用作免疫抑制劑的、分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及用作治療炎性病變和免疫病變的免疫抑制劑的、分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡。
【專利說明】用作免疫抑制劑的、分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡
[0001]本發(fā)明涉及用作免疫抑制劑的、分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡。特別地，本發(fā)明涉及用作治療炎性和免疫病變的免疫抑制劑的、分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡。
[0002]雖然人們對基質(zhì)間充質(zhì)干細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)特性的興趣和臨床應(yīng)用增加了，但是其效果再現(xiàn)性有爭議并且涉及到的機(jī)制僅僅部分被闡明了。間充質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞(MSC)在體外、動物模型和臨床應(yīng)用中顯示出免疫調(diào)控特性，例如在移植物抗宿主病中(參見Nauta2007, Zhao2010, Caimi2010的論文)。然而，其作用機(jī)制還沒有被完全闡明。特別地，雖然關(guān)于MSC對活化T淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用已有廣泛研究(Krampera，2003)且揭示了多個參與因子，但是關(guān)于MSC對B淋巴細(xì)胞的作用和作用機(jī)制非常有爭議(Corcione2006，Tabera2008, Comol?2008, Traggiai2008, Rasmussen2007)。鑒于有報導(dǎo)稱MSC 與 B 細(xì)胞的相互作用存在種間差異(人與小鼠XRenseneb，2009)，下面僅討論從人細(xì)胞獲得的結(jié)果?？偟膩碚f，MSC-B淋巴細(xì)胞相互作用被認(rèn)為介導(dǎo)可溶因子，并且確實有報導(dǎo)稱這些因子對B淋巴細(xì)胞比對T淋巴細(xì)胞有更重要的作用(Augel1, 2006)。
[0003]如上面報導(dǎo)的，MSC對B淋巴細(xì)胞的作用似乎尚不明確。事實上，既有報導(dǎo)稱MCS對B淋巴細(xì)胞的抗體增殖、分化和生成有抑制作用(Corcione2006，Tabera2008, ComoIi2008)也有報導(dǎo)稱有刺激作用(Traggiai2008，Rasmussen2007)。有趣的是，制得注意的是，在某些情況下，MSC起抗原呈遞細(xì)胞的作用(Chan，2006)，并由此將免疫反應(yīng)放大。這種現(xiàn)象似乎可見于某些特定的環(huán)境條件，例如低水平Y(jié)-干擾素存在下(Chan，2006)。根據(jù)一項關(guān)于MSC與B淋巴細(xì)胞相互作用的研究，根據(jù)用于B細(xì)胞的刺激強(qiáng)度或供體來源，MSC會表現(xiàn)出相反的作用(抑制或刺激)(Rasmussen，2007)。這些相互沖突并且不可預(yù)知的結(jié)果阻礙了 MSC在復(fù)雜自體免疫疾病中的應(yīng)用。
[0004]鑒于上述情況，很顯然需要提供新的治療方法來治療炎性和免疫疾病并克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。
[0005]近期，已發(fā)現(xiàn)免疫細(xì)胞的多種相互作用由微囊泡(MV)或微粒(如很多細(xì)胞表型分泌的膜包被體)介導(dǎo)(Th6ry，2009)。已經(jīng)描述了多種MV種類，大小為50~1000nm或更大，并且根據(jù)其來源的胞內(nèi)隔室而有不同的結(jié)構(gòu)和生化特性。越來越多的實驗證據(jù)顯示:通過蛋白、mRNA和微RNA轉(zhuǎn)運，MV在細(xì)胞間通信中起基礎(chǔ)作用(Valadi，2007 ; Camussi, 2010)。
[0006]已知，MV對多種細(xì)胞表型(如樹突細(xì)胞或T淋巴細(xì)胞)具有免疫反應(yīng)載體的作用。從表達(dá)腫瘤抗原的樹突細(xì)胞中分離的微囊泡已在兩項I期臨床試驗中用于黑素瘤患者和肺癌患者(ESCudier，2005;MOrSe，2005)，用于刺激腫瘤免疫反應(yīng)。這些研究顯示MV對人系統(tǒng)性應(yīng)用是安全的，由此激勵個人患者臨床應(yīng)用的研究。PRobbins等研究了有免疫抑制活性的外來體(exo some)的應(yīng)用(US20060116321)，該項研究從不同的細(xì)胞類型分離外來體，所述細(xì)胞類型包括抗原呈遞細(xì)胞(樹突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)。類似地，已有人提出將來自樹突細(xì)胞的微囊泡用于免疫治療(Lamparsky，US6812023)，例如預(yù)防不希望發(fā)生的自體抗原或移植物抗原引發(fā)的免疫反應(yīng)，或用于降低過度抗原反應(yīng)(Mattews AlbertL,US20020004041)。
[0007]現(xiàn)有技術(shù)還研究了將抗原呈遞細(xì)胞的外來體用作疫苗載體(DelcayreA, US20060222654)或用作抗腫瘤反應(yīng)發(fā)生器(Delcayre A, US7704964)。
[0008]現(xiàn)有技術(shù)研究了來自內(nèi)皮細(xì)胞(優(yōu)選內(nèi)皮祖細(xì)胞)的微囊泡，例如這些微囊泡有望在胰島胰腺內(nèi)皮細(xì)胞移植治療I型糖尿病或2型糖尿病中作為佐劑。佐劑效應(yīng)能使移植的胰島存活并具有功能(Cantaluppi V, US20100233216)。
