用于治療和預(yù)防水生動(dòng)物中的感染的芽孢桿菌屬細(xì)菌的制作方法
【專利摘要】本文中公開(kāi)了包含芽孢桿菌屬產(chǎn)孢菌株的殺微生物組合物。所述組合物可用于治療或預(yù)防水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)或甲殼類動(dòng)物的疾病。
【專利說(shuō)明】用于治療和預(yù)防水生動(dòng)物中的感染的芽孢桿菌屬細(xì)菌
[0001]背景
[0002]本發(fā)明的領(lǐng)域涉及用于治療或預(yù)防水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)的疾病的組合物和方法。具體地，本發(fā)明涉及包含或利用芽孢桿菌屬(Bacillus)的產(chǎn)孢菌株的組合物和方法，其用于治療或預(yù)防水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)的疾病例如腸敗血癥。
[0003]最近，注意力已集中在益生菌用于改善動(dòng)物的健康和營(yíng)養(yǎng)的用途。益生菌在水產(chǎn)業(yè)應(yīng)用中的益處遵循它們?cè)谌祟愥t(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)中的用途(Fuller和Turvey，1971; Roach和 Tannock, 1980; Fuller, 1987; Smoragiewicz 等人，1993; Fuller, 1997)，其中通常將微生物作為飼料的活補(bǔ)充劑來(lái)施用(Fuller，1997)。已報(bào)導(dǎo)，對(duì)宿主的有益作用是營(yíng)養(yǎng)性的、免疫性的和/或參與籍以在消化道中戰(zhàn)勝潛在病原體的競(jìng)爭(zhēng)性排斥(Smoragiewicz等人，1993)。已顯示益生菌可有效控制水產(chǎn)業(yè)的各種感染性疾病，包括由殺鮭氣單胞菌(A.salmonicida)在虹鱒魚(yú)中引起的市病(Irianto和Austin, 2002)、由寄生水霉(Saprolegnia parasitica)在澳洲獲鱺(Anguilla australis)中引起的水霉病(Lategan等人,2004)、由遲鈍愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)在歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla)中引起的愛(ài)德華氏菌病(Chang和Liu, 2002)、分別由格氏乳球菌(Lactococcus garvieae)和海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)在虹鱒魚(yú)中引起的乳球菌病和鏈球菌病(Brunt和 Austin, 2005),以及由獲弧菌(Vibrio anguillarum)在大西洋鍾魚(yú)(Atlantic codfry)中引起的疾病(Gildberg和Mikkelsen，1998)。用于益生菌的細(xì)菌包括腸球菌屬的種(Enterococcus spp.)、氣單胞菌屬的種(Aeromonas spp.)、弧菌屬的種(Vibriospp.)和乳酸菌(Gildberg 和 Mikkelsen, 1998 ；Chang 和 Liu, 2002; Irianto 和 Austin,2002; Lategan等人，2004; Brunt和Austin, 2005)。大多數(shù)益生菌從水產(chǎn)業(yè)動(dòng)物的腸分離而來(lái)(Gildberg 和 Mikkelsen,1998;Irianto 和 Austin,2002;Lategan 等人，2004;Brunt 和Austin, 2005)。從水產(chǎn)業(yè)動(dòng)物的棲息地分離的一些細(xì)菌也顯示益生菌活性(Rengpipat等人，1998)?？固囟ú≡w的抗微生物活性用作選擇潛在益生菌細(xì)菌的基本標(biāo)準(zhǔn)(Rengpipat等人，1998; Irianto和Austin, 2002)。本研究中使用的細(xì)菌菌株的集合來(lái)源于用于植物疾病的生物防治和它們的植物生長(zhǎng)促進(jìn)能力的土壤細(xì)菌的先前研究(Klo印per等人，2004)，以及本研究中鑒定的來(lái)源于鯰魚(yú)腸樣品的細(xì)菌培養(yǎng)物。
[0004]概述
[0005]公開(kāi)了殺死細(xì)菌或抑制其生長(zhǎng)的殺微生物組合物。組合物可殺死病原性細(xì)菌例如與腸敗血癥相關(guān)的細(xì)菌或抑制其生長(zhǎng)。組合物包含有效量的用于殺死細(xì)菌例如與腸敗血癥相關(guān)的細(xì)菌或抑制其生長(zhǎng)的芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株(spore-forming strain)。在一些實(shí)施方案中，將公開(kāi)的組合物配制為用于水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如蝦)的飼料組合物。在其它實(shí)施方案中，公開(kāi)的組合物可被配制用于給其中水生動(dòng)物生活或飼養(yǎng)水生動(dòng)物的環(huán)境施用。
[0006]優(yōu)選，組合物包含濃度為至少約104CFU/g飼料或/ml水的芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株。更優(yōu)選，芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株以至少約105CFU/g飼料或/ml水的濃度存在于組合物中。更優(yōu)選，芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株以至少約106CFU/g飼料或/ml水或至少約107CFU/g飼料或/ml水的濃度存在于組合物中。適當(dāng)?shù)臐舛确秶砂?04-107CFU/g飼料或/ml水或其中的子范圍。
[0007]組合物可包含芽孢桿菌屬的單個(gè)菌株?；蛘?，組合物可包含芽孢桿菌屬的菌株的混合物。
[0008]組合物通常包含有效量的殺死一種或多種病原微生物或抑制其生長(zhǎng)的芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株。例如病原性細(xì)菌可選自嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila)、鮰愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella ictaluri)、遲純愛(ài)德華氏菌(Edwardsiella tarda)、柱狀黃桿菌(Flavobacterium columnare)、海豚鏈球菌(Streptococcus iniae)和魯氏耶爾森氏菌(Yersinia ruckeri)。病原性真菌可包括卵菌綱(oomycete)真菌水霉屬(Saprolegnia)。
[0009]公開(kāi)的組合物包含芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株。組合物可包含用于殺死病原微生物或阻止其生長(zhǎng)的其它試劑。在一些實(shí)施方案中，組合物還包含感染鮰愛(ài)德華氏菌(E.1ctaluri)的噬菌體(例如，OeiAU)。公開(kāi)的組合物可包含抗生素試劑例如磺胺地托辛，奧美普林和/或氟苯尼考(florfenical)。公開(kāi)的組合物還可包含減毒的微生物作為疫苗試劑(例如，鮰愛(ài)德華氏菌的減毒菌株)。
