專(zhuān)利名稱(chēng)：一種具有抗氧化應(yīng)激作用的磷脂復(fù)合物制備方法及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種由原花青素、類(lèi)胡蘿卜素或富含原花青素、類(lèi)胡蘿卜素的提取物與磷脂在脂溶性溶劑中反應(yīng)形成磷脂復(fù)合物。該磷脂復(fù)合物具有顯著的抗氧化應(yīng)激作用。
背景技術(shù)：
原花青素(Proanthocyanidins)是由黃燒-3-醇聚合而成的一類(lèi)多酹物質(zhì)。根據(jù)分子的聚合程度，原花青素可分為單體、寡聚體和多聚體，目前研究最廣的葡萄籽提取物以寡聚體(OPC)為主，通常由兩類(lèi)原花青素單體組成，即兒茶素(catechin)和表兒茶素(epicatechin)。此外松樹(shù)皮、桑葚、山楂、銀杏、沙棘、越橘、藍(lán)莓、蓮房等也含有豐富的原花青素。原花青素具有極強(qiáng)的抗氧化作用，可以抵御自由基對(duì)人體的損傷，具有延緩衰老、美容護(hù)膚、抗輻射、抗視力退化及抗動(dòng)脈硬化和血栓形成的作用，也可以預(yù)防諸如關(guān)節(jié)炎、癌癥、糖尿病和心臟病等多種疾病。類(lèi)胡蘿卜素(carotenoids)是一類(lèi)天然色素的總稱(chēng)，廣泛存在于自然界動(dòng)物、植物、真菌、藻類(lèi)和細(xì)菌中，是包含在很多植物中的一種有色物質(zhì)。到上世紀(jì)末，已發(fā)現(xiàn)類(lèi)胡蘿
卜素有700多種，人體血漿中發(fā)現(xiàn)有20多種。類(lèi)胡蘿卜素是含40個(gè)碳(C)的類(lèi)異戊烯聚合物，即四萜化合物。在植物界有很多化合物的碳架結(jié)構(gòu)是重復(fù)縮合異戊二烯五碳單位而構(gòu)成的。類(lèi)胡蘿卜素是含有八個(gè)異戊二烯單位的四萜化合物，由兩個(gè)二萜(C) “頭對(duì)頭”縮合而成。類(lèi)胡蘿卜素可分3類(lèi):①胡蘿卜素，羥類(lèi)化合物，特點(diǎn)是溶于石油醚。最常見(jiàn)的有蕃茄紅素和α、β、Y-胡蘿卜素葉黃素，亦稱(chēng)胡蘿卜醇，是胡蘿卜素的非酸性氧衍生物。含氧基團(tuán)有羥基、酮基、醚基、環(huán)氧基和呋喃基。常見(jiàn)的有隱黃質(zhì)、新黃質(zhì)、檸黃質(zhì)、玉米黃質(zhì)、葉黃素、辣椒紅素、辣椒玉紅素、蝦青素、蝦紅素、海膽烯酮、蒲公英黃質(zhì)、紫菌紅素丁等；③類(lèi)胡蘿卜素酸，胡蘿卜素的羧酸衍生物，能溶于堿溶液。例如:西紅花酸、胭脂樹(shù)橙和紅酵母紅素等。類(lèi)胡蘿卜素具有顯著的抗氧化作用，其中番茄紅素具有淬滅單線態(tài)氧、清除體內(nèi)自由基、阻斷亞硝胺形成、抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞分化、增強(qiáng)免疫力、減少DNA損傷以及增強(qiáng)細(xì)胞間隙連接通訊等方面的作用。在人體健康及疾病防治等方面發(fā)揮了重要的作用。雖然原花青素和類(lèi)胡蘿卜素具有顯著的抗氧化作用，但是由于生物利用度低，尤其是屬于多酚類(lèi)范疇的花青素類(lèi)物質(zhì)，非常容易與蛋白質(zhì)、多糖等大分子物質(zhì)發(fā)生聚合反應(yīng)，影響了吸收，故能吸收進(jìn)入血液而發(fā)揮作用的比例很小，因而降低了抗氧化作用的發(fā)揮。磷脂是含磷酸根的脂類(lèi)物質(zhì)的總稱(chēng)，包括有大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、磷脂酰膽堿、多稀磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸等，它們廣泛存在于自然界的動(dòng)、植物的種子中，具有來(lái)源廣、無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)。磷脂是生物膜的基本成分，更是大腦細(xì)胞和神經(jīng)系統(tǒng)不可缺少的物質(zhì)，是健腦佳品、血管的“清道夫”和肝臟的保護(hù)神。