[0009]再者，有報導(dǎo)稱，當(dāng)所述兩種細(xì)胞的細(xì)胞群由滲透膜分開時，仍會發(fā)生MSC對B淋巴細(xì)胞的抑制作用，這一觀察結(jié)果被認(rèn)為是支持了可溶介體的存在(Corcione, 2006; Augello, 2005)。然而，當(dāng)使用MSC培養(yǎng)物上清液時，沒有發(fā)生所述抑制作用(Corcione, 2006)或僅發(fā)生部分抑制(Augel1, 2005)。因此，目前認(rèn)為:MSC完全抑制需要細(xì)胞間接觸或B淋巴細(xì)胞信號釋放(Corcione，2006)。
[0010]對間充質(zhì)干細(xì)胞而言，已有報道稱:在動物模型中，來自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡(MSC-MV)可能是與給予MSC相關(guān)的抗凋亡和促再生作用的介體(Bruno2009; Herrera, 2009;Cats, 2011)。
[0011]本發(fā)明的發(fā)明人現(xiàn)在發(fā)現(xiàn):分離自干細(xì)胞的微囊泡適合于有效介導(dǎo)對B淋巴細(xì)胞的免疫抑制作用。事實上，本發(fā)明發(fā)明人在間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生微粒中鑒定到了介導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞對B淋巴細(xì)胞抑制作用的特異性介體，也稱為微囊泡(MV)，這些微囊泡最近被認(rèn)作是細(xì)胞間通信的介體。因此，來自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡或外來體能有利地用作免疫抑制劑，特別是用于慢性炎性病變和自體免疫疾病，如I型糖尿病。特別地，已發(fā)現(xiàn):從間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基中獲得的MV對于B淋巴細(xì)胞經(jīng)CpG刺激后的抗體增殖、分化和生成有強(qiáng)烈的劑量依賴性效果。使用熒光標(biāo)記，F(xiàn)ACS和共聚焦顯微分析都顯示MV與CpG刺激的B淋巴細(xì)胞相關(guān)聯(lián)但是不與T淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞和NK細(xì)胞之類其它淋巴細(xì)胞相關(guān)聯(lián)，這一結(jié)果進(jìn)一步支持測得效果具有特異性的觀點。
[0012]這些結(jié)果提示:間充質(zhì)干細(xì)胞產(chǎn)生的MV是間充質(zhì)干細(xì)胞對B淋巴細(xì)胞抑制作用的載體。因此，特定培養(yǎng)條件下MSC產(chǎn)生的MV可代替MSC細(xì)胞本身用于治療，并且在標(biāo)準(zhǔn)化、便于操作、安全性和有效性方面有顯著優(yōu)勢。如免疫球蛋白分泌減少所示，使用MSC和MSC-MV還能抑制B淋巴細(xì)胞的功能。另外，還發(fā)現(xiàn)MSC-MV濃度與B細(xì)胞增殖抑制和分化抑制之間線性相關(guān)。
[0013]為了檢驗觀察到的現(xiàn)象是否是由PBMC中其他細(xì)胞群的相互作用所介導(dǎo)，在如前所述實驗條件下用熒光染料標(biāo)記MSC-MV，用FACS和共聚焦顯微分析檢驗MSC-MV與不同細(xì)胞表型的關(guān)聯(lián)，不同細(xì)胞表型各自用特異性細(xì)胞表面標(biāo)志的熒光抗體標(biāo)記。MSC-MV表現(xiàn)為僅僅與B淋巴細(xì)胞關(guān)聯(lián)，而不與T淋巴細(xì)胞、NK和樹突細(xì)胞關(guān)聯(lián)。這些數(shù)據(jù)提示:MSC對B細(xì)胞的抑制作用很大程度上由MV的釋放來介導(dǎo)，即便或許不是完全由此介導(dǎo)。
[0014]另外，下面報導(dǎo)的實驗數(shù)據(jù)顯示了 MSC-MV的體內(nèi)抗炎性作用。特別地，潰瘍性結(jié)腸炎動物模型獲得的結(jié)果顯示臨床改善和炎癥(flogosis)指數(shù)降低。
[0015]因此，使用MSC-MV代替完整的MSC活細(xì)胞在安全性和便于操作方面提供了一系列有意義的便利。另外，使用MSC-MV提供了生產(chǎn)和臨床應(yīng)用的便利。
[0016]就生產(chǎn)而言的便利有如下這些:
[0017]-MSC-MV能夠在培養(yǎng)基中通過MSC的持續(xù)釋放來生產(chǎn)，并能通過超濾/超速離心來分離。
[0018]-能用生物反應(yīng)器來放大生產(chǎn)，所述生物反應(yīng)器能使大量細(xì)胞適應(yīng)三維結(jié)構(gòu)，并且便于分離連續(xù)的MSC-MV產(chǎn)物流。
[0019]-能通過添加多種物質(zhì)(例如細(xì)胞因子如Y干擾素)從而基于培養(yǎng)基組成或基于可調(diào)的物理條件(如氧氣壓力)來刺激細(xì)胞生產(chǎn)MSC-MV。
[0020]-MSC-MV能通過超濾來從培養(yǎng)基中分離，所述超濾使用截留值為30~IOOkD的過濾器。
[0021]-超濾濃縮之后，MSC-MV能通過1000OOg的超速離心來純化。
[0022]-任選地，可以對分離和純化的MSC-MV而不是活細(xì)胞進(jìn)行輻射滅菌。
[0023]-可以方便地將MSC-MV冷凍在PBS中，可以任選性地添加批準(zhǔn)用于臨床的低溫保護(hù)劑(如DMS0)，并可以在解凍后通過超濾/超速離心來洗滌。至此，所得產(chǎn)物既可使用，即不必像采用細(xì)胞那樣檢驗其活力和功能。
[0024]-所得的產(chǎn)物比活細(xì)胞更容易標(biāo)準(zhǔn)化，這更符合藥品管理和降低成本的要求。
[0025]-MSC-MV能用作效應(yīng)放大分子(如膜聯(lián)蛋白V)的載體(見圖9)
[0026]臨床優(yōu)勢包括:
[0027]-MSC-MV代謝迅速(Gatti，2011)，不會像活細(xì)胞那樣發(fā)生異位定植問題。
[0028]-MSC-MV沒有活細(xì)胞可見的致癌轉(zhuǎn)化風(fēng)險，特別是在體外(Tolar, 2007)。