[0010]還公開(kāi)了用于治療或預(yù)防動(dòng)物的疾病的方法，包括施用本文公開(kāi)的組合物。例如，所述方法可包括，給水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如蝦)施用包含芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株的飼料組合物。所述方法還可包括，給其中水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)生活和/或飼養(yǎng)其的環(huán)境施用本文公開(kāi)的殺微生物組合物。所述方法可用于治療或預(yù)防疾病例如腸敗血癥。所述方法可用于治療或預(yù)防病原微生物(例如嗜水氣單胞菌、鮰愛(ài)德華氏菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、柱狀黃桿菌、海豚鏈球菌、魯氏耶爾森氏菌、弧菌屬的種和/或卵菌綱真菌水霉屬)對(duì)水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如蝦)的感染。
[0011]附圖概述
[0012]圖1舉例說(shuō)明軟瓊脂覆層的放大10倍的顯微照片，其顯示芽孢桿菌屬菌株AP102(左邊)對(duì)嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)菌株ML09-119 (右邊)的生長(zhǎng)抑制作用。
[0013]圖2舉例說(shuō)明在用芽孢桿菌改良飼料或非改良飼料喂食后(n=3只動(dòng)物/芽孢桿菌屬菌株)的芽孢桿菌屬菌株CFU/g鯰魚(yú)腸。
[0014]圖3舉例說(shuō)明用和不用芽孢桿菌改良飼料喂食的暴露于ESC的斑點(diǎn)叉尾鮰(channel catfish)幼魚(yú)的累積日死亡率。
[0015]圖4舉例說(shuō)明在用芽孢桿菌改良飼料或非改良飼料喂食后(n=3只動(dòng)物/芽孢桿菌屬菌株)，鯰魚(yú)腸中的芽孢桿菌屬菌株的濃度CFU/g。
[0016]圖5舉例說(shuō)明(A)采用20_30min日水交換的靜態(tài)系統(tǒng)中的斑點(diǎn)叉尾鮰和⑶采用每日5-7h流動(dòng)水的斑點(diǎn)叉尾鮰，或(C)采用20-30min日水交換的靜態(tài)系統(tǒng)中的條紋鯰魚(yú)(striped catfish)的日平均累積死亡率,所述魚(yú)用和不用添加有芽孢桿菌屬菌株的飼料飼養(yǎng)并且用鮰愛(ài)德華氏菌進(jìn)行攻擊。所有值是每種處理4個(gè)平行測(cè)定的平均值。處理:(O )對(duì)照，(.)AP79，( ▼ )AP193L，( Δ )ΑΒ01，( )ΑΡ143 和(? )AP254L。
[0017]詳細(xì)描述
[0018]本文中公開(kāi)了殺微生物組合物。公開(kāi)的殺微生物組合物可使用下述幾個(gè)定義來(lái)描述。
[0019]除非另有所指或根據(jù)上下文表明，否則術(shù)語(yǔ)“一個(gè)/ 一種(a) ”、“一個(gè)/ 一種(an) ”和“所述(the)”意指“一個(gè)/ 一種或多個(gè)/多種”。此外，除非另有所指或根據(jù)上下文表明，否則單數(shù)名詞例如“芽孢桿菌屬的菌株”應(yīng)當(dāng)解釋為意指“芽孢桿菌屬的一個(gè)或多個(gè)菌株”。
[0020]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“約”、“大約”、“大體上”和“顯著地”能夠?yàn)楸绢I(lǐng)域技術(shù)人所理解，并且根據(jù)使用它們的上下文，可在一定程度上變化。如果根據(jù)使用其的上下文，使用的術(shù)語(yǔ)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是不明確的，則“約”和“大約”意指特定項(xiàng)的正或負(fù)< 10%，而“大體上”和“顯著地”意指特定項(xiàng)的正或負(fù)>10%。
[0021]如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“包括”和“包含”具有與術(shù)語(yǔ)“包含”和“含有”相同的含義。
[0022]本文公開(kāi)的組合物和方法包括或使用芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株。本文中使用的芽孢桿菌屬是指，作為硬壁菌門(Firmicutes)的成員的革蘭氏陽(yáng)性桿狀細(xì)菌的屬。在應(yīng)激環(huán)境條件下，芽孢桿菌屬細(xì)菌產(chǎn)生可長(zhǎng)期保持休眠的橢圓形內(nèi)生孢子?？苫谒鼈兊?6S rRNA或其片段(例如，16S rRNA或rDNA核苷酸序列的約lOOOnt，llOOnt，I200nt, 1300nt，1400nt或1500nt片段)的核苷酸序列來(lái)表征和鑒定芽孢桿菌屬細(xì)菌。芽孢桿菌屬細(xì)菌可包括但不限于，酸快生芽孢桿菌(B.acidiceler)、B.acidicola，B.acidiproducens、B.aeolius、B.aerius、嗜氣芽抱桿菌(B.aerophilus)、黏瓊月旨芽抱桿菌(B.agaradhaerens)、艾 丁湖芽抱桿菌(B.aidingensis)、B.akiba1、嗜減性芽抱桿 菌(B.alcalophilus)、B.algicola、B.alkalinitrilicus、B.alkalisediminis、 減土芽抱桿菌(B.alkalitelluris)、高地芽抱桿菌(B.altitudinis)、B.alveayuensis、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)、B.aquimaris、B.arsenicus、阿氏芽抱桿菌(B.aryabhattai)、B.asahi1、萎縮芽抱桿菌(B.atrophaeus)、B.aurantiacus、產(chǎn)氮芽抱桿菌(B.azotoformans)、栗褐芽抱桿菌(B.badius)、罕見(jiàn)芽抱桿菌(B.barbaricus)、巴達(dá)維亞芽抱桿菌(B.bataviensis)、北京芽抱桿菌(B.bei jingensis)、食苯芽抱桿菌(B.benzoevorans)、B.beveridge1、B.bogoriensis、嗜硼芽抱桿菌(B.boroniphilus)、食丁酸芽抱桿菌(B.butanolivorans)、B.Canaveralius、嗜碳芽抱桿菌(B.carboniphilus)、B.cecembensis、解纖維芽抱桿菌(B.ceIlulosiIyticus)、錯(cuò)狀芽抱桿菌(B.cereus)、B.chagannorensis、B.chungangensis、食物芽孢桿菌(B.cibi)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、克氏芽孢桿菌(B.clarkii)、克勞氏芽孢桿菌(B.clausii)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、B.coahuilensis、科氏芽孢桿菌(B.cohnii)、腐葉芽抱桿菌(B.decisifrondis)、脫色芽抱桿菌(B.decolorationis)、鉆特省芽抱桿菌(B.drentensis)、B.farraginis、苛求芽抱桿菌(B.fastidiosus)、堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B.firmus)、彎曲芽孢桿菌(B.fIexus)、B.foraminis、福氏芽孢桿菌(B.fordii)、強(qiáng)壯芽抱桿菌(B.fortis)、B.fumariol1、B.funiculus、解半乳糖芽抱桿菌(B.galactosidiIyticus)、B.galliciensis、明膠芽抱桿菌(B.gelatini)、吉氏芽抱桿菌(B.gibsonii)、B.ginseng1、人參 土芽抱桿菌(B.ginsengihumi)、B.graminis、鹽敏芽抱桿菌(B.halmapalus)、B.halochares、B.halodurans、解半纖維素芽抱桿菌(B.hemi ce I Iulosilyticus)、B.herbertsteinensis、B.horikosh1、B.horneckiae、花園芽抱桿菌(B.horti)、土 地芽抱桿菌(B.humi)、B.hwajinpoensis、B.1driensis、
