī)國藥，2009，20 (I) :102-103.)，楊梅素含量達(dá)O. 6% (題名崗松中楊梅素的含量測定作者陳明生，劉布鳴，林霄，等，廣西中醫(yī)藥研究院刊名時珍國醫(yī)國藥，2010，21 (11):2771-2772.)。

崗松植物在我國分布廣泛，資源相當(dāng)豐富，但目前對崗松的應(yīng)用不多，應(yīng)用大多局限于提取揮發(fā)油，提油后的植物部分被作為廢棄物丟棄，而崗松黃酮提取物未能得到應(yīng)用，崗松藥材未能得到充分的開發(fā)利用，嚴(yán)重地浪費(fèi)了藥材資源。所以研發(fā)一種崗松總黃酮的制備及其質(zhì)量控制方法是有必要的，利于開發(fā)崗松新的藥用途徑，并為藥材資源的充分利用及提高其應(yīng)用價值提供科學(xué)的依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種方法合理、穩(wěn)定、生產(chǎn)周期短，適合工業(yè)化生產(chǎn)，具有抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛等藥理作用的崗松總黃酮的制備方法，及崗松總黃酮的質(zhì)量控制方法。本發(fā)明是這樣實(shí)現(xiàn)的
本發(fā)明崗松總黃酮的制備方法，包括以下步驟1、乙醇加熱回流提取
①取崗松干燥莖葉，粉碎，按重量配比加10 - 15倍量30 - 70%體積濃度的乙醇；②加熱回流提取3次，每次I一 3小時，濾過，合并濾液；
③濾液回收乙醇，并濃縮至無乙醇味，加水稀釋得到濃度為O.3 — O. 8g生藥量/mL的崗松提取液，待上柱用。2、大孔吸附樹脂分離純化
①選擇弱極性的AB — 8或DlOl大孔吸附樹脂。②吸附上柱崗松提取液濃度為O. 3 — O. 8g生藥量/mL，上柱崗松提取液體積為填充大孔吸附樹脂體積的2 - 5倍，上柱流速為O. 5 — 2 BV/h注BV/h表示柱內(nèi)單位時間(h)流經(jīng)單位體積樹脂平均液量。③洗脫洗脫劑為50 - 70%乙醇，洗脫劑用量為填充大孔吸附樹脂體積的5 - 10倍，洗脫流速為2 - 5BV/h ;收集5 — 8倍洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至干，60°C真空干燥，得崗松總黃酮提取物。本發(fā)明崗松總黃酮的質(zhì)量控制方法，包括以下步驟1、總黃酮的薄層色譜鑒別
取崗松總黃酮提取物約20mg，精密稱定，置IOmL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每ImL含Img的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄W B)試驗(yàn)，取供試品溶液、對照品溶液各5 - 10 μ 1，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯一甲酸一水一甲醇(8:1:1:0.4)為展開劑,展開,取出，晾干，噴以1%三氯化鋁試液,在105°C加熱5分鐘，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。

2、總黃酮的含量測定
①對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每ImL含O. 05 mg的溶液，即得。②標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取蘆丁對照品溶液l、2、3、5、10mL，分別置IOmL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以甲醇作為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2010版一部附錄V A)在360±lnm測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。③測定法取崗松總黃酮提取物約10mg，精密稱定，置20mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取lmL，置IOmL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，以甲醇作為空白，在360±lnm測定吸光度，含總黃酮以蘆丁(C27H3tlO16)計算，即得。崗松總黃酮含量以蘆丁(C27H3tlO16)計算不得少于50. 0%。④結(jié)果采用本發(fā)明的制備和質(zhì)量控制方法，經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，制備的崗松總黃酮含量以蘆丁計，可達(dá)50%以上。所述的崗松總黃酮應(yīng)用于抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛的藥物中的。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明突出的實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著的進(jìn)步是1、本發(fā)明首次從崗松中制備出含量50%以上的崗松總黃酮提取物，為藥材資源的充分利用及提高其應(yīng)用價值提供科學(xué)的依據(jù)。2、本發(fā)明設(shè)計合理，制備方法合理、穩(wěn)定、可行，耗能低，利用醇水溶劑提取，經(jīng)過一次大孔吸附樹脂柱分離純化即可得到含量較高的崗松總黃酮提取物，方法簡便易行。