[0029]-比之MSC，MSC-MV對活化的靶標(biāo)B細(xì)胞(B淋巴細(xì)胞)有更具特異性和再現(xiàn)性的活性。
[0030]-與MSC不同，MSC-MV全身給藥只需輸注很少量的顆粒物質(zhì)，因此，栓塞風(fēng)險更低。
[0031]-MSC-MV重復(fù)給藥，包括短間期的重復(fù)給藥，沒有安全問題，因而利于目標(biāo)效果的實現(xiàn)，使用活細(xì)胞曾被報導(dǎo)有安全問題。
[0032]-MSC-MV比源細(xì)胞更簡單、更穩(wěn)定，并且其效果的再現(xiàn)性和可預(yù)期性更高，相反，移植之后MSC的命運是不確定的。例如，MSC的表現(xiàn)可能因相互作用的環(huán)境不同而不同，我們的實驗數(shù)據(jù)也證實了這一點。相反，環(huán)境條件并不影響MSC-MV對淋巴細(xì)胞的活性。
[0033]-上面報導(dǎo)的所有優(yōu)勢就兒科醫(yī)療而言具有更為重要的意義，這是鑒于倫理原因和更小的體型以及更長的壽命。
[0034]因此，本發(fā)明的特定目標(biāo)之一是提供分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡用于免疫抑制治療。
[0035]術(shù)語“微囊泡”的意義指大小約0.1~I微米的微粒的混合物。
[0036] 特別地，本發(fā)明的微囊泡能用于治療炎性疾病、炎性慢性疾病和自體免疫疾病。所述炎性病變和自體免疫病變，特別是抗體介導(dǎo)的疾病，可以是嚴(yán)重疾病和慢性疾病。用本發(fā)明微囊泡治療的目的是降低炎癥(flogosis)程度、癥狀和相關(guān)并發(fā)癥。慢性炎性疾病的例子包括自體免疫炎性疾病、風(fēng)濕病如結(jié)締組織炎癥和脈管組織炎癥。例如，能用根據(jù)本發(fā)明的MV治療如下疾病:系統(tǒng)性血管炎、結(jié)節(jié)性多動脈炎、巨細(xì)胞動脈炎、韋格納肉芽腫病、亨-舍二氏紫癜、冷球蛋白血癥、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、多數(shù)性單神經(jīng)炎、多發(fā)性大動脈炎(Takayasu's arteritis)、貝切特病、血栓閉塞性脈管炎(Buerger’s disease)、腸慢性炎性疾病如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎、橋本甲狀腺炎、自身免疫性溶血、阿狄森氏病、I型糖尿病、成人遲發(fā)型自體免疫性糖尿病(LADA)、遷延性糖尿病患者接受胰腺或胰島移植后的復(fù)發(fā)性自體免疫性糖尿病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、皮肌炎、硬皮病、舍格倫綜合征、多發(fā)性硬化、慢性自體免疫性肝炎、原發(fā)性膽汁性肝硬化、銀屑病、斑禿、白癜風(fēng)、古德帕斯徹氏綜合征、格-巴二氏綜合征、慢性間質(zhì)性腎炎、濕疹和皮炎、萊特爾綜合征、活動性關(guān)節(jié)炎、囊性纖維化病、鼻竇炎、慢性支氣管炎、牙周病、憩室病/憩室炎。
[0037]另外，本發(fā)明的微囊泡能用于治療和預(yù)防移植排斥。例如，所述微囊泡能用于細(xì)胞、組織和實體器官移植，用于提高供體/受體相容性，降低免疫反應(yīng)并促進(jìn)免疫耐受性形成:移植物抗宿主病、對細(xì)胞和實體器官(移植物)的移植排斥。本發(fā)明的微囊泡還能用于抑制同種/異種細(xì)胞移植或基因治療引起的免疫反應(yīng)。
[0038]本發(fā)明的另一個目標(biāo)是提供包含下列物質(zhì)或由下列物質(zhì)組成的藥物組合物:作為活性成分的分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡，以及一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或佐劑，其中，所述微囊泡任選地與促進(jìn)其免疫抑制活性的分子(例如膜聯(lián)蛋白)結(jié)合。本發(fā)明的藥物組合物的用途如前所述。
[0039]以下，將通過優(yōu)選實施方式并結(jié)合附圖對本發(fā)明進(jìn)行描述，相關(guān)描述不具有限制性意義，其中:
[0040]圖1顯示CPG和MSC刺激的CLM的共培養(yǎng)。1A-1B)密度圖顯示的是CFMDA標(biāo)記的CLM(c)和SCM(MSC/C)共培養(yǎng)之后CLM的細(xì)胞熒光檢測分析結(jié)果，共培養(yǎng)所用SCM的MSC/C比分別為1:20、1:50和1:100。1A):R1門(gate)選擇純CLM培養(yǎng)物(C)和MSC共培養(yǎng)物中的⑶19陽性細(xì)胞。1B):左上象限Ql中顯示純CLM培養(yǎng)物(C)和MSC共培養(yǎng)物中的⑶19/CMFDA陽性細(xì)胞百分比。1C)柱狀圖(左)和折線圖(右)分別顯示純CLM培養(yǎng)物(c)和MSC共培養(yǎng)物中CD19陽性淋巴細(xì)胞(B細(xì)胞)活度的平均值和抑制百分比，所示為采集3次獨立實驗數(shù)據(jù)所得。1D)柱狀圖(左)和折線圖(右)分別顯示純CLM培養(yǎng)物(c)和MSC共培養(yǎng)物中CD19陽性和CMFDA標(biāo)記細(xì)胞增殖的平均值和抑制百分比，所示為采集3次獨立實驗數(shù)據(jù)所得。
[0041]圖2顯示CpG、MSC或MSC-MV刺激的CLM的平行共培養(yǎng)。2A)密度圖顯示CMFDA標(biāo)記的對照組(C) CLM和MSC或MSC-MV共培養(yǎng)CLM的細(xì)胞熒光檢測分析。據(jù)活細(xì)胞(左圖)的形態(tài)學(xué)參數(shù)(FSC-H;SSC-H)選擇Ql門的淋巴細(xì)胞。依次對所述淋巴細(xì)胞進(jìn)行增殖率分析(選擇CD19/CD27陽性，右，上圖)和對漿細(xì)胞(PC)中的分化期分析(選擇CD19/CD27陽性，右，下圖)。2B-2C)柱狀圖分別顯示純CLM培養(yǎng)物(C)和MSC或MSC-MV共培養(yǎng)物中CMFDA/⑶19陽性淋巴細(xì)胞的平均值和增殖抑制百分比。2D-2E)柱狀圖分別顯示純CLM培養(yǎng)物(C)和MSC或MSC-MV共培養(yǎng)物中CD19/CD27陽性漿細(xì)胞(PC)的分化平均值和分化抑制百分比。結(jié)果是3次獨立實驗的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。*p〈0.05
