專利名稱：樹木源異紫葳新甙ii在防治神經(jīng)退行性疾病上的應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域中樹木天然活性成分異紫葳新甙II在防治神經(jīng)退行性疾病上的應用。
背景技術(shù)：
神經(jīng)退行性疾病(Neurodegenerative disease)是指人體大腦和脊髓的細胞神經(jīng)元發(fā)生退行性變化乃至喪失的疾病狀態(tài)。大腦和脊髄由神經(jīng)元組成，神經(jīng)元有不同的功能，如控制運動，處理感覺信息，并作出決策。大腦和脊髄的細胞一般是不會再生的，所以過度的損害可能是毀滅性的、不可逆轉(zhuǎn)的。神經(jīng)退行性疾病是由神經(jīng)元或其髓鞘的退行及喪失所致，隨著時間的推移而惡化，導致功能障礙。該類疾病主要包括帕金森病(又稱震顫麻痹，Parkinson’ s disease)、阿爾茨海默氏病(又稱老年性癡呆癥,Alzheimer，sdisease)、肌萎縮側(cè)索硬化癥肌(又稱肉萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥，Amyotrophic lateralsclerosis)、Huntington 舞蹈病(Huntington disease)、脊髓肌萎縮癥(Spinal muscularatrophy)、不同類型脊髓小腦共濟失調(diào)(Spinal cerebellar ataxias)、齒狀核紅核蒼白球路易體萎縮癥(Dentatorubral-pallidoluysian atrophy)等(張蕊等 細胞骨架與神經(jīng)退行性疾病.《中國藥理學通報》.2011，第27卷(第8期).1041-1044;石玥，梁曉春.槲皮素防治神經(jīng)退行性疾病的機制研究進展.《中國中西醫(yī)結(jié)合雜志》.2012，第32卷(第10期).1432-1435)。全世界范圍內(nèi)，隨著人口老齡化，神經(jīng)退行性疾病，特別是阿爾茨海默氏病等疾病的發(fā)病率日益增高，已經(jīng)成為全球醫(yī)藥衛(wèi)生界的重大難題之一。長久以來，因為神經(jīng)功能的復雜性，神經(jīng)退行性疾病的預防和治療一直是個難題。近年來，隨著醫(yī)學、藥學等學科日新月異的迅猛發(fā)展，科學界對神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機理的研究有了新的突破，而且各種防治療法和藥物也層出不窮。然而，迄今為止，尚未有任何療法和藥物對神經(jīng)退行性疾病的防治取得滿意效果。因此，探尋行之有效的藥物來減緩、抑制甚至是逆轉(zhuǎn)神經(jīng)細胞的退行病變，以防治神經(jīng)退行性疾病已成為當務(wù)之急(Zuccato, et al. , From Target Identificationto Drug screening Assays lor Neurodegenerative Diseases. 《PharmacologicalResearch)) 2005，第 52 卷(第 3 期)，245-251)。 植物的天然產(chǎn)物中含有多種活性成分，這些活性成分療效突出、毒副作用小或沒有毒副作用，其中的很多活性成分已被開發(fā)成藥物，在臨床上廣泛應用。因此，從植物的天然產(chǎn)物中篩選天然、安全、高效、低毒的預防和治療神經(jīng)退行性疾病的活性成分已經(jīng)成為近年來國內(nèi)外藥物學界、生物學界、化學界等研究的重點課題(Essa，et al.，Neuroprotective Effect of Natural Products Against Alzheimer ' s Disease.((Neurochemical Research)) 2012,第 37 卷(第 9 期)，1829-1842 ；Tavares, et al. , TheNeuroprotective Potential of Phenolic—Enricned Fractions from Four JuniperusSpecies Found in Portugal. ((Food Chemistry》 2012,第 135 卷(第 2 期)，562-570)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種異紫葳新甙II作為預防和治療各種神經(jīng)退行性疾病的藥物的應用。