3、本發(fā)明提取、分離速度快，生產(chǎn)周期短，適合工業(yè)化生產(chǎn)，有很好的應(yīng)用前景。4、本發(fā)明采用薄層色譜法鑒別總黃酮，紫外-可見分光光度法直接測定崗松總黃酮含量，方法準(zhǔn)確、簡單，能適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的需要，可有效的控制崗松總黃酮提取物的質(zhì)量。5、通過對崗松總黃酮進(jìn)行研究，建立了一種崗松總黃酮的制備和質(zhì)量控制方法，有利于崗松相關(guān)產(chǎn)品的進(jìn)一步開發(fā)利用，而且對于開發(fā)廣西特色藥材，開發(fā)具有高技術(shù)、高附加值的產(chǎn)品，提高市場競爭能力，將會產(chǎn)生潛在而不可估量的社會效益與經(jīng)濟(jì)效益。目前在國際市場，中藥提取物商品形態(tài)包括以下三類
①純度達(dá)到95%以上，以單一化合物為檢測對象的中藥提取物。②經(jīng)過柱色譜分離、沉淀分離、萃取分離等分離工藝所獲得的部分成分較為集中的多組分中藥提取物，被測組分一般為活性成分，含量在20% - 50%之間。③經(jīng)水或醇提取、未加分離的單一中藥浸膏粉或流浸膏。我國的植物提取物總體上是屬于中間體的產(chǎn)品，目前的用途非常廣泛，主要用于藥品、保健食品、煙草、化妝品的原料或輔料等。用于提取的原料植物的種類也非常多，目前進(jìn)入工業(yè)提取的植物品種在300種以上。我國植物提取物的出口額早在1999年就已超過中成藥的出口額。在歐美國家，植物提取物及其制品(植物藥或食品補(bǔ)充劑)有著廣泛的市場前景，已發(fā)展成一個年銷售額近80億美元的新興產(chǎn)業(yè)。因此，建立了一種崗松總黃酮的制備和質(zhì)量控制方法，使之科學(xué)化、規(guī)范化，增強(qiáng)國際競爭力，為中藥進(jìn)入國際市場創(chuàng)造條件，具有重大的實(shí)際意義和學(xué)術(shù)價值。


圖1是崗松總黃酮的制備工藝流程圖。圖2是崗松總黃酮提取物、蘆丁對照品紫外吸收光譜圖。從圖2看出，崗松總黃酮提取物的紫外光譜在360± I nm處有最大吸收，與蘆丁對照品最大吸收一致，因此選擇以蘆丁為對照品，在360± Inm測定吸光度。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例一
取崗松干燥莖葉IOOOgJp IOL 30%乙醇，加熱回流提取3次，每次I小時，合并提取液，濾過，濾液減壓回收至無乙醇味，加水溶解至3000mL，搖勻，得濃度為O. 33g生藥量/mL的崗松提取液。取已處理好的AB-8大孔吸附樹脂150mL，濕法裝柱，將300mL崗松提取液以
O.5BV/h的上樣流速進(jìn)行吸附，用2BV的水洗脫至洗脫液基本澄清，水洗脫液棄去，用5BV50%乙醇以2BV/h的流速洗脫，收集5BV洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至干，60°C真空干燥，得到崗松總黃酮提取物，測定，計算，總黃酮含量為52. 3%。實(shí)施例二
取崗松干燥莖葉lOOOg，加15L 50%乙醇，加熱回流提取3次，每次2小時，合并提取液，濾過，濾液減壓回收至無乙醇味，加水溶解至2000mL，搖勻，得濃度為O. 5g生藥量/mL崗松提取液。取已處理好的DlOl大孔吸附樹脂IOOmL,濕法裝柱，將400mL崗松提取液以lBV/h的上樣流速進(jìn)行吸附，用2BV的水洗脫至洗脫液基本澄清，水洗脫液棄去，用6BV 70%乙醇以3BV/h的流速洗脫，收集6BV洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至干，60°C真空干燥，得到崗松總黃酮提取物，測定，計算，總黃酮含量為51. 1%。實(shí)施例三
取崗松干燥莖葉lOOOg，加15L 70%乙醇，加熱回流提取3次，每次3小時，合并提取液，濾過，濾液減壓回收至無乙醇味，加水溶解至1250mL，搖勻，得濃度為O. 8 g生藥量/mL崗松提取液。取已處理好的AB-8大孔吸附樹脂IOOmL,濕法裝柱，將500mL崗松提取液以2BV/h的上樣流速進(jìn)行吸附，用2BV的水洗脫至洗脫液基本澄清，水洗脫液棄去，用10BV 50%乙醇以5BV/h的流速洗脫，收集8BV洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至干，60°C真空干燥，得到崗松總黃酮提取物，測定，計算，總黃酮含量為54. 0%。崗松總黃酮的質(zhì)量控制方法
總黃酮的薄層色譜鑒別