[0042]圖3顯示了在MSC或MSC-MV共培養(yǎng)之后，CpG刺激的CLM中免疫球蛋白產(chǎn)量的抑制。對純CLM培養(yǎng)(C)、MSC共孵育或MSC-MV共孵育的上清液進(jìn)行ELISA試驗。結(jié)果是3次獨立實驗的IgM、IgG或IgA濃度(ng/ml)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差。*p〈0.05
[0043]圖4顯示了 MSC-MV的表征。使用FACSCanto細(xì)胞熒光儀獲得MSC釋放的MV的代表性散點圖。4A)使用0.5-1 μ m標(biāo)定珠來選定MV門。4B)Q4象限中用膜聯(lián)蛋白V、7_AAD和Trucount (Pl)珠來鑒定4A中所示MV門選擇的MSC-MV。
[0044]圖5顯示了 MSC-MV對CLM中B淋巴細(xì)胞的劑量依賴性效果。圖A顯示不稀釋(MV)或者1:3或1:6稀釋的MSC-MV培養(yǎng)之后CpG刺激的CLM的增殖抑制(左圖)和分化抑制(右圖)。觀察到了強(qiáng)烈的抑制效果。 結(jié)果來自4次獨立實驗。
[0045]圖6顯示了在CpG刺激之后選定CLM群攝取經(jīng)PKH26標(biāo)記的MV的FAC分析。6A)在3個不同的門選定的⑶3+、⑶86+淋巴細(xì)胞和雙陰性(Dneg)的密度圖；6B)PKH26標(biāo)記的MSC-MV孵育之前(上圖)或孵育之后(下圖)選定⑶3-FITC、⑶86-APC陽性淋巴細(xì)胞的熒光強(qiáng)度柱狀圖。⑶86陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度較高。6C)在3個不同的門選定的⑶56+、⑶19+淋巴細(xì)胞和雙陰性(Dneg)的密度圖；6D)PKH26標(biāo)記的MSC-MV孵育之前(上圖)或孵育之后(下圖)選定⑶56-FITC、⑶19-APC-Cy7陽性淋巴細(xì)胞的熒光強(qiáng)度柱狀圖。⑶86陽性細(xì)胞的熒光強(qiáng)度較高。
[0046]圖7顯示了 CLM的共焦顯微鏡分析。細(xì)胞用APC偶聯(lián)的抗⑶3、抗⑶19和抗⑶86抗體(綠色偽染色)以及抗-CD56抗體(綠色)染色，細(xì)胞中添加PKH26染色的MSC-MV (紅色)(右圖)或不MSC-MV共孵育(左圖)。MV主要見于CD19陽性細(xì)胞(箭頭)和CD86陽性細(xì)胞(箭號)的胞質(zhì)。細(xì)胞核用赫斯特復(fù)染。放大尺:10μm。
[0047]圖8顯示了對細(xì)胞亞群的Z重建共聚焦顯微分析。對ΡΚΗ26陽性的MSC-MV共孵育淋巴細(xì)胞的顯微照片進(jìn)行激光掃描來進(jìn)行Z重建微照片(a，d)，所述細(xì)胞用抗-CD19(a_c)和抗-CD86 (d-f)抗體染色。從連續(xù)多個光截面獲得的XZ和XY(b-C，e-f)軸的投影圖分別顯示⑶19陽性(C，綠色)和⑶86陽性(f，綠色)細(xì)胞中熒光紅色染料標(biāo)記的MSC-MV的胞內(nèi)定位。細(xì)胞核使用赫斯特染色。放大尺:5ym(a，d)和2ym(b_c，e-f)。圖9中的柱狀圖顯示純PBMC培養(yǎng)物(c)和PBMC與MV共培養(yǎng)物中增殖細(xì)胞和分化細(xì)胞的平均值，所述共培養(yǎng)是用1:3稀釋的MV共培養(yǎng)，或者用1:3稀釋的MV和膜聯(lián)蛋白V (濃度10 μ g~0.1 μ g)的共育物共培養(yǎng)。膜聯(lián)蛋白V以劑量依賴性方式增強(qiáng)MV的抑制效果。
[0048]圖10顯示以下試驗組實驗第六天結(jié)腸組織中的TNF a、IL_1、IL_6和Cox2表達(dá):沒有結(jié)腸炎誘導(dǎo)并僅給予PBS的對照動物(載劑/PBS)、有DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎并僅給予PBS的動物(DSS/PBS)、和有DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎并注射給予分離自干間充質(zhì)細(xì)胞并懸溶于PBS的微囊泡的動物(DSS/MV)。數(shù)值為平均值土SD。*p〈0.05。
[0049]圖11顯示以下試驗組結(jié)腸組織的組織學(xué)分析(蘇木精-伊紅):有DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎并僅給予PBS的小鼠(A)，有DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎并注射給予分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡。治療組小鼠的粘膜和粘膜下層中可見明顯淋巴單核細(xì)胞(I imphomononuc I ear )和組織細(xì)胞組分炎性浸潤。
[0050]實施例1:從間充質(zhì)干細(xì)胞分離微囊泡以及微囊泡對B淋巴細(xì)胞作用的體外研究
[0051]材料和方法
[0052]充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)和擴(kuò)增