異紫葳新式II (Isocampneoside II)，黃色粉末，分子式為C29H36O16,系統(tǒng)命名為R,S- a -(3,4-aihydroxyphenyl) -ethyl-0- a -L-rhamnopyranosyl (I，，一 3，)_ 旦 _D_(6，_0_caffeoyl)-glucopyr anoside。其熔點為 153_154°C，旋光度[<-39.4。(c，0. 0025，甲醇)，溶于甲醇、こ醇。異紫葳新甙II是ー個差向異構(gòu)體化合物，其化學結(jié)構(gòu)式如圖1所示。異紫葳新式II是玄參科(Scrophulariaceae)泡桐屬(Paulownia)落葉喬木毛泡桐(> 原變種)(Paulownia tomentosa var. tomentosa)、毛泡桐(Paulownia tomentosa)及Paulownia coreana的主要活性成分之一。研究表明，異紫葳新式II具有顯著的抗氧化、抗菌、抗醛糖還原酶(即防治糖尿病并發(fā)癥)活性(司傳領(lǐng)等.泡桐(原變種)果實中抑菌性苯丙素苷成分的研究.《林產(chǎn)化學與エ業(yè)》.2007，第27卷増刊，37-40 ；Kim, et al.1nhibition of Aldose Reauctase by Phenylethanoia glycoside Isolated fromthe Seeds of Paulownia coreana. ((Biological and Pharmaceutical Bulletin〉〉. 2011，第 34 卷 160-163 ;Si，et al. , Activity-guided Screening of the Antioxidants fromPaulownia tomentosa var. tomentosa Bark.《Bioresources》 2013，弟 8 卷(第 I 期)，628-637)。但迄今為止，尚未見異紫葳新甙II単體成分防治任何神經(jīng)退行疾病活性的研究報道。本發(fā)明提出的異紫葳新甙II作為防治各種神經(jīng)退行疾病的藥物組合，該藥物組合物包括活性成分異紫葳新甙II及可藥用的載體。本發(fā)明還提出上述藥物組合物的制備方法，該方法包括異紫葳新甙II和可藥用的載體溶解或混合。


圖1為異紫葳新甙II的化學結(jié)構(gòu)式。圖2為異紫葳新甙II對正常PC12細胞存活率的影響。其中，數(shù)據(jù)皆以均數(shù)土標準差表示(n = 3)，標有相同上標表示差異不顯著(P > 0. 05)，I⑶為異紫葳新甙II的英又 Isocampneoside 的縮與。圖3為異紫葳新甙II對H2O2誘導的PC12細胞存活率的影響。其中，數(shù)據(jù)皆以均數(shù)土標準差表示(n = 3),標有相同上標表示差異不顯著(P > 0. 05), I⑶為異紫葳新式II的英文Isocampneoside的縮寫。圖4為異紫葳新甙II對H2O2誘導的PC12細胞MDA水平的影響。其中，數(shù)據(jù)皆以均數(shù)土標準差表示(n = 3)，標有相同上標表示差異不顯著(P > 0. 05)，I⑶為異紫葳新式II的英文Isocampneoside的縮寫。圖5為異紫葳新甙II對H2O2誘導的PC12細胞SOD活性的影響。其中，數(shù)據(jù)皆以均數(shù)土標準差表示(n = 3)，標有相同上標表示差異不顯著(P > 0. 05)，I⑶為異紫葳新式II的英文Isocampneoside的縮寫。圖6為異紫葳新甙II對H2O2誘導的PC12細胞氧化氫酶活性的影響。其中，數(shù)據(jù)皆以均數(shù)土標準差表示(n = 3)，標有相同上標表示差異不顯著(P > 0. 05)，I⑶為異紫葳新式II的英文Isocampneoside的縮寫。圖7為異紫葳新甙II對H2O2誘導的PC12細胞內(nèi)活性氧積累的影響。其中，數(shù)據(jù)皆以均數(shù)土標準差表示(η = 3)，標有相同上標表示差異不顯著(P > O. 05)，I⑶為異紫葳新式II的英文Isocampneoside的縮寫。圖8為異紫葳新甙II對H2O2誘導PC12細胞凋亡的影響。其中，數(shù)據(jù)皆以均數(shù)土標準差表示(η = 3)，標有相同上標表示差異不顯著(P > O. 05)，I⑶為異紫葳新甙II的英文Isocampneoside的縮寫。圖9為異紫葳新甙II對H2O2誘導的PC12細胞內(nèi)Bcl_2和Bax mRNA表達的影響。其中，數(shù)據(jù)皆以均數(shù)土標準差表示(η = 3)，同顏色圖型標有相同上標表示差異不顯著(P> O. 05), IO)為異紫葳新式II的英文Isocampneoside的縮寫。