度芽抱桿菌(B.1ndicus)、B.1nfantis、B.1nfernus、B.1sabeliae、B.1sronensis、咸海鮮芽孢桿菌(B.jeotgali)、韓國(guó)芽孢桿菌(B.koreensis)、B.korlensis、韓研所芽抱桿菌(B.kribbensis)、B.krulwichiae、列城芽抱桿菌(B.1ehensis)、B.lentus、地衣芽抱桿菌(B.1icheniformis)、B.litoralis、B.locisalis、B.luciferensis、B.luteolus、B.macauensis、馬氏芽抱桿菌(B.macyae)、B.mannanilyticus、黃海芽抱桿菌(B.marisfIavi)、B.marmarensis、馬塞芽抱桿菌(B.massiliensis)、巨大芽抱桿菌(B.megaterium)、甲醇芽抱桿菌(B.methanolicus)、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽抱桿菌(B.methy1trophicus)、摩加夫芽抱桿菌(B.mo javensis)、壁芽抱桿菌(B.mural is)、馬丁 教堂芽抱桿菌(B.murimartini)、蕈狀芽抱桿菌(B.mycoides)、B.nanhaiensis、B.nanhaiisediminis、尼氏芽抱桿菌(B.nealsonii)、B.neizhouensis、農(nóng)石開(kāi)所芽抱桿菌(B.niabensis)、煙酸芽孢桿菌(B.niacini)、休閑地芽孢桿菌(B.novalis)、B.0ceanisediminis、奧德賽芽抱桿菌(B.0dysseyi)、奧哈芽抱桿菌(B.0khensis)、B.0kuhidensis、蔬菜芽抱桿菌(B.0leronius)、B.0shimensis、人參地塊芽抱桿菌(B.panaciterrae)、巴塔哥尼亞芽抱桿菌(B.patagoniensis)、B.persepolensis、B.plakortidis、B.pocheonensis、B.polygon1、假嗜減芽抱桿菌(B.pseudoalcaliphilus)、假堅(jiān)強(qiáng)芽孢桿菌(B.pseudofirmus)、假蕈狀芽孢桿菌(B.pseudomycoides)、忍冷芽孢桿菌(B.psychrosaccharoIyticus)、短小芽抱桿菌(B.pumilus)、B.qingdaonensis、B.rigu1、農(nóng)莊芽抱桿菌(B.ruris)、沙福芽抱桿菌(B.safensis)、B.salarius、B.saliphilus、B.schlegeli1、砸砷芽抱桿菌(B.selenatarsenatis)、還原砸酸鹽芽抱桿菌(B.seIenitireducens)、西岸芽抱桿菌(B.seohaeanensis)、沙氏芽抱桿菌(B.shackletonii)、B.siamensis、簡(jiǎn)單芽抱桿菌(B.simplex)、青 窖芽抱桿菌(B.siralis)、史氏芽孢桿菌(B.smithii)、土壤芽孢桿菌(B.soli)、B.soli sal s1、索諾拉沙漠芽孢桿菌(B.sonorensis)、耐芽孢芽孢桿菌(B.sporothermodurans)、同溫層芽孢桿菌(B.stratosphericus)、B.subterraneus、枯草芽抱桿菌(B.subtilis)、B.taeansis、特基拉芽抱桿菌(B.tequilensis)、B.thermantarcticus、B.thermoamylovorans、B.thermocloacae λ B.thermo Iact is、產(chǎn)硫芽抱桿菌(B.thioparans)、蘇云金芽抱桿菌(B.thuringiensis)、B.tripoxylicola、B.tusciae、死谷芽抱桿菌(B.vallismortis)、威氏芽抱桿菌(B.vedderi)、越南芽抱桿菌(B.vietnamensis)、B.viret1、B.wakoensis、韋氏芽抱桿菌(B.weihenstephanensis)、B.xiaoxiensis，及其混合物或滲和物。
[0023]公開(kāi)的組合物和方法可包括或利用枯草芽孢桿菌或與枯草芽孢桿菌關(guān)系密切的芽孢桿菌屬的種?？莶菅挎邨U菌菌株NH.259的16S核糖體ri)NA(GenBank登錄號(hào)EU627171.1)的部分序列在本文中提供為SEQ ID N0:1。與枯草芽孢桿菌關(guān)系密切的芽孢桿菌屬的種可定義為包含含有SEQ ID N0:1的16S ri)NA序列或包含與SEQ ID NO:1具有至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性的 16S rDNA 序列的種。
[0024]公開(kāi)的組合物和方法可包括或利用解淀粉芽孢桿菌或與解淀粉芽孢桿菌關(guān)系密切的芽孢桿菌屬的種。解淀粉芽孢桿菌菌株Chill1-ι的16S核糖體ri)NA (GenBank登錄號(hào)HQ021420.1)的部分序列在本文中提供為SEQ ID N0:2。與解淀粉芽孢桿菌密切相關(guān)的芽孢桿菌屬的種可被定義為，包含含有SEQ ID N0:2的16S ri)NA序列或包含與SEQID NO:2具有至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98% 或 99% 的序列同一性的 16S rDNA 序列的種。
[0025]公開(kāi)的組合物和方法可包括或利用具有與選擇的芽孢桿菌屬的種的菌株的共有序列密切相關(guān)的16S rDNA的芽孢桿菌屬的種。芽孢桿菌屬的種的菌株的共有序列提供為SEQ ID NO:3。公開(kāi)的組合物和方法可包括或利用芽孢桿菌屬的種，其包含含有SEQ ID NO:3的 16S rDNA 序列或包含與 SEQ ID NO: 3 具有至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的16S rDNA序列。
[0026]“百分比序列同一性”可通過(guò)使用可在美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心(NCBI)網(wǎng)站上獲得的Basic Local Alignment Search Tool (BLAST)比對(duì)長(zhǎng)度相同的兩個(gè)序列來(lái)進(jìn)行測(cè)定(即，“bl2seq”，如在 Tatiana A.Tatusova, Thomas L.Madden (1999), //Blast2sequences~a new tool for comparing protein and nucleotide sequences"，F(xiàn)EMS MicrobiolLett.174:247-250中描述的，所述文獻(xiàn)通過(guò)引用整體并入本文)。例如，通過(guò)使用NCBI網(wǎng)站上提供的在線BLAST軟件比對(duì)這兩個(gè)序列來(lái)測(cè)定SEQ ID NO: 1、SEQ ID N0:2或SEQ IDNO: 3之間的百分比序列同一性。