[0053]將骨髓來源的人間充質(zhì)干細(xì)胞(購自MSC;瑞士巴塞爾的龍澤公司(Lonza))接種入有通氣塞的75cm2聚苯乙烯培養(yǎng)瓶(美國BD公司(Becton Dickinson)),瓶中含有IOmlMesencult基礎(chǔ)培養(yǎng)基(加拿大不列顛哥倫比亞省溫哥華的干細(xì)胞技術(shù)公司(Stem CellTechnologies))，接種濃度為4X103細(xì)胞/cm3，所述培養(yǎng)基補(bǔ)充有胎牛血清(20%，F(xiàn)BS,?？寺嶒炇夜?Hyclone Laboratories)) > 100U/ml的青霉素和100 μ g/ml的鏈霉素(紐約州格蘭德島的吉布可公司(Gibco))。培養(yǎng)物在37°C、5%C02的濕潤環(huán)境中孵育。然后，細(xì)胞在相同培養(yǎng)基中維持，在80-90%融合時用胰蛋白酶/EDTA溶液(意大利英杰生命技術(shù)公司(Invitrogen, Life Technologies))消化,再以1:2稀釋重新接種。每周更換培養(yǎng)基。
[0054]從外周血分離淋巴單核細(xì)胞
[0055]在羅馬耶穌圣嬰兒童醫(yī)院輸血中心(Centro Trasfusionale OspedalePediatrico Bambino GestO采集來自健康供體的血液樣品。在知情同意后,用50ml肝素化的靜脈血經(jīng)過菲可梯度(美國密蘇里州圣路易斯的西格瑪化學(xué)公司(Sigma Chemical C.)Histopaque)分離外周血細(xì)胞中的單核淋巴細(xì)胞(CLM)，在磷酸鹽緩沖鹽水中洗滌兩次，然后在液氣中低溫儲存。
[0056]來自外周血的淋巴單核細(xì)胞與MSC的共培養(yǎng)
[0057]實驗測定與貼壁MSC共培養(yǎng)的B淋巴細(xì)胞的活力，所述MSC貼壁培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板(意大利米蘭Celbio的康寧克斯公司(Corning-Costar)),培養(yǎng)基為加有20%FBS的基礎(chǔ)Mesencult培養(yǎng)基，起始濃度為2.5xl04、IXlO4或5xl04細(xì)胞/孔。在免疫調(diào)節(jié)試驗中，MSC以更低的濃度(5xl03細(xì)胞/孔)貼壁培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)基為加有20%FBS的基礎(chǔ)Mesencult培養(yǎng)基。第二天，將MSC附著孔中的培養(yǎng)基去除，換以CLM(5xl05/孔，分別對應(yīng)1:20、1:50、1:100MSC/CLM比)。MSC預(yù)先用5-氯甲基熒光素二乙酸酯(CMFDA，分子探針公司(Molecular Probes)的分子追蹤物(Cell Tracker))標(biāo)記,標(biāo)記濃度為0.5 μ Μ,并與MSC在加有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基(比利時洛納(Lona)的BW公司(BioWhittaker))中共培養(yǎng)。用2.5 μ g/ml的CpG人寡脫氧核糖核苷酸(HBT公司(Hycult Biotechnology))孵育來刺激B淋巴細(xì)胞。一周后，培養(yǎng)細(xì)胞在杜爾伯科(Dulbecco)磷酸鹽緩沖鹽水(D-PBS，意大利米蘭的歐洲克隆公司(Euro-Clone))中洗滌，并用FACS (熒光活化細(xì)胞分選分析，F(xiàn)ACSCanto II，BD生物科學(xué)公司)來分析。
[0058]CLM與來自MSC的微囊泡(MSC-MV)共培養(yǎng)
[0059]用90%融合的MSC培養(yǎng)物制備條件培養(yǎng)基(CM)。5天培養(yǎng)之后，從板上回收培養(yǎng)基，通過1000g離心20分鐘除去細(xì)胞碎片，細(xì)胞培養(yǎng)的起始濃度為2xl06/孔。然后，如下所述分離MSC生產(chǎn)的微囊泡(MSC-MV)，加入到5x105CFMDA標(biāo)記的已接受CpG刺激(HBT公司)I小時和24小時的淋巴細(xì)胞中。對某些選定試驗，MSC-MV在RPMI1640培養(yǎng)基(BW公司)中以1:3、1:6稀釋，然后加入到已培養(yǎng)I小時和24小時的經(jīng)標(biāo)記CLM培養(yǎng)物中。2.5 μ g/ml的CpG人寡脫氧核糖核苷酸(開始培養(yǎng)時加入)存在下一周以后，離心回收CLM、洗滌并進(jìn)行FACS分析。
[0060]從培養(yǎng)基中分離微囊泡的具體說明
[0061]微囊泡分離方法是Lamparski等(2002)的改進(jìn)方法
[0062]1.90% 融合的 MSC:n=6T75/cm2 (I lml/ 板)
[0063]2.回收培養(yǎng)基
[0064]3.在1000g離心10分鐘以除去細(xì)胞碎片
[0065]4.從各樣品回收IOml培養(yǎng)基
[0066]5.用4ml30kDa過濾器(密理博公司(Millipore))來濃縮培養(yǎng)基
[0067]6.回收濃縮的培養(yǎng)基(各個過濾器約50 μ I)，在超速離心管中稀釋于PBSlOml
[0068]7.在4°C 1000OOg超速離心I小時
[0069]8.回收MSC-MV沉淀并在PBSlOml中稀釋
[0070]9.用4ml30kDa過濾器(密理博公司)來濃縮MSC-MV溶液
[0071]10.回收約15-20 μ I的選定樣品(MSC-MV)
[0072]為了從MSC分離微囊泡，在異質(zhì)同晶聚合物管(意大利米蘭的貝克曼庫爾特公司(Beckman Coulter))中，將前文所述過程獲得的條件培養(yǎng)基稀釋于10ml PBS，然后在4°C 1000OOg超速離心I小時。在過程結(jié)束時，從管底收集了 2ml超速離心的培養(yǎng)基，稀釋于 IOml 的 PBS,在 30kDa MWCO 亞米康(Amicon)超速離心(Ultra Centrifugal)無菌過濾器(密理博公司)中2000g離心濃縮20-30分鐘，達(dá)到15-20 μ I終體積。
[0073]免疫球蛋白產(chǎn)量測評