取崗松總黃酮提取物約20mg，精密稱定，置IOmL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液。另取蘆丁對照品10mg，加甲醇制成每ImL含Img的溶液，作為對照品溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010版一部附錄W B)試驗(yàn)，取供試品溶液、對照品溶液各10 μ 1，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯一甲酸一水一甲醇(8:1:1:0.4)為展開劑,展開,取出，晾干，噴以I %三氯化鋁試液,在105°C加熱5分鐘，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)?？傸S酮的含量測定 精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每ImL含0.05 mg的對照品溶液。精密量吸取蘆丁對照品溶液l、2、3、5、10mL，分別置IOmL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以甲醇作為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2010版一部附錄V A，)在360nm測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。取崗松總黃酮提取物約10mg，精密稱定，置20mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取lmL，置IOmL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，以甲醇作為空白，在360nm測定吸光度，計算，即得。含量測定方法學(xué)試驗(yàn)如下1、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量取蘆丁對照品溶液l、2、3、5、10mL，分別置IOmL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以甲醇作為空白，照紫外-可見分光光度法(《中國藥典》2010版一部附錄V A，)在360nm測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程 Υ = 0·0281Χ - 0. 0131, r=0. 999 8，表明在 5· 2 — 52. 4 μ g/mL 范圍內(nèi)時，蘆丁線性關(guān)系良好。2、精密度試驗(yàn)取同一供試品溶液，連續(xù)測定5次，結(jié)果RSD為0. 26 %。3、穩(wěn)定性試驗(yàn)取同一供試品溶液，分別在0，30，45、60、90，120 min測定，結(jié)果RSD為0. 39 %，表明供試品溶液在120分鐘內(nèi)穩(wěn)定
4、重復(fù)性試驗(yàn)取同一批樣品制備供試品溶液6份，按擬定方法測定，結(jié)果RSD為2. 41 %。5、回收率試驗(yàn)取已知含量的崗松提取液，分別精密加入蘆丁對照品適量，按擬定方法測定含量，并計算回收率，回收率平均值為97. 8%，RSD為2. 25%。方法學(xué)試驗(yàn)結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、操作簡單，可確保產(chǎn)品的質(zhì)量。崗松提取物毒性小，同時具有抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛等藥理作用，用崗松提取物進(jìn)行毒理學(xué)、藥效學(xué)試驗(yàn)，結(jié)果如下試驗(yàn)動物昆明種小鼠，18 - 22g，雌雄兼用，清潔級，由廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，許可證號SCXK桂2003-0003。1、急性毒性試驗(yàn)
取小鼠預(yù)試驗(yàn)后，另選取18 - 22g小鼠40只，分為2組，雌雄各半。以崗松提取物的最大給藥濃度和最大給藥體積給小鼠灌胃給藥，24小時給藥3次，連續(xù)觀察7天，記錄小鼠活動行為，大小便和飲食情況。結(jié)果未見動物有行為異常、死亡等情況，體重增長正常。2、抗炎作用試驗(yàn)
2.1對巴豆油引起小鼠耳廓腫脹的影響
取昆明種雄性小鼠40只，隨機(jī)分為正常對照組，阿司匹林(O. 2g/kg)組，崗松提取物大、小劑量(10. 36g生藥/kg和5. 18g生藥/kg)組,每天灌胃給藥I次,正常對照組給予等體積蒸餾水，連續(xù)7d。于末次給藥后lh，用量注射器取O. 05ml 2%巴豆油涂于小鼠右耳，待4小時后通過拉頸椎處死小鼠。立即用口徑為6_的打孔器，沿小鼠左右耳廓相同部位打孔取材，然后分別稱重，以兩耳片重量(mg)的差值作為腫脹程度指標(biāo)，求出每只小鼠的平均值，采用T檢驗(yàn)統(tǒng)計學(xué)處理，并求出百分抑制率(％)。結(jié)果見表I。結(jié)果表明，崗松提取物大劑量和小劑量均能顯著抑制巴豆油引起的小鼠耳廓腫脹，提示崗松提取物對早期炎癥具有較強(qiáng)的抑制作用。