具體實施例方式參考下列實施例將更容易、更全面地理解本發(fā)明，給出實施例是為了闡明本發(fā)明，而不是以任何方式限制本發(fā)明。實施例1 :異紫葳新甙II的制備(I)以洗凈、陰干、粉碎至粒度為60目的毛泡桐(原變種)的木質(zhì)部為原料，按質(zhì)量比為1: 4加入體積百分濃度為95%的乙醇水溶液，在40°C以索氏提取4次，每次12h，過濾，濾液減壓濃縮至原體積的5%，得到毛泡桐(原變種)木質(zhì)部粗提物的濃縮液；(2)加入濃縮液質(zhì)量2倍的水，攪拌，加入濃縮液質(zhì)量2倍的正己烷重復萃取3次，分離得正己烷萃取剩余相，向正己烷萃取剩余相加入濃縮液質(zhì)量2倍的二氯甲烷重復萃取3次，分離得二氯甲烷萃取剩余相，向二氯甲烷萃取剩余相加入濃縮液質(zhì)量2倍的正丁醇重復萃取3次，分離得正丁醇萃取相，將正丁醇萃取相減壓濃縮、冷凍干燥，得到毛泡桐(原變種)木質(zhì)部的正丁醇萃取相粉末；(3)取毛泡桐(原變種)木質(zhì)部的正丁醇萃取相粉末進行常壓硅膠柱層析，流動相采用體積比起始濃度為6 I終止?jié)舛葹? I的二氯甲烷丙酮溶液梯度洗脫，得到A、B、C三個流分；對流分B進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析，以體積比為2 I的甲醇水溶液為流動相，得到B1、B2、B3三個流分；分別以體積比為1:1的乙醇正己烷溶液及體積比為1: 3的甲醇水溶液為洗脫液對B2流分連續(xù)進行常壓S印hadex LH-20凝膠柱層析得到異紫葳新甙II。實施例2 異紫葳新甙II對過氧化氫H2O2誘導PC12細胞(大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞)氧化應激損傷的保護作用(1)PC12細胞的培育PC12 細胞在含有 5% FBSUO% HSUOOU/ml 青霉素及 100U/ml 鏈霉素的 RPMI1640培養(yǎng)基中于37°C 5% CO2孵箱中培養(yǎng)。(2)異紫葳新甙II對正常PC12細胞存活率的影響以MTT法測定以不同濃度(0、6.25、12.5、25、50及1001^/1111)異紫葳新甙II處理24h后的PC12細胞的存活率。其結(jié)果如圖2所示，相比于未經(jīng)異紫葳新甙II處理的對比組，各組PC12細胞的相對存活率幾乎為100%，即異紫葳新甙II對H2O2未誘導的正常PC12細胞幾乎沒有毒性影響。(3)異紫葳新甙II對H2O2誘導的PC12細胞存活率的影響以不同濃度(0、6· 25、12· 5、25、50及100μ g/ml)的異紫葳新甙II處理PC12細胞30min，然后用O. 5mM H2O2誘導6h。以MTT法判斷異紫葳新甙II對H2O2誘導PC12細胞損傷的保護活性，其存活率如圖3所示。結(jié)果表明，相比于對比組(未經(jīng)異紫葳新甙II和H2O2處理的PC12細胞組)，用O. 5mM H2O2誘導6h后，PC12細胞存活率下降到41. 03±1. 71 %，而在6. 25，12. 5，25及50 μ g/ml的異紫葳新甙II保護下，PC12細胞存活率分別升高到58. 73±0· 90%, 78. 80±1· 14%,89. 42±3· 25%和 91. 97±6· 41%，SP異紫葳新甙 II 預處理可以拮抗H2O2誘導的PC12細胞的損傷，提高細胞的存活率。(4)異紫葳新甙II對H2O2誘導PC12細胞內(nèi)MDA水平、SOD活性及氧化氫酶活性的影響
將PC12細胞按每孔6 X IO5個細胞接種到6孔培養(yǎng)板上以4ml培養(yǎng)基孵育16h，再以不同濃度(0、6.25、12.5、25及501^/1111)的異紫葳新甙II處理后繼續(xù)培養(yǎng)30min，再以O(shè). 5mM H2O2誘導6h。然后以分光光度法確定PC12細胞的MDA水平、SOD活性和過氧化氫酶活性，試驗結(jié)果如圖4、圖5及圖6所示。結(jié)果表明，異紫葳新甙II能顯著降低H2O2誘導的PC12細胞的MDA水平，可以顯著增加SOD及過氧化氫酶活性，即異紫葳新甙II預處理可以明顯的抑制過氧化氫誘導PC12細胞損傷。(5)異紫葳新甙II對H2O2誘導的PC12細胞內(nèi)活性氧積累的影響將PC12細胞按每孔I X IO5個細胞接種到6孔培養(yǎng)板上以2ml培養(yǎng)基孵育16h，再以不同濃度(O、12. 