[0074]經(jīng)CFMDA標(biāo)記的CLM在96孔板中、在加有FBS10%(?？寺」?的RPMI1640 (Bff公司)培養(yǎng)基中與MSC(1:100比率)或MSC-MV共培養(yǎng)。一周后，孔板以300g離心5分鐘，回收上清液，進(jìn)行ELISA試驗(酶聯(lián)免疫吸附試驗)。為了測評免疫球蛋白產(chǎn)量，針對PBS稀釋的人 IgA、IgG 或 IgMdgAlO μ g/ml, IgG15 μ g/ml, IgM2, 5 μ g/ml,賓夕法尼亞州維斯格魯甫的杰克遜免疫研究實驗室公司(Jackson ImmunoResearch Laboratories))的純化羊免疫球蛋白通過4°C過夜孵育附著到ELISA96孔板(康寧公司)的表面上。在3次0.1%PBS/吐溫洗滌之后，將細(xì)胞培養(yǎng)上清液加到板上(50μ I/孔)，37°C濕潤環(huán)境下孵育I小時。洗滌之后，孔板在37。。與PBS稀釋的針對人IgA(1:1000)、人IgG(1:2000)或人IgM(l: 1000)的過氧化物酶偶聯(lián)抗體(杰克遜免疫研究實驗室公司)(50 μ I)孵育I小時。加入PBS稀釋的鄰苯二胺(o-phenylendiamine)片劑(西格瑪-艾爾德里奇公司)作為發(fā)色底物。30分鐘后加入10%十二烷基硫酸鈉(50μ1/孔)中斷反應(yīng)。最后，用分光光度計(微孔板分光光度計Benchmark Plus)在4600D讀板。[0075]細(xì)胞熒光測定分析
[0076]在共培養(yǎng)最后，從培養(yǎng)板中回收CLM，300g離心5分鐘，并在PBS/FBS (2%)中重懸。單細(xì)胞懸液與針對下列人表面分子的直接偶聯(lián)單克隆抗體在4°C暗孵育20分鐘:CD19(1:7，Cy5 偶聯(lián))、CD27[1:7，藻紅蛋白(PE)偶聯(lián)]、CD38 (1:30，PE_Cy7 偶聯(lián))、IgMd: 100, Cy5 偶聯(lián))、CD86 (1: 5，APC 偶聯(lián))、CD3[1:7，熒光素(FITC)偶聯(lián)]、CD56(1:7，F(xiàn)ITC偶聯(lián))、CD19[1:20別藻藍(lán)素-Cy7(APC)偶聯(lián)]。所有抗體來自BD公司(Becton Dickinson)(美國新澤西州富蘭克林湖市的BD)?？贵w結(jié)合之后，細(xì)胞用2%PBS/BSA洗滌兩次，并用FACSCanto II (BD)獲得數(shù)據(jù)。用細(xì)胞搜索軟件(Cell Quest Software)(BD)分析細(xì)胞熒光檢測概況。每一個試驗記錄至少20，000個事件。
[0077]為了表征MSC-MV，每個試驗中，如上所述從含有2x106MSC的上清液中獲得MSC-MV，所得MSC-MV與5 μ I人表面分子單克隆抗體、APC偶聯(lián)的膜聯(lián)蛋白V(BD)與7-氨基-放線菌素活體染料[7-AAD，與多甲藻黃素-葉綠素-蛋白(PerCP)BD復(fù)合物偶聯(lián)]的組合(complex)共孵育，所述孵育根據(jù)試劑盒說明書，在500 μ I終體積的膜聯(lián)蛋白Vlx結(jié)合緩沖液(BBlx)中進(jìn)行。這種組合能夠特異性鑒定來自非凋亡MSC的MSC-MV。在室溫暗孵育15分鐘后，將MSC-MV樣品轉(zhuǎn)移到含微珠的Tixnicount (BD)管中以標(biāo)化尺寸。使用所述微珠基于形態(tài)學(xué)參數(shù)來設(shè)定MSC-MV門(前向散射，F(xiàn)SC-H ;側(cè)向散射，SSC-H)。
[0078]CLM 的 MSC-MV 攝取
[0079]根據(jù)生產(chǎn)商說明書，從2X106MSC(見上)的培養(yǎng)基中分離MV，并用2.5xl0_6(美國圣路易斯的西格瑪公司)濃度的PKH26染料標(biāo)記。經(jīng)標(biāo)記的MV與CLM(5X105細(xì)胞/孔)在加有10%FBS的RPMI中孵育。在37°C、5%C02的濕潤環(huán)境中孵育I小時之后，細(xì)胞群用PBS洗滌，并分成2份，一份用細(xì)胞熒光儀分析，另一份用共聚焦顯微鏡分析。
[0080]免疫熒光分析
[0081]CLM與經(jīng)PKH26標(biāo)記的MV孵育，用PBS洗滌，在4%甲醛中固定，與5%PBS/FBS孵育30分鐘，并用下列單克隆抗體單獨染色=APC(BD)偶聯(lián)的抗_CD86(1:10)、抗-CD3(1:10)和抗-CD19 (1:10)以及FITC偶聯(lián)的(1: 30)抗-CD56 (BD)。所有的抗體都在1%PBS/BSA中稀釋，并孵育I小時。使用沒有MV孵育的CLM樣品，或在染色中不使用一抗的CLM樣品來制備陰性對照。
[0082]細(xì)胞核用赫斯特333421 μ g/ml (英杰公司，美國俄勒岡州的分子探針公司(Molecular Probes))復(fù)染。用PBS洗漆之后，樣品用延長抗衰減(Pro-long Ant1-Fade)(英杰公司)試劑進(jìn)行封固。
[0083]共聚焦顯微觀察和圖像分析
[0084]共聚焦分析使用奧林巴斯Fluoview FV1000共焦顯微鏡，該顯微鏡包含2.0版FV10-ASW, Multi Ar (458-488 和 515nm)軟件，配有二極管激光器 2X He/Ne (543 和 633nm)和60x (I, 35NA油鏡)405透鏡。1024X1024像素掃描獲取各光學(xué)切片，207nm/像素大小，40微秒/像素的取樣速度和12位(bit)/像素。通過多通道圖像的自動順序獲取來避免熒光團(tuán)混合，從而降低通道光譜干擾?！樋住_口是IAir單位。
[0085]單個系列光學(xué)切片的Z重建參數(shù)如下:1024xl024像素掃描模式，對應(yīng)103nm/像素的2倍電子放大、有20 μ s/像素的取樣速度和0.40微秒/切片的Z間距。使用Photoshop9, O版(加利福尼亞州的Adobe系統(tǒng)公司)來處理圖像。
[0086]統(tǒng)計學(xué)分析
[0087]對數(shù)據(jù)進(jìn)行平均值、最大值和最小值等定量分析。進(jìn)行方差的非參數(shù)分析(克-瓦二氏檢驗)以便進(jìn)行各組定量數(shù)據(jù)比較；進(jìn)行曼-惠特尼U檢驗，作為方差分析后的檢驗。認(rèn)為P〈0.05是統(tǒng)計學(xué)顯著的。使用GraphPad軟件(GraphPad Prism, Release3.03,加利福尼亞州拉霍亞的Avenida de la Playa)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