權(quán)利要求
1.一種崗松總黃酮的制備方法，其特征在于所述的崗松總黃酮的制備方法包括以下步驟(1)乙醇加熱回流提?、偃徦筛稍锴o葉，粉碎，按重量加10- 15倍量30 - 70%體積濃度的乙醇；②加熱回流提取3次，每次I一 3小時，濾過，合并濾液；③濾液回收乙醇，并濃縮至無乙醇味，加水稀釋至濃度為O.3 — O. 8g生藥量/mL的崗松提取液，待上柱用；(2)大孔吸附樹脂分離純化①選擇大孔吸附樹脂；②吸附上柱崗松提取液濃度為O.3 — O. 8g生藥量/mL，上柱崗松提取液體積為填充大孔吸附樹脂體積的2 — 5倍，上柱流速為O. 5 — 2 BV/h ；③洗脫洗脫劑為50- 70%乙醇，洗脫劑用量為填充大孔吸附樹脂體積的5 - 10倍， 洗脫流速為2 - 5 BV/h ;收集5 — 8倍洗脫液，減壓回收乙醇，濃縮至干，60°C真空干燥，即得崗松總黃酮提取物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的崗松總黃酮的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述的大孔吸附樹脂選擇弱極性的AB-8或DlOl大孔吸附樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的崗松總黃酮的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述的總黃酮的薄層色譜定性鑒別是取崗松總黃酮提取物約20mg，精密稱定，置IOmL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，另取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每ImL含 Img的溶液，作為對照品溶液，照薄層色譜法試驗(yàn)，取供試品溶液、對照品溶液各5 10 μ L， 分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯一甲酸一水一甲醇8:1:1:0. 4為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁試液，在105°C加熱5分鐘，置紫外光燈365nm下檢視，供試品色譜中，在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的崗松總黃酮的質(zhì)量控制方法，其特征在于所述的總黃酮的含量測定包括以下步驟(1)對照品溶液的制備精密稱取蘆丁對照品適量，加甲醇制成每ImL含O.05 mg的溶液，即得；(2)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精密量吸取蘆丁對照品溶液l、2、3、5、10mL，分別置IOmL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以甲醇作為空白，照紫外-可見分光光度法在360土 Inm測定吸光度，以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；(3)測定法取崗松總黃酮提取物約10mg，精密稱定，置20mL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取ImL，置IOmL量瓶中，加甲醇適量使溶解并稀釋至刻度，搖勻，以甲醇作為空白，在360土 Inm測定吸光度，含總黃酮以蘆丁計算，即得；本崗松總黃酮含量以蘆丁計算不得少于50. 0%。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的崗松總黃酮，其特征在于，所述的崗松總黃酮在制備抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛的藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種從植物崗松干燥莖葉經(jīng)提取、濃縮、分離、干燥而制得的總黃酮提取物，本發(fā)明采用薄層色譜法定性鑒別總黃酮，采用紫外-可見分光光度法測定崗松總黃酮含量，方法準(zhǔn)確、穩(wěn)定、操作簡單，能適應(yīng)工業(yè)生產(chǎn)的需要，可有效的控制崗松總黃酮提取物的質(zhì)量。本發(fā)明崗松總黃酮提取物毒性小，具有抗炎、抑菌、鎮(zhèn)痛等藥理作用，制備方法合理、穩(wěn)定、生產(chǎn)周期短，適合工業(yè)化生產(chǎn)。具有良好的開發(fā)前景。
文檔編號A61P31/04GK103040945SQ20131002296
公開日2013年4月17日 申請日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者劉布鳴, 邱宏聰, 黃艷, 林霄, 孫翠 申請人:廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院