藥物制劑中常用的磷脂主要是屬于天然磷脂類(lèi)的大豆磷脂和蛋黃磷脂。磷脂分子具有一個(gè)親水性的頭部和兩條疏水長(zhǎng)鏈，由于其兩親性而具有乳化、 分散、助滲、潤(rùn)濕等特性，并與細(xì)胞表面有較強(qiáng)的親和性，在藥劑中用作分散劑、表面活性劑、穩(wěn)定劑、藥物載體等，可作為藥物輔料來(lái)增強(qiáng)藥物活性，降低藥物毒性，提高藥物穩(wěn)定性，使藥物靶向釋放到病灶區(qū)，延長(zhǎng)藥效，利于藥物吸收，提高生物利用度的作用。磷脂復(fù)合物即是以磷脂為載體的一種藥物傳遞系統(tǒng)，從固體制劑角度看來(lái)，磷脂復(fù)合物是一種較為特殊的固體分散體。許多研究發(fā)現(xiàn)，很多類(lèi)型的天然活性成分與磷脂之間具有特殊的親和力，主要認(rèn)為是以氫鍵相結(jié)合，結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜。這類(lèi)磷脂復(fù)合物被命名為Phytosome,不過(guò)國(guó)內(nèi)外仍有很多文獻(xiàn)將其稱(chēng)為固體分散體或Solid dispersion。近年來(lái)許多國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道,磷脂復(fù)合物(phytosomes)的理化性質(zhì)和生物特性較原化合物均有不同程度的改變，具有較強(qiáng)的親脂性。通過(guò)與磷脂復(fù)合而形成載體系統(tǒng)，能改善一些藥物在胃腸道中或經(jīng)皮吸收，可有效地提高天然活性成分的體內(nèi)吸收，可獲得較高的血藥濃度且體內(nèi)消除較慢，使生物利用度顯著提高。關(guān)于天然活性成分磷脂復(fù)合物生物利用度的研究，有水溶性及脂溶性均不佳的燈盞花素、人參皂苷、水飛薊素、甘草酸、銀杏酮酯、黃芪皂苷磷脂復(fù)合物等。經(jīng)文獻(xiàn)檢索，目前尚未見(jiàn)有關(guān)原花青素、類(lèi)胡蘿卜素與磷脂組成復(fù)合物的報(bào)道，更無(wú)原花青素、類(lèi)胡蘿卜素與磷脂反應(yīng)生成磷脂復(fù)合物的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的特征是將原花青素、類(lèi)胡蘿卜素或富含原花青素、類(lèi)胡蘿卜素的提取物與磷脂在脂溶性溶劑中反應(yīng)形成磷脂復(fù)合物，其中原花青素與類(lèi)胡蘿卜素的摩爾比為I: 0.1 10,原花青素和類(lèi)胡蘿卜素之和與磷脂的摩爾比為1: 0.5 3。磷脂復(fù)合物的制備方法包括下述順序的步驟:(I)取花青素和類(lèi)胡蘿卜素溶于脂溶性溶劑中，得澄明液體；(2)加入相當(dāng)于花青素和類(lèi)胡蘿卜素0.5 3倍量的磷脂，接回流裝置，20 70°C攪拌至溶液澄明； (3)40-80°C減壓濃縮，真空干燥至干，粉碎，即得磷脂復(fù)合物。步驟(I)所述原花青素選自葡萄原花青素、松樹(shù)皮原花青素、桑葚原花青素、山楂原花青素、銀杏原花青素、沙棘原花青素、越橘原花青素、藍(lán)莓原花青素和蓮房原花青素。所述類(lèi)胡蘿卜素選自α、β、Y-胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素、番茄紅素、西紅花苷、西紅花酸、桅子黃素、玉米黃素、隱黃質(zhì)、新黃質(zhì)、檸黃質(zhì)、辣椒紅素、辣椒玉紅素、蝦紅素、海膽烯酮、蒲公英黃質(zhì)、紫菌紅素丁、胭脂樹(shù)橙和紅酵母紅素。所述脂溶性溶劑是指丙酮、乙醇、氯仿、甲醇，優(yōu)選無(wú)水乙醇。步驟⑴所述磷脂選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、磷脂酰膽堿、多稀磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸。優(yōu)選大豆卵磷脂、多稀磷脂酰膽堿。取磷脂復(fù)合物適量，溶于乙醇，用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定復(fù)合物的粒徑，結(jié)果磷脂復(fù)合物的粒徑分布范圍為6 600nmo此磷脂復(fù)合物可以制成片劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、粉劑、顆粒劑和口服液后，通過(guò)口服途徑給藥。