5及25 μ g/ml)的異紫葳新甙II處理后繼續(xù)培養(yǎng)30min，再以O(shè). 5mM H2O2誘導6h，將細胞破碎后以PBS洗3遍，加入20 μ M DCFH-DA在37°C下避光孵育處理30min。用流式細胞儀進行細胞內(nèi)活性氧的測定，激發(fā)光波長為498nm，檢測波長為522nm。結(jié)果顯示，O. 5mM H2O2誘導6h使細胞內(nèi)ROS水平增加到276. 00±1. 20%，而異紫葳新甙II預處理則可以明顯降低H2O2誘導PC12細胞內(nèi)的ROS的產(chǎn)生，進一步說明異紫葳新甙II預處理對PC12細胞損傷起到了較好的防治作用。(6)異紫葳新甙II對H2O2誘導PC12細胞凋亡的影響用PI單染流式細胞儀分析可直接觀察DNA含量，凋亡細胞DNA熒光強度降低，在正常細胞的G0/G1峰前出現(xiàn)一個小于DNA 二倍體含量的亞二倍體峰，稱為凋亡峰，根據(jù)凋亡峰計算細胞凋亡率。將PC12細胞按每孔I X IO5個細胞接種到6孔培養(yǎng)板上以2ml培養(yǎng)基孵育16h，再以不同濃度(O、12. 5及25 μ g/ml)的異紫葳新甙II處理后繼續(xù)培養(yǎng)30min，再以O(shè). 5mM H2O2誘導6h。結(jié)果顯示，PC12細胞經(jīng)H2O2誘導6h后，凋亡細胞百分率達10. 03±2. 58%，而正常對照組凋亡細胞百分率為O. 67±0. 12%,12. 5和25 μ g/ml異紫葳新甙II預處理30min后再用H2O2誘導6h，則PC12細胞的凋亡百分率分別下降到5. 75±1. 32%和3. 60±O. 65%。這表明異紫葳新甙II能顯著抑制H2O2誘導的PC12細胞凋亡，可對神經(jīng)退行性疾病起到防治作用。(7)異紫葳新甙II對H2O2誘導的PCl2細胞內(nèi)Be 1-2和Bax mRNA表達的影響將PC12細胞按每孔3X IO6個細胞接種到60mm培養(yǎng)皿中以4ml培養(yǎng)基孵育16h，再以不同濃度(O、12. 5及25 μ g/ml)的異紫葳新甙II處理后繼續(xù)培養(yǎng)30min，再以O(shè). 5mMH2O2誘導6h。然后以逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(RT-PCR)檢測Bcl-2及Bax mRNA表達水平。研究結(jié)果顯示，在正常PC12細胞Bcl-2、Bax mRNA呈一定水平表達，用O. 5mM H2O2處理后Bcl-2表達量明顯降低，Bax表達量明顯升高，而異紫葳新甙II預處理PC12細胞的Bcl_2表達量增加，Bax mRNA表達量降低，因而Bcl-2/Bax 二者比值增高，表明異紫葳新甙II對H2O2誘導的PC12細胞凋亡的保護作用是通過在轉(zhuǎn)錄及翻譯水平調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax mRNA的表達實現(xiàn)。實施例3:異紫葳新甙II注射液的制備稱取IOg異紫葳新甙II，順次加入乙醇和丙二醇各1000ml，混合均勻至溶解，力口入氯化鈉500g后再加入注射用水至50000ml，調(diào)節(jié)pH值，攪拌均勻，過濾除菌后分裝，每瓶50ml，灌封，紫外滅菌，得到防治神經(jīng)退行性疾病的異紫葳新甙II注射液。
權(quán)利要求
1.異紫葳新甙II在制備防治神經(jīng)退行性疾病的藥物中的應用，其特征在于所述的異紫葳新甙II用于制備防治神經(jīng)退行性疾病的藥物。
全文摘要
樹木天然活性成分異紫葳新甙II在防治神經(jīng)退行性疾病上的應用。異紫葳新甙II是泡桐屬樹木的主要活性成分之一，其分子式為C29H36O16。實驗證明，異紫葳新甙II對過氧化氫誘導大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤細胞PC12的氧化應激損傷具有保護作用。因此，異紫葳新甙II可作為防治神經(jīng)退行性疾病的藥物，并可與可藥用載體制成各種劑型。
文檔編號A61K31/7032GK103006677SQ20131002175
公開日2013年4月3日 申請日期2013年1月22日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月22日
發(fā)明者司傳領(lǐng), 于國敬, 任曉丹, 徐光輝 申請人:天津科技大學