[0027]兩個(gè)脫氧核糖核苷酸序列之間的“百分比序列同一性”還可使用Kimura2-參數(shù)距離模型來(lái)測(cè)定，所述模型通過(guò)考慮轉(zhuǎn)換率和顛換率，同時(shí)假定4個(gè)核苷酸的頻率相同并且置換率在位點(diǎn)間不會(huì)變化(Nei和Kumar，2000)來(lái)修正多個(gè)命中，如在MEGA4 (Tamura K,Dudley J,Nei M&Kumar S(2007)MEGA4:Molecular EvolutionaryGenetics Analysis(MEGA)software version4.0.Molecular Biology andEvolution24:1596-1599),優(yōu)選4.0.2版或更新版本中實(shí)現(xiàn)的。空位開(kāi)放罰分和延伸罰分分別設(shè)置為15和6.66。末端空位不被罰分。延遲發(fā)散序列開(kāi)關(guān)被設(shè)置至30。轉(zhuǎn)換加權(quán)評(píng)分是35，設(shè)置至0.5，作為完全錯(cuò)配與匹配對(duì)評(píng)分之間的平衡。使用的DNA權(quán)重矩陣是IUB評(píng)分矩陣，其中X’ s和n’s與任何IUB模糊符號(hào)(ambiguity symbol)匹配,并且全部匹配評(píng)分為1.9，全部錯(cuò)配評(píng)分為O。
[0028]用于公開(kāi)的組合物和方法的芽孢桿菌屬的適當(dāng)菌株包括本文中提供的實(shí)施例中公開(kāi)的菌株。這些適當(dāng)?shù)木臧ǖ幌抻?，?012年4月27日保藏在美國(guó)農(nóng)業(yè)部的枯草芽孢桿菌菌株ABOl和解淀粉芽孢桿菌菌株AP79、AP143、AP193L和AP254L，其分別具有登錄號(hào) NRRL B-50745、NRRL B-5074UNRRL B-50742 和 NRRL B-50743 和 NRRL B-50744。
[0029]本文公開(kāi)的芽孢桿菌屬菌株在水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)的多種細(xì)菌病原體(包括愛(ài)德華氏菌屬(Edwardsiella)細(xì)菌例如鮰愛(ài)德華氏菌)中顯示抗生素活性。在一些實(shí)施方案中，公開(kāi)的噬菌體或其變體可用于殺死水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)的病原性細(xì)菌或真菌或阻止其生長(zhǎng)的方法中。具體地，所述方法可用于控制或阻止病原性細(xì)菌或真菌對(duì)鯰魚(yú)(例如，斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluri punctatus, Rafinesque))的感染或定殖或?qū)t魚(yú)所生活或飼養(yǎng)鯰魚(yú)的環(huán)境(例如，水產(chǎn)養(yǎng)殖池)的定殖。公開(kāi)的方法還可用于檢測(cè)細(xì)菌在樣品(例如,從感染的水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如,蝦)獲得的樣品，或從水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)所生活的或飼養(yǎng)其的環(huán)境分離的樣品)中的存在。
[0030]還公開(kāi)了方法，所述方法使用公開(kāi)的芽孢桿菌屬菌株，從用于飼養(yǎng)水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)的環(huán)境或器具除去病原性細(xì)菌或真菌，從而降低細(xì)菌或真菌傳播至水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)的可能性。
[0031]還公開(kāi)了方法，所述方法使用本文公開(kāi)的芽孢桿菌屬菌株來(lái)治療或預(yù)防由病原性細(xì)菌或真菌引起的疾病(例如，治療或預(yù)防鯰魚(yú)的腸敗血癥(ESC))。在其它實(shí)施方案中，為了控制或抑制病原性細(xì)菌或真菌的生長(zhǎng)或除去病原性細(xì)菌或真菌，可將本文公開(kāi)的芽孢桿菌屬菌株給環(huán)境(例如，池塘)或器具施用，或可將本文公開(kāi)的芽孢桿菌屬菌株給水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)施用。
[0032]術(shù)語(yǔ)“鯰魚(yú)(catfish)”是指屬于Ictaluri屬的魚(yú)。鯰魚(yú)可包括斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluri punctatus, Rafinesque)。
[0033]本文公開(kāi)的芽孢桿菌產(chǎn)孢菌株可用于殺死對(duì)于水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)是致病性的細(xì)菌或真菌或阻止其生長(zhǎng)?！安≡约?xì)菌”可包括但不限于，嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)、鮰愛(ài)德華氏菌(E.1ctaluri)、遲鈍愛(ài)德華氏菌(E.tarda)、柱狀黃桿菌(F.columnare)、海豚鏈球菌、柱狀黃桿菌、魯氏耶爾森氏菌和弧菌屬的種?！安≡哉婢笨砂ǖ幌抻?，卵菌綱真菌水霉屬。
[0034]公開(kāi)的芽孢桿菌產(chǎn)孢菌株可與另外的試劑一起施用，用于殺死病原性細(xì)菌或真菌或阻止其生長(zhǎng)。另外的試劑可包括抗生素例如磺胺地托辛和奧美普林、細(xì)菌的減毒菌株(例如，鮰愛(ài)德華氏菌的減毒菌株)、氟苯尼考和噬菌體。噬菌體可包括命名為OeiAU的噬菌體，其于 2009 年 9 月 15 日保藏在位于 10801University Boulevard, Manassas, Va., 20110-2209, USA的美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，登錄號(hào)為PTA-10342。
[0035]術(shù)語(yǔ)“樣品”在本文中以其最廣意義使用。樣品可包含來(lái)自動(dòng)物的生物學(xué)樣品(例如，獲自水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)的生物學(xué)樣品)或采集自環(huán)境的樣品(例如，來(lái)自池塘的水樣品或采集自容器或儀器的表面拭樣)。
[0036]示例性實(shí)施方案
[0037]下列實(shí)施方案是舉例說(shuō)明性的并且無(wú)意限定所要求保護(hù)的主題。
[0038]實(shí)施方案1.包含芽孢桿菌屬的一個(gè)或多個(gè)產(chǎn)孢菌株的飼料組合物。
[0039]實(shí)施方案2.實(shí)施方案I的組合物，其中芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株是枯草芽孢桿菌或包含含有SEQ ID NO:1的16S rDNA序列或與SEQ ID NO:1具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的16S rDNA序列的芽孢桿菌屬的種。
[0040]實(shí)施方案3。實(shí)施方案I的組合物，其中芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株是解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)或包含含有 SEQ ID N0:2 的 16S rDNA序列或與 SEQ IDNO:2具有至少約90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的 16S rDNA序列的芽孢桿菌屬的種。
[0041]實(shí)施方案4。實(shí)施方案I的組合物，其中芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株是包含含有SEQ IDN0:3 的 16S rDNA 序列或與 SEQ ID NO: 3 具有至少約 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的16S rDNA序列的芽孢桿菌屬的種。