圖1為實(shí)施例4各組大鼠第28天血清的MDA含量。NC:正常對(duì)照組；DM:糖尿病組；AO:糖尿病抗氧化組(原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)組)；*與DM組比較，P < 0.05。表明可促使糖尿病鼠體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化MDA水平降低。圖2為實(shí)施例4各組大鼠第28天血清的總抗氧化能力T-AOC。NC:正常對(duì)照組；DM:糖尿病組；A0:糖尿病抗氧化組(原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)組)；*與DM組比較，P < 0.05。表明采用磷脂復(fù)合物干預(yù)可促使糖尿病鼠體內(nèi)總抗氧化T-AOC水平明顯提
高
圖3為實(shí)施例5原花青素葉黃素磷脂復(fù)合物和環(huán)磷酰胺干預(yù)前后小鼠皮下腫瘤重量的變化。NS:空白對(duì)照組；CTX:環(huán)磷酰胺陽(yáng)性對(duì)照組；磷脂復(fù)合物:原花青素葉黃素磷脂復(fù)合物干預(yù)組(AO) 與NS組比較，P < 0.05圖4為實(shí)施例6脂肪肝細(xì)胞加入原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物前后用油紅染色后鏡下觀察脂變細(xì)胞的比例。*表示與FFA組相比ρ < 0.05。圖5為實(shí)施例6原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)前后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)相對(duì)于正常細(xì)胞的TG含量變化。*表示磷脂復(fù)合物組與FFA組相比ρ < 0.05。圖6為實(shí)施例6原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)前后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)相對(duì)于正常細(xì)胞的ROS含量變化。*表示磷脂復(fù)合物組與FFA組相比ρ < 0.05。圖7為實(shí)施例6原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)前后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)相對(duì)于正常細(xì)胞的MDA含量變化。*表示磷脂復(fù)合物組與FFA組相比ρ < 0.05。即與對(duì)照組FFA比較，脂質(zhì)過(guò)氧化MDA指標(biāo)明顯降低。圖8為實(shí)施例6 原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)前后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)相對(duì)于正常細(xì)胞的GSH含量變化。磷脂復(fù)合物組與FFA脂肪肝細(xì)胞對(duì)照組相比GSH抗氧化水平明顯提1 ο ρ〈 0.05。圖9為實(shí)施例6原花青素西紅花酸磷脂復(fù)合物干預(yù)前后脂肪肝細(xì)胞內(nèi)SOD活性變化。*表示磷脂復(fù)合物組與FFA組相比ρ < 0.05。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。