[0088]結(jié)果
[0089]CLM與MSC共培養(yǎng)
[0090]對B細(xì)胞活力的作用
[0091]首先研究了與MSC的共培養(yǎng)對CpG刺激的B淋巴細(xì)胞活力的作用。將MSC與經(jīng)CMFDA標(biāo)記的CLM(C)共培養(yǎng)，MSC采自7個健康供體。在7天孵育之后，通過細(xì)胞熒光檢測分析來檢測經(jīng)標(biāo)記的CLM總樣品中的CD19陽性細(xì)胞。在MSC/C1:20觀察到對B細(xì)胞活力的最大抑制(圖1A);在1:50和1:100稀釋被證明同樣有抑制作用(圖1A、1B)。
[0092]對B細(xì)胞增殖的作用
[0093]進(jìn)一步測定了 MSC共培養(yǎng)對B細(xì)胞增殖的作用。在上述實驗條件下7天之后，通過細(xì)胞熒光檢測分析來選定⑶19/CMFDA雙標(biāo)記門。從圖1C可見，在MSC/C1:20比率獲得了對B細(xì)胞增殖的最大抑制。另外，MSC/C1:50和1:100被證明同樣有抑制作用，1:100比率的效果較弱。圖1D的Ql象限顯示了增殖B淋巴細(xì)胞(⑶19陽性和CFMDA標(biāo)記)相對于淋巴細(xì)胞總數(shù)的百分比；MSC/C1:100已將所述增殖高度抑制(90.3%)。因此，在后續(xù)共培養(yǎng)實驗中全部使用這個比率。
[0094]CLM與MSC或MSC-MV共培養(yǎng)平行試驗
[0095]在平行實驗中，研究了與MSC或MSC-MV共培養(yǎng)對B淋巴細(xì)胞增殖和分化的作用。為此，在實驗開始I小時和24小時后，將MSC-MV加入到CLM中。平行培養(yǎng)中，CLM與MSC在相同的1:100比率共培養(yǎng)。在存在MSC和存在MSC-MV兩種情況下都觀察到了具有統(tǒng)計學(xué)意義的B細(xì)胞增殖抑制(圖2A)。在MSC存在和MSC-MV存在兩種情況下，獲得了相似的抑制百分比，分別為70%和60%(圖2B)。在這些平行實驗中，還研究了漿細(xì)胞分化。通過CD19和CD27的雙染色來鑒定漿細(xì)胞系(PC)。在MSC存在和MSC-MV存在兩種情況下都觀察到具有統(tǒng)計學(xué)意義的抑制，分別為98%和100%。和MSC —樣，MSC-MV也抑制IgM、IgG和IgA的生成(圖3)。
[0096] 另外，還對上述細(xì)胞培養(yǎng)物中的免疫球蛋白生產(chǎn)進(jìn)行了測定。7天之后，回收上清液進(jìn)行ELISA分析。如圖3所示，MSC和MSC-MV都抑制IgM、IgG和IgA的生成。
[0097]MSC-MV 的表征
[0098]已經(jīng)證實了我們的方法能分離得到純MSC-MV，還通過細(xì)胞熒光檢測分析進(jìn)行了定量檢測。根據(jù)DNA7-AAD標(biāo)記陰性將MSC-MV群區(qū)別于凋亡細(xì)胞片段，并且MSC-MV群顯示膜聯(lián)蛋白V陽性(圖4)。
[0099]MSC-MV對B淋巴細(xì)胞的劑量依賴性效果
[0100]圖5顯示了 MSC-MV對B淋巴細(xì)胞的增殖和分化有劑量依賴性效果。分化抑制強(qiáng)于增殖抑制。
[0101 ] CLM 對 MSC-MV 的攝取
[0102]CLM與經(jīng)PKH26標(biāo)記的MSC-MV預(yù)孵育后進(jìn)行細(xì)胞熒光檢測分析，分析顯示，所述的攝取選擇性地可見于CD86陽性細(xì)胞亞群和其中的CD19陽性細(xì)胞，這些細(xì)胞對應(yīng)B淋巴細(xì)胞。對應(yīng)⑶3陽性細(xì)胞的T淋巴細(xì)胞顯示陰性。對應(yīng)⑶56陽性細(xì)胞的NK細(xì)胞也顯示陰性(圖 6)。
[0103]使用激光共聚焦顯微鏡對預(yù)先與PKH26標(biāo)記的MSC-MV共孵育或不與其共孵育的CLM進(jìn)行免疫熒光分析，用于測評MSC-MV與特異細(xì)胞類型的相互作用(圖7)。使用針對⑶3、⑶19、⑶56和⑶86分子的熒光素偶聯(lián)抗體組，抗體的共定位再度顯示MSC-MV與⑶19和⑶86陽性細(xì)胞發(fā)生關(guān)聯(lián)，而⑶19和⑶56陽性細(xì)胞則沒有檢測到關(guān)聯(lián)(圖7)。PKH26標(biāo)記的染紅MSC-MV的定位分析是基于⑶19和⑶86陽性細(xì)胞單個系列光學(xué)切片的Z重建來進(jìn)行(圖8)。XZ軸和YZ軸投影來測得的MSC-MV橫向和軸向分布顯示⑶19和⑶86陽性細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的胞內(nèi)定位(圖8)。
[0104]實施例2:MV與膜聯(lián)蛋白V結(jié)合增強(qiáng)對B淋巴細(xì)胞的抑制效果
[0105]膜聯(lián)蛋白V結(jié)合細(xì)胞膜上外露的磷脂酰絲氨酸，并改變該細(xì)胞的免疫反應(yīng)(Munoz, 2007)。在這個實驗中，將如前所述獲得的MVl: 3稀釋，根據(jù)生產(chǎn)商說明書，與純化的重組膜聯(lián)蛋白V在室溫(BD公司，濃度范圍10 μ g~0.1 μ g)、在100 μ I終體積的膜聯(lián)蛋白V結(jié)合緩沖液(BBBlx)中孵育15分鐘。然后，MV用PBS通過超速離心洗滌，并與CFMDA標(biāo)記的CpG刺激的PBMC共培養(yǎng)。7天后，對培養(yǎng)物進(jìn)行細(xì)胞熒光儀檢測以測定B淋巴細(xì)胞增殖和分化。添加膜聯(lián)蛋白V以劑量依賴性方式顯著增強(qiáng)MV對活化的B淋巴細(xì)胞的抑制作用。該策略可用于增強(qiáng)MV的免疫調(diào)節(jié)作用。
[0106]實施例3:用來自間充質(zhì)干基質(zhì)細(xì)胞的微囊泡(MSC-MVS)來治療實驗性潰瘍性結(jié)腸炎
[0107]本實驗在慢性炎性腸道疾病實驗?zāi)Ｐ椭袦y評MSC-MV抑制作用的治療意義。
[0108]動物模型