[0042]實(shí)施方案5。實(shí)施方案I的組合物，其中芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株是選自ABOl、AP79、AP143、AP193L、AP254L的菌株，所述菌株于2012年4月27日保藏于美國(guó)農(nóng)業(yè)部，分別具有登錄號(hào) NRRL B-50745、NRRL B_50741、NRRL B-50742, NRRL B-50743 和 NRRL B-50744。
[0043]實(shí)施方案6。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其中所述飼料組合物是用于水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如,蝦)的飼料組合物。
[0044]實(shí)施方案7。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其中芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株以至少約104CFU/g飼料的濃度存在于組合物中。
[0045]實(shí)施方案8。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其中芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株以至少約105CFU/g飼料的濃度存在于組合物中。
[0046]實(shí)施方案9。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其中芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株以至少約106CFU/g飼料存在于組合物中。
[0047]實(shí)施方案10。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其包含芽孢桿菌屬的單個(gè)菌株。
[0048]實(shí)施方案11。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其包含芽孢桿菌屬的菌株的混合物。
[0049]實(shí)施方案12。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其中芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株抑制選自嗜水氣單胞菌、鮰愛(ài)德華氏菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、柱狀黃桿菌、海豚鏈球菌和魯氏耶爾森氏菌的一種或多種細(xì)菌的生長(zhǎng)。
[0050]實(shí)施方案13。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其中芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株抑制卵菌綱真菌水霉屬的生長(zhǎng)。
[0051]實(shí)施方案14。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其還包含感染鮰愛(ài)德華氏菌的噬菌體。
[0052]實(shí)施方案15。實(shí)施方案14的組合物，其中所述噬菌體是OeiAU。
[0053]實(shí)施方案16。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其還包含選自磺胺地托辛、奧美普林和氟苯尼考的試劑。
[0054]實(shí)施方案17。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其還包含鮰愛(ài)德華氏菌的減毒菌株。
[0055]實(shí)施方案18。前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的組合物，其中芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株對(duì)一種或多種抗生素易感，所述抗生素選自羧芐西林、氨芐西林、大觀霉素、苯唑西林、萬(wàn)古霉素、頭孢菌素、新生霉素、磺胺嘧啶、阿米卡星、紅霉素、新霉素、青霉素、氯霉素、磺胺甲噁唑、諾氟沙星、慶大霉素和環(huán)丙沙星。
[0056]實(shí)施方案19。用于治療或預(yù)防動(dòng)物的疾病的方法，包括給所述動(dòng)物施用前述實(shí)施方案的任一項(xiàng)的飼料組合物。
[0057]實(shí)施方案20。實(shí)施方案19的方法，其中所述動(dòng)物是水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)。
[0058]實(shí)施方案21。實(shí)施方案19或20的方法，其中所述疾病是腸敗血癥。
[0059]實(shí)施方案22。一種殺微生物組合物，其被配制用于給水環(huán)境施用并且包含有效量的用于治療或預(yù)防腸敗血癥的芽孢桿菌屬產(chǎn)孢菌株。
[0060]實(shí)施方案23。實(shí)施方案22的組合物，其中水環(huán)境是飼養(yǎng)水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)的環(huán)境。
[0061]實(shí)施方案24。一種用于治療或預(yù)防水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如,蝦)的腸敗血癥的方法,包括給飼養(yǎng)水生動(dòng)物例如養(yǎng)殖的魚(yú)(例如鯰魚(yú)或羅非魚(yú))和甲殼類動(dòng)物(例如，蝦)的環(huán)境施用實(shí)施方案22的組合物。實(shí)施例
[0062]下列實(shí)施例是舉例說(shuō)明性的并且無(wú)意限定所要求保護(hù)的主題。
[0063]實(shí)施例1-斑點(diǎn)叉尾鮰疾病的生物防治
[0064]引言
[0065]提出了這樣的研究，其具有改善美國(guó)東南部的斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)的商業(yè)生產(chǎn)的環(huán)境可持續(xù)性和經(jīng)濟(jì)活力的巨大潛能。由鮰愛(ài)德華氏菌和其它細(xì)菌及真菌病原體(例如，嗜水氣單胞菌、柱狀黃桿菌和水霉屬的種)引起的鯰魚(yú)腸敗血癥(ESC)，每年造成鯰魚(yú)工業(yè)數(shù)百萬(wàn)美元的損失。對(duì)于水產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)者而言，有益生物用于疾病的生物防治的用途具有如下預(yù)期的有利方面:1)低應(yīng)用成本，2)對(duì)其它細(xì)菌、環(huán)境或人消費(fèi)者無(wú)有害影響，和3)生物防治與現(xiàn)有的疾病控制策略之間的預(yù)期的協(xié)同作用。
[0066]本研究通過(guò)給鯰魚(yú)生產(chǎn)者提供控制影響鯰魚(yú)的病原體的備選策略(從而促進(jìn)更高效的生產(chǎn)和對(duì)東南部鄉(xiāng)村的水產(chǎn)養(yǎng)殖工的經(jīng)濟(jì)生活產(chǎn)生積極影響)，而最終給鯰魚(yú)生產(chǎn)者帶來(lái)益處。此外，通過(guò)減少或消除對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘的抗生素(或其它化學(xué)藥品)處理的需要，生物防治可減輕水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的有害環(huán)境影響。環(huán)境友好的具有成本效益的技術(shù)(其最終目標(biāo)為應(yīng)用生物防治劑來(lái)減少水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘的疾病的發(fā)病率和嚴(yán)重度)是期望的。