這些實(shí)施例應(yīng)理解為僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1取2kg多稀磷脂酰膽堿溶解在40升乙醇中，加入Ikg葡萄籽花青素和Ikgi1-胡蘿卜素，于40°C攪拌溶解至澄清，60°C真空濃縮、真空干燥，粉碎即得。取產(chǎn)品適量，溶于乙醇，用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定復(fù)合物的粒徑，結(jié)果平均粒徑為88nm。實(shí)施例2取2.2kg大豆卵磷脂溶解在44升甲醇中，加入0.6kg松樹(shù)皮提取物和6.0kg玉米黃素，于20°C攪拌溶解至澄清，80°C真空濃縮、真空干燥，粉碎即得。取產(chǎn)品適量，溶于乙醇，用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定復(fù)合物的粒徑，結(jié)果平均粒徑為6nm。實(shí)施例3取2.2kg磷脂酰乙醇胺溶解在66升乙醇中，加入Ikg藍(lán)莓花青素和0.1kg西紅花提取物，于70°C攪拌溶解至澄清，40°C真空濃縮、真空干燥，粉碎即得。取產(chǎn)品適量，溶于乙醇，用激光粒度測(cè)定儀測(cè)定復(fù)合物的粒徑，結(jié)果平均粒徑為600nm。
實(shí)施例4原花青素β -胡蘿卜素磷脂復(fù)合物抗氧化應(yīng)激改善糖尿病研究(I)材料和儀器健康雄性Wistar大鼠(購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)動(dòng)物房)，葡萄籽原花青素β _胡蘿卜素磷脂復(fù)合物(按實(shí)施例1的方法制備得到)。微量血糖儀(穩(wěn)捷II型，Johnson產(chǎn)品)，熒光分光光度計(jì)(HITACHIF-2500)，722s分光光度計(jì)，SN-6930A型液閃儀 與SN-6100型Y計(jì)數(shù)器(上海核所日環(huán)光電公司)(2)方法(a)模型的建立和分組取健康雄性Wistar大鼠40只，體重140_170g之間，隨機(jī)分四4組，每組10只，設(shè)正常對(duì)照組(NC組)、普通糖尿病組(DM組)、和糖尿病抗氧化干預(yù)組(A0組)，普通飼食三天后，DM、AO三組均腹腔注射STZ 50mg/kg, NC組注射劑量相當(dāng)?shù)膒H4.4檸檬酸緩沖液。注射后NC和DM組給予普通飼料及普通飲水，AO抗氧化干預(yù)組給予普通飼料，以及葡萄桿花青素 β_ 胡蘿卜素憐脂復(fù)合物(grape seed proanthocyanidins extract-carotenenanoparticles, GSPE-C) 200mg.kg-1.d_l (使用時(shí)用生理鹽水配成1%的濃度)平均分兩次灌胃治療，其余組每次等量生理鹽水溶液灌胃，在GSPE-C治療期間，全部大鼠都用常規(guī)飼料喂養(yǎng)，自由飲水。(b)血樣及組織標(biāo)本的采集注射STZ后3d、14d、28d空腹采鼠尾部血，用于檢測(cè)血糖、S0D、胰島素；其中28d大鼠麻醉處死后再心臟采血1ml，用于測(cè)血漿MDA及總抗氧化能力(T-AOC)。(C)生化指標(biāo)觀察血糖測(cè)定:取STZ注射后3d、14d、28d的空腹全血檢測(cè)。胰島素測(cè)定:取注射STZ后3d、14d、28d的血清，嚴(yán)格按胰島素放射免疫分析試劑盒操作說(shuō)明測(cè)定胰島素。T-AOC的測(cè)定:用Fe3+還原法測(cè)定T-AOC的含量，嚴(yán)格按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行測(cè)定。SOD的測(cè)定:用黃嘌呤氧化酶生物學(xué)化發(fā)光法測(cè)定血液樣品紅細(xì)胞SOD的活性。MDA的測(cè)定:用硫代戊巴比妥酸熒光法測(cè)定MDA。(d)數(shù)據(jù)分析所有計(jì)量資料均用±s表示，用SPSS10.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。(3)結(jié)果(a)空腹血糖注射STZ后，各試驗(yàn)組與對(duì)照組相比，空腹血糖都呈升高趨勢(shì)(表I)，AO組的血糖28d較14d明顯下降，并顯著低于同時(shí)間點(diǎn)的DM組，表明采用葡萄籽花青素β-胡蘿卜素磷脂復(fù)合物抗氧化干預(yù)對(duì)DM鼠血糖升高具有一定抑制作用。表I各組大鼠空腹血糖(mmol/L)(又土s)