[0109]在雌性8周齡B57BL/6J小鼠中進(jìn)行實驗。如下誘導(dǎo)結(jié)腸炎:給予溶于飲用水的3%十二烷基硫酸鈉(DSS)，自由進(jìn)食，為期5天。這是一個成熟且廣泛使用的動物模型，在PubMed中被引用數(shù)百次(參見Kawada等，2007)。對所有的動物的處理都符合拉奎拉大學(xué)的倫理規(guī)范，其中，實驗期間自由采食水和食物，且保持12小時暗/光周期。將動物分成三個實驗組。
[0110]?第I組(n=4，正常對照):從第I天至第5天每日腹膜內(nèi)(ip)注射PBS(純載劑)0.2ml ；
[0111]?第2組(n=5，結(jié)腸炎誘導(dǎo)):飲用水中加有3%DSS，其余同第I組。
[0112]?第3組(n=4，結(jié)腸炎誘導(dǎo)并用微囊泡治療):通過IP給予懸浮于0.2ml PBS的MSC-MV，其余同第2組。
[0113]在第6天，使用CO2處死動物。切下結(jié)腸，將一部分組織用福爾馬林中固定以用于后續(xù)組織學(xué)分析，另一部分立即在液氮中冷凍并存儲在_80°C以用于后續(xù)提取RNA。
[0114]MSC-MV的劑量和給藥途徑
[0115]如前所述，從24小時培養(yǎng)的2x106MSC制備MSC-MV，給予動物模型。
[0116]給藥途徑:從第O天至第5天，通過腹膜內(nèi)方式每天給予懸浮于0.2ml PBS的MSC-MV。
[0117]小腸損傷測評
[0118]動物體重
[0119]疾病活動指數(shù)(糞檢；見Tanaka F，2008)
[0120].炎癥(flogosis)的組織病理學(xué)特征
[0121]?通過RT-PCR測定結(jié)腸組織提取物中炎癥介體表達(dá)的效價:TNFa、IL6、IL_1 β和Cox20
[0122]結(jié)果的統(tǒng)計學(xué)分析
[0123]數(shù)據(jù)表示為平均值土SD。通過t檢驗來分析組間差異，p〈0.05表示顯著。
[0124]結(jié)果
[0125]接受處理的所有動物都存活。對照動物(第I組)在一周中體重逐漸增加，經(jīng)DSS處理的動物從第四天開始顯示體重降低(表1)。體重降低被發(fā)現(xiàn)與液態(tài)稀便且含血相關(guān)，同時，結(jié)腸炎活動指數(shù)升高(表1)。給予DSS并且每天腹膜內(nèi)注射給予MSC-MV的動物中，體重降幅和結(jié)腸炎活動指數(shù)都顯著較低。給予DSS的動物中水?dāng)z取減少，且這種減少具有統(tǒng)計學(xué)意義，但接受和不接受MSC-MV兩個實驗組之間則未見具有統(tǒng)計學(xué)意義的區(qū)別(表I)。
[0126]表1顯示以下動物組實驗第六天的體重、疾病活動指數(shù)和水?dāng)z取:未經(jīng)結(jié)腸炎誘導(dǎo)并僅給予PBS的對照動物(載劑/PBS)，經(jīng)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎并僅給予PBS的動物(DSS/PBS)和經(jīng)DSS誘導(dǎo)結(jié)腸炎并注射給予微囊泡(所述微囊泡從間充質(zhì)干細(xì)胞分離并懸溶于PBS)的動物(MV/DSS)。
[0127]根據(jù)下面標(biāo)準(zhǔn)來評價疾病活動指數(shù)(糞檢評分):
[0128] 正常/半固體糞便=1 ;半固體含血糞便=2 ;含血液態(tài)稀便=3
[0129]表1
[0130]
【權(quán)利要求】
1.用于免疫抑制治療的分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡。
2.如權(quán)利要求1所述分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡，所述微囊泡用于治療急性炎性疾病和慢性炎性疾病以及自體免疫疾病。
3.如權(quán)利要求1所述分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡，所述微囊泡用于治療和預(yù)防移植排斥。
4.如權(quán)利要求1所述分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡，所述微囊泡用于治療和預(yù)防移植物抗宿主病。
5.如權(quán)利要求1所述分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡，所述微囊泡用于抑制同種/異種細(xì)胞移植或基因治療引起的免疫反應(yīng)。
6.一種藥物組合物，所述藥物組合物包含下列物質(zhì)或由下列物質(zhì)組成:作為主要活性組分的分離自間充質(zhì)干細(xì)胞的微囊泡和一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑和/或佐劑，其中，所述微囊泡任選地與膜聯(lián)蛋白結(jié)合。
7.如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，所述藥物組合物用于免疫抑制治療。
8.如權(quán)利要求7所述用于免疫抑制治療的如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，所述藥物組合物用于治療急性炎性疾病和慢性炎性疾病以及自體免疫疾病。
9.如權(quán)利要求7所述用于免疫抑制治療的如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，所述藥物組合物用于治療和預(yù)防移植排斥。
10.如權(quán)利要求7所述用于免疫抑制治療的如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，所述藥物組合物用于治療和預(yù)防移植物抗宿主病。
11.如權(quán)利要求7所述用于免疫抑制治療的如權(quán)利要求6所述的藥物組合物，所述藥物組合物用于抑制同種/異種細(xì)胞移植或基因治療引起的免疫反應(yīng)。
【文檔編號】A61K35/28GK103917275SQ201280037526
【公開日】2014年7月9日 申請日期:2012年7月26日 優(yōu)先權(quán)日:2011年7月28日
【發(fā)明者】M·穆拉卡, A·費拉布拉奇 申請人:耶穌圣嬰兒童醫(yī)院