[0067]斑點(diǎn)叉尾鮰的培養(yǎng)是過(guò)去30年中北美最成功的動(dòng)物生產(chǎn)工業(yè)之一，并且目前代表了美國(guó)最大的水產(chǎn)養(yǎng)殖工業(yè)。在2009年，超過(guò)2.1億kg的鯰魚(yú)被加工，代表了超過(guò)3.6億美元的總的農(nóng)產(chǎn)品銷售。超過(guò)90%的全部鯰魚(yú)產(chǎn)于亞拉巴馬州、阿肯色州、路易斯安那州和密西西比州，并且主要生長(zhǎng)在大小在2至10公頃之間的土制池塘中(USDA，Part I:Reference of Fingerling Catfish Health and Production Practices in the UnitedStates, 2003;USDAj Part I1:Reference of Foodsize Catfish Health and ProductionPractices in the United States，2003)。鯰魚(yú)養(yǎng)殖者通常以高密度養(yǎng)魚(yú)并且使用其中環(huán)境條件可極快地變化的培養(yǎng)系統(tǒng)。這些不利條件對(duì)魚(yú)施加了額外的壓力，為不同鯰魚(yú)疾病的發(fā)作和傳播提供了有利條件。因此，許多疾病已經(jīng)出現(xiàn)并且成為鯰魚(yú)工業(yè)的地方病。這些地方性感染性疾病中的最重要的疾病是ESC，其導(dǎo)致超過(guò)78%的所有操作成本的損失，并且在42%的食用魚(yú)生產(chǎn)池塘中報(bào)導(dǎo)了暴發(fā)(USDA, Part I !Reference of FingerlingCatfish Health and Production Practices in the United States, 2003;USDA, PartI1:Reference of Foodsize Catfish Health and Production Practices in the UnitedStates, 2003)。增加的飼料價(jià)格和高發(fā)病率的組合導(dǎo)致了斑點(diǎn)叉尾鮰生產(chǎn)者的經(jīng)濟(jì)困難。
[0068]鮰愛(ài)德華氏菌是對(duì)于斑點(diǎn)叉尾鮰高度宿主特異性的桿狀革蘭氏陰性細(xì)菌(Plumb, 1999)。該細(xì)菌在鯰魚(yú)工業(yè)中的經(jīng)濟(jì)影響自1981年首次描述為ESC的致病病原以來(lái)已急劇上升(Hawke等人，1981)。目前，據(jù)估計(jì)ESC每年在直接魚(yú)損失方面使鯰魚(yú)工業(yè)損失2000萬(wàn)至3000萬(wàn)美元(Delbos等人，2001)。腸敗血癥在斑點(diǎn)叉尾鮰中以急性、亞急性和慢性形式發(fā)生(Hawke等人，1981)?；加蠩SC的魚(yú)顯得倦怠并且通常游得很慢，在水表面螺旋游動(dòng)。隨著疾病進(jìn)展，沿著魚(yú)的側(cè)腹和背部出現(xiàn)出血和潰瘍。在慢性發(fā)病的魚(yú)中，開(kāi)放傷口可在頭頂發(fā)生，從而賦予疾病其俗名“頭洞病(hole-1n- the-head disease)”。
[0069]嗜水氣單胞菌也是革蘭氏陰性細(xì)菌病原體，其具有比鮰愛(ài)德華氏菌更廣的宿主范圍，其在全世界所有淡水魚(yú)中引起出血性敗血癥(Cipriano等人，1984; Ford等人，1991)。因嗜水氣單胞菌感染而導(dǎo)致的損失在數(shù)量級(jí)上通常比因鮰愛(ài)德華氏菌造成的損失少得多，其通常被認(rèn)為是與脅迫、操作或機(jī)會(huì)性感染相關(guān)的續(xù)發(fā)病原體(Plumb，1999)；然而，在亞拉巴馬州鯰魚(yú)生產(chǎn)者中，嗜水氣單胞菌感染的2009年流行在其毒力和快速傳播方面在斑點(diǎn)叉尾鮰疾病池塘的St魚(yú)生物防治當(dāng)中是空前的(Terhune, LiIes等人，撰寫中)。該新型嗜水氣單胞菌菌株的暴發(fā)流行已在西亞拉巴馬州的48個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)被記錄，并且據(jù)估計(jì)造成380萬(wàn)磅魚(yú)(主要為可收獲尺寸的動(dòng)物，其中大部分生產(chǎn)成本已被投入)的損失(ff.Hemstreet, personal communication, Alabama Fish FarmingCenter, Greensboro, AL)。
[0070]當(dāng)年魚(yú)(Young-of-the-year)鯰魚(yú)對(duì)ESC和其它病原體是最易感的。魚(yú)種操作上的暴發(fā)流行通常始于8月晚期或9月，此時(shí)水溫從夏天峰值溫度下降至有助于鮰愛(ài)德華氏菌生長(zhǎng)的范圍(22-28°C)。一旦魚(yú)在初始感染中存活下來(lái)，那么魚(yú)就可因獲得性免疫系統(tǒng)的應(yīng)答而變得對(duì)隨后的感染具有免疫力(Klesius，1992)。在生產(chǎn)周期中，通常用魚(yú)種多次再補(bǔ)充用于生產(chǎn)食物大小的魚(yú)的池塘，以允許池塘的連續(xù)收獲。因此，食用魚(yú)生產(chǎn)池塘通常包含具有不同年齡和免疫狀態(tài)的魚(yú)的混合物。食用魚(yú)池塘中的大部分成年魚(yú)已經(jīng)歷了疾病暴發(fā)并且對(duì)疾病具有免疫力，但它們中的一部分將是病原體的攜帶者(Klesius，P.H.1992)。因此，當(dāng)將幼小的魚(yú)種放養(yǎng)于食用魚(yú)池塘?xí)r，它們被暴露于池塘環(huán)境中的病原體，從而使它們更易于暴發(fā)疾病(Wise等人，1998)。
[0071]最初控制ESC、嗜水氣單胞菌和其它細(xì)菌病原體的努力基于喂食加有抗生素的飼料。最近20年來(lái)，被美國(guó)食品藥品管理局(FDA)列為控制ESC和氣單胞菌感染的唯一抗生
素分別是Romet? (奧美普林-磺胺二甲氧嘧啶)和Terramycin? (土霉素)。fda最近批準(zhǔn)了 Aquaf lor? (氟苯尼考)用于ESC暴發(fā)的用途，其目前由Schering Plough
Corp.上市銷售(Ga unt等人，2003;Gaunt等人，2004)。然而,加有藥物的飼料是昂貴的，并且在商業(yè)實(shí)踐中通常只具有邊際效益，因?yàn)榛疾〉聂~(yú)可能吃不到足夠量的加有藥物的飼料來(lái)從處理的群體清除感染。此外，可僅將Aquaflor與獸醫(yī)飼料用藥物(VeterinaryFeed Directive) 一起使用，所述獸醫(yī)飼料用藥物需要由有執(zhí)照的獸醫(yī)進(jìn)行細(xì)菌鑒定和配給，這可進(jìn)一步延遲糾正處理措施的執(zhí)行。抗生素的系統(tǒng)性使用還導(dǎo)致細(xì)菌抗性的發(fā)展
(Khoo, 2001)。Stoneville，MS的鯰魚(yú)池塘的最近調(diào)查已顯示，賦予對(duì)Acptf 1θr?> 24的抗性的質(zhì)粒在鮰愛(ài)德華氏菌疾病分離株中的存在。