權(quán)利要求
1.一種具有抗氧化應(yīng)激作用的磷脂復(fù)合物制備方法及其應(yīng)用一種由原花青素、類(lèi)胡蘿卜素或富含原花青素、類(lèi)胡蘿卜素的提取物與磷脂反應(yīng)形成的磷脂復(fù)合物。
2.如權(quán)利要求1所述的磷脂復(fù)合物，其特征是所述原花青素與類(lèi)胡蘿卜素的重量比為1: 0.1 10，原花青素和類(lèi)胡蘿卜素之和與磷脂的重量比為1: 0.5 3。
3.如權(quán)利要求3所述的磷脂復(fù)合物，其特征是所述原花青素與類(lèi)胡蘿卜素的重量比為1: 0.5 5，原花青素和類(lèi)胡蘿卜素之和與磷脂的重量比為1: 0.8 1.5。
4.如權(quán)利要求1 3所述的磷脂復(fù)合物，其特征是，所述原花青素選自葡萄原花青素、松樹(shù)皮原花青素、桑葚原花青素、山楂原花青素、銀杏原花青素、沙棘原花青素、越橘原花青素、藍(lán)莓原花青素、蓮房原花青素。
5.如權(quán)利要求1 3的磷脂復(fù)合物，其特征是所述類(lèi)胡蘿卜素選自α、β、Υ_胡蘿卜素、葉黃素、蝦青素、番茄紅素、西紅花苷、西紅花酸、桅子黃素、玉米黃素、隱黃質(zhì)、新黃質(zhì)、檸黃質(zhì)、辣椒紅素、辣椒玉紅素、蝦紅素、海膽烯酮、蒲公英黃質(zhì)、紫菌紅素丁、胭脂樹(shù)橙和紅酵母紅素。
6.如權(quán)利要求1 3的磷脂復(fù)合物，其特征是所述磷脂選自大豆卵磷脂、蛋黃卵磷脂、磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰絲氨酸。
7.如權(quán)利要求1 3的磷脂復(fù)合物，其特征是所述磷脂復(fù)合物的粒徑在6 600nm。
8.如權(quán)利要求1所述復(fù)合物的制備方法，包括下述順序的步驟: (1)取原花青素和類(lèi)胡蘿卜素溶于20 70°C的脂溶性溶劑中，得澄明液體； (2)加入相當(dāng)于原花青素和類(lèi)胡蘿卜素0.5 3倍量的磷脂，接回流裝置，攪拌至溶液澄明； (3)40 80°C減壓濃縮，真空干燥至干，粉碎，即得磷脂復(fù)合物。
9.如權(quán)利要求8所述磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征是，步驟(1)所述脂溶性溶劑是指丙酮、乙醇、氯仿、甲醇。
10.如權(quán)利要求8所述磷脂復(fù)合物的制備方法，其特征是，步驟(1)所述脂溶性溶劑優(yōu)選無(wú)水乙醇。
11.如權(quán)利要求1的磷脂復(fù)合物，其特征是具有顯著的抗氧化應(yīng)激作用，可制備用于預(yù)防或治療氧化應(yīng)激引起的腫瘤、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、脂肪肝和腦梗塞疾病。
12.如權(quán)利要求11的磷脂復(fù)合物，其特征是與醫(yī)藥學(xué)中接受的輔料一起加工成軟膠囊、硬明膠、片劑、顆粒劑、粉劑或口服液。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種由原花青素、類(lèi)胡蘿卜素或富含原花青素、類(lèi)胡蘿卜素的提取物與磷脂在乙醇、丙酮等脂溶性溶劑中反應(yīng)形成的磷脂復(fù)合物。該磷脂復(fù)合物可與醫(yī)藥學(xué)中接受的輔料一起加工成軟膠囊、硬膠囊、片劑、顆粒劑、粉劑或口服液，用于預(yù)防或治療氧化應(yīng)激引起的腫瘤、糖尿病、動(dòng)脈粥樣硬化、心肌梗塞、脂肪肝和腦梗塞疾病。
文檔編號(hào)A61K31/353GK103120798SQ20131000953
公開(kāi)日2013年5月29日 申請(qǐng)日期2013年1月10日 優(yōu)先權(quán)日2013年1月10日
發(fā)明者施冬云, 劉珊林, 謝飛舟 申請(qǐng)人:施冬云, 劉珊林, 謝飛舟