[0072]大多數(shù)生產(chǎn)者已在ESC暴發(fā)期間使用限飼措施，以減少死亡率。然而，飼料投入的減少犧牲了魚(yú)的生長(zhǎng)，嚴(yán)重影響了生產(chǎn)者的利潤(rùn)(Wise等人，1998)。最近，鮰愛(ài)德華氏菌的活的減毒菌株已被開(kāi)發(fā)用于接種目的，并且當(dāng)在10日齡接種時(shí)，在實(shí)驗(yàn)和商業(yè)條件下在斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種中都顯示有限的保護(hù)作用(Lim等人，2003; Shoemaker等人，1999; Wise等人，1998; Wise等人，2001)。然而，疫苗一直未被鯰魚(yú)生產(chǎn)者廣泛接受，因?yàn)榧膊〗?jīng)常在接種的魚(yú)群中發(fā)生并且前期成本可能過(guò)高。
[0073]雖然已開(kāi)發(fā)了用于鯰魚(yú)疾病預(yù)防的多種控制策略，但因病原體而導(dǎo)致的重大損失仍在發(fā)生，因此，其它補(bǔ)充方法可受到鯰魚(yú)生產(chǎn)者的歡迎。有效的生物防治劑將需要良好的效力，極低的成本，具有強(qiáng)勁的抗細(xì)菌活性，不產(chǎn)生有害的環(huán)境影響，以及理想地，可使得能夠?qū)ⅥT魚(yú)作為有機(jī)生長(zhǎng)的產(chǎn)品銷售。這樣的生物防治劑最近已由本發(fā)明人鑒定。
[0074]原理和重要件[0075]每一種動(dòng)物都是復(fù)雜微生物生態(tài)系統(tǒng)的宿主，每一種動(dòng)物身體上和體內(nèi)都具有許多獨(dú)特的微生物生境(microbial habitat)。該復(fù)雜微生物群落可提供抗疾病的保護(hù)作用并且?guī)椭@得必需營(yíng)養(yǎng)物。有益微生物正被開(kāi)發(fā)作為農(nóng)業(yè)和水產(chǎn)業(yè)的接種物，以抑制病原體和增強(qiáng)動(dòng)物和植物農(nóng)作物的健康和生長(zhǎng)。所提出的研究將開(kāi)發(fā)用于水產(chǎn)業(yè)的芽孢桿菌屬菌株，以I)預(yù)防因細(xì)菌和真菌病原體而引發(fā)的疾病，2)促進(jìn)可持續(xù)的水產(chǎn)養(yǎng)殖實(shí)踐，和3)給亞拉巴馬州的水產(chǎn)養(yǎng)殖者的經(jīng)濟(jì)生計(jì)帶來(lái)益處。
[0076]生物防治用于預(yù)防和控制損害農(nóng)業(yè)的疾病的用途已被證明在食物農(nóng)作物生產(chǎn)中減少了對(duì)化學(xué)殺蟲(chóng)劑和抗生素的需要(Kloepper等人，2004; Lewis等人，1997; Zehnder等人，2001)。用作殺蟲(chóng)劑替代品的蘇云金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, Bt)的殺昆蟲(chóng)毒素的世界范圍內(nèi)的使用是有益微生物及其天然產(chǎn)物給食品安全帶來(lái)益處，減少對(duì)化學(xué)處理方案的依賴性以及促進(jìn)經(jīng)濟(jì)和環(huán)境可持續(xù)性生產(chǎn)的能力的一個(gè)實(shí)例(Sanchis，2008)。與農(nóng)業(yè)一樣，水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)依賴于高密度單一作物系統(tǒng)，從而為病原性微生物的生長(zhǎng)提供了理想的條件。漁場(chǎng)養(yǎng)殖的魚(yú)和甲殼類動(dòng)物的抗生素處理導(dǎo)致抗生素抗性病原體(所述病原體可被引入人群)的出現(xiàn)頻率不斷增加，并且減少了被迫依賴于高成本的疾病控制化學(xué)方法的養(yǎng)殖者的收益。隨著對(duì)優(yōu)質(zhì)動(dòng)物蛋白質(zhì)來(lái)源的需要在21世紀(jì)不斷增加，并且野生魚(yú)資源可能耗盡，因此，存在對(duì)可被引入水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)實(shí)踐中的具有環(huán)境可持續(xù)性和成本效益的方法的社會(huì)需要(Harlander, , 2002; Serageldin, 1999)。
[0077]本發(fā)明人已顯示，有益細(xì)菌芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢成員用作生物防治劑用于預(yù)防因細(xì)菌或真菌病原體引起的植物疾病的效力(Kloepper等人，“Theory and applications ofrhizobacteria for transplant production and yield enhancement，，，2004;Kloepper等人，“Induced systemic resistance and promotion of plant growth by Bacillusspp.，，，2004;Kokalis-Burelle等人,2003)。在一些情況下，還已發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌屬菌株顯著地促進(jìn)農(nóng)作物植物的生長(zhǎng)并且增加植物對(duì)土壤營(yíng)養(yǎng)物的攝取(Enebak等人,1998;Kloepper等人,2004;Kokalis-Burelle等人,2003)?？蓪⒀挎邨U菌屬的孢子用于植物的種子或根，從而當(dāng)植物暴露于病原體時(shí)，導(dǎo)致疾病癥狀和死亡率的顯著下降。測(cè)試用于抗植物病原體的芽孢桿菌屬生物防治菌株的集合(n=160)以及從斑點(diǎn)叉尾鮰腸勻漿物分離的芽孢桿菌屬培養(yǎng)物(n=17)的抗一組(7種)病原體的生物防治活性，所述病原體是在世界范圍內(nèi)引起水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病和經(jīng)濟(jì)損失的主要原因(例如，圖1)。具體地，測(cè)試每一個(gè)細(xì)菌分離株的抗細(xì)菌病原體嗜水氣單胞菌、鮰愛(ài)德華氏菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、柱狀黃桿菌、海豚鏈球菌、柱狀黃桿菌、哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)、魯氏耶爾森氏菌以及卵菌綱真菌水霉屬的活性。在芽孢桿菌屬菌株的該集合之外，已基于它們對(duì)病原體生長(zhǎng)的體外抑制作用鑒定了用于水產(chǎn)養(yǎng)殖用途的最有效菌株(n=21)。通過(guò)下列來(lái)測(cè)試這21個(gè)芽孢桿菌屬菌株在斑點(diǎn)叉尾鮰的腸內(nèi)存活和生長(zhǎng)的能力:將芽孢桿菌屬的孢子單獨(dú)地噴灑至鯰魚(yú)飼料(約106CFU/g飼料)，用芽孢桿菌改良飼料喂食養(yǎng)魚(yú)缸飼養(yǎng)的鯰魚(yú)魚(yú)種一周，隨后用常規(guī)飼料喂食3天，然后殺死動(dòng)物并且評(píng)估每克腸組織的芽孢桿菌數(shù)目(圖2)。許多芽孢桿菌屬菌株達(dá)到較高的數(shù)目(>108CFU/g腸)，這表明它們已成功地定殖于鯰魚(yú)消化道，然而7個(gè)菌株具有與對(duì)照組(來(lái)自天然的腸群體)相似的芽孢桿菌水平。進(jìn)行的測(cè)試將測(cè)定從鯰魚(yú)腸回收的代表性芽孢桿菌屬菌落的16S rRNA基因序列，以確認(rèn)這些菌落是通過(guò)改良飼料引入動(dòng)物的相同菌株。[0078]通過(guò)選擇幾個(gè)芽孢桿菌屬菌株，并將芽孢桿菌屬孢子以大致等同的IO5CFU/菌株/g飼料用于鯰魚(yú)飼料來(lái)制備“芽孢桿菌屬混合物”。在用2xl05CFU/ml鮰愛(ài)德華氏菌菌株S97進(jìn)行浸潰攻擊之前，將芽孢桿菌改良飼料喂食給鯰魚(yú)魚(yú)種(n=15/罐，5個(gè)罐/處理組)兩天，隨后記錄隨時(shí)間過(guò)去的死亡率。相對(duì)于對(duì)照組，對(duì)于用芽孢桿菌改良飼料喂食的鯰魚(yú)，觀察到死亡率的顯著下降(圖3)。本實(shí)驗(yàn)顯示，引入至斑點(diǎn)叉尾鮰飼料的芽孢桿菌屬孢子在疾病的受控養(yǎng)魚(yú)缸1旲型中具有減少疾病和死亡率的能力。在本提案中，這些科學(xué)豕將一起測(cè)試用于斑點(diǎn)叉尾鮰疾病控制的芽孢桿菌屬生物防治菌株，進(jìn)行關(guān)鍵實(shí)驗(yàn)以開(kāi)發(fā)用于生物防治應(yīng)用的芽孢桿菌屬菌株。
[0079]盡管益生菌、有益微生物用于疾病控制的前景光明，但該科學(xué)領(lǐng)域由于在評(píng)價(jià)一些提出的益生菌方面缺乏科學(xué)嚴(yán)謹(jǐn)性，以及需要系統(tǒng)性地評(píng)價(jià)許多可能的生物試劑(針對(duì)可以是有效的并且獲得監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)的那些)而受到限制。本文中公開(kāi)的實(shí)驗(yàn)將(I)鑒定可通過(guò)施用至斑點(diǎn)叉尾鮰飼料而用于疾病控制的特定芽孢桿菌屬菌株，(2)完成在疾病預(yù)防中顯示最佳前景的特定芽孢桿菌屬菌株的基因組測(cè)序，(3)測(cè)定由每一個(gè)芽孢桿菌屬菌株產(chǎn)生的抗生素的結(jié)構(gòu)，(4)對(duì)芽孢桿菌施用的理想劑量和時(shí)間安排進(jìn)行效力研究，和(5)在用芽孢桿菌改良的鯰魚(yú)飼料長(zhǎng)期喂食后評(píng)價(jià)鯰魚(yú)健康。為了進(jìn)行該研究，芽孢桿菌屬菌株可如下來(lái)進(jìn)行選擇:通過(guò)對(duì)它們?cè)诩膊☆A(yù)防中的相對(duì)效力進(jìn)行合理評(píng)價(jià)，以及針對(duì)上述標(biāo)準(zhǔn)，所述標(biāo)準(zhǔn)對(duì)于它們?cè)诎唿c(diǎn)叉尾鮰生產(chǎn)中的成功應(yīng)用是特別重要的。
[0080]方法
[0081]測(cè)試每一個(gè)芽孢桿菌屬菌株用于控制ESC的相對(duì)益處。養(yǎng)魚(yú)缸中的受控實(shí)驗(yàn)性感染用于評(píng)估每一個(gè)特定細(xì)菌菌株的細(xì)菌生物防治能力。對(duì)于它們各自的生物防治活性而言，在建立細(xì)菌培養(yǎng)物的保護(hù)作用方面評(píng)估幾個(gè)變量。由于長(zhǎng)期環(huán)境貯存可能是商業(yè)應(yīng)用的要求，因此，已選擇芽孢桿菌屬內(nèi)的生成內(nèi)生孢子的細(xì)菌，用于評(píng)估它們的生物防治效力。在I)表達(dá)強(qiáng)勁的抗多種水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體的抑制活性(例如，圖1)，和2)可在鯰魚(yú)腸內(nèi)存活和復(fù)制(圖2)的15個(gè)芽孢桿菌屬培養(yǎng)物當(dāng)中，對(duì)這些培養(yǎng)物進(jìn)行單獨(dú)篩選以鑒定在養(yǎng)魚(yú)缸攻擊中對(duì)于抗ESC的體內(nèi)保護(hù)作用是最有效的菌株。將每一個(gè)芽孢桿菌屬培養(yǎng)物在孢子形成培養(yǎng)基(sporulation medium)中生長(zhǎng)48小時(shí)，隨后用無(wú)菌棉簽取出細(xì)菌細(xì)胞,將其于50ml錐形管中懸浮在無(wú)菌水中。在用無(wú)菌水洗滌2次后，測(cè)試孢子懸浮液的活菌落形成單位(CFU)，隨后通過(guò)以8%(v/w)的劑量噴施孢子懸浮液，以約IO7個(gè)細(xì)菌CFU/g飼料將其用于涂覆鯰魚(yú)飼料。在喂食鯰魚(yú)之前，干燥細(xì)菌涂覆的飼料。在喂食之前，將芽孢桿菌屬孢子涂覆的飼料在4°C貯存，預(yù)期其因內(nèi)孢子形成而在長(zhǎng)期(數(shù)月)貯存中是高度穩(wěn)定的。
[0082]單獨(dú)的芽孢桿菌屬菌株在受控養(yǎng)魚(yú)缸攻擊中預(yù)防ESC的評(píng)估。在這些攻擊實(shí)驗(yàn)中，使用4個(gè)養(yǎng)魚(yú)缸/芽孢桿菌屬菌株或?qū)φ战M，且每養(yǎng)魚(yú)缸具有15條無(wú)特定病原體的鯰魚(yú)魚(yú)種。在攻擊前一周，用涂覆特定芽孢桿菌屬菌株的鯰魚(yú)飼料喂食鯰魚(yú)魚(yú)種至飽足，每天一次，對(duì)照缸接受經(jīng)滅菌的細(xì)菌細(xì)胞(通過(guò)高壓滅菌)，或不添加細(xì)菌。為了進(jìn)行攻擊測(cè)定，在靜態(tài)條件下將對(duì)數(shù)期鮰愛(ài)德華氏菌培養(yǎng)物以約105CFU/ml添加至養(yǎng)魚(yú)缸。每天監(jiān)測(cè)魚(yú)的存活，每一種處理的終存活率用于評(píng)估每一個(gè)芽孢桿菌屬菌株預(yù)防ESC發(fā)展的能力。對(duì)照缸將接受活細(xì)菌改良的飼料，但不接受鮰愛(ài)德華氏菌，以確認(rèn)芽孢桿菌對(duì)鯰魚(yú)活力沒(méi)有有害作用。
[0083]表征毎一個(gè)芽孢桿菌屬菌株產(chǎn)牛的杭牛素化合物。R發(fā)現(xiàn)毎一個(gè)產(chǎn)牛杭牛素的芽孢桿菌屬菌株將抑制性化合物分泌至它們的生長(zhǎng)培養(yǎng)基中。在M9基本培養(yǎng)基中或復(fù)雜胰蛋白酶大豆肉湯培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的芽孢桿菌屬菌株的無(wú)細(xì)胞上清液具有抗病原體抗生素活性，如先前在基于細(xì)胞的生物測(cè)定中測(cè)試的(例如，圖1)。由芽孢桿菌屬菌株產(chǎn)生的抗生素化合物的鑒定對(duì)于最終監(jiān)管機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)使用這些菌株(單獨(dú)地或組合地)來(lái)進(jìn)行疾病控制是非常重要的。
[0084]通過(guò)液相色譜(LC)部分純化抗生素。化合物最初使用尺寸排阻和反向LC來(lái)進(jìn)行純化，使用本文中公開(kāi)的生物測(cè)定來(lái)進(jìn)行測(cè)試。將部分純化的化合物暴露于不同的有機(jī)提取和相分離法，以確定用于從消耗培養(yǎng)基(spent media)中快速提取的條件。在確定這些條件后，使用確定的C18保留指數(shù)(作為“終”純化步驟)來(lái)進(jìn)行純化。盡力實(shí)現(xiàn)生物反應(yīng)性化合物的快速純化，當(dāng)可能時(shí)，將純化限定至三階段方案。
[0085]許多藥物合成途徑產(chǎn)生超過(guò)一種產(chǎn)物。除了無(wú)活性的化合物外，這些產(chǎn)物可包括具有不同效力和活性譜的化學(xué)上相關(guān)的抗生素。例如，產(chǎn)生愛(ài)波喜龍(一種候選抗癌試劑)的細(xì)菌將化學(xué)上相似的愛(ài)波喜龍A、B和D分泌至其培養(yǎng)基中(Tang等人，2000)。共產(chǎn)生的藥物樣分子例如此類分子可通過(guò)LC分離為級(jí)分間的多個(gè)活性峰。初始的LC部分純化步驟可分離活性化合物，并且表征每一個(gè)個(gè)體化合物的抗生素活性譜。將各個(gè)組分純化至同質(zhì)將極大地增加成功的下游質(zhì)譜(MS)分析的可能性。
[0086]可能獲得3種類型的抗生素分子:小肽、有機(jī)分子或脂質(zhì)。尺寸排阻和C18層析將能夠分離這些種類。不能保留在C18上可使得必須嘗試另外的化學(xué)藥品；然而，在芽孢桿菌屬抗生素的初始篩選中，我們偏向于那些在初始純化中顯示是單分散的UV-活性化合物。溶劑系統(tǒng)和PH的變化用于促進(jìn)復(fù)雜混合物的分離，而本文中公開(kāi)的生物測(cè)定提供了監(jiān)測(cè)我們的分子的完整性的強(qiáng)大工具。可大量純化的活性化合物可通過(guò)LC/MS來(lái)分析其結(jié)構(gòu)信息。許多潛在障礙可阻礙化合物的純化。一些生物學(xué)活性是由多亞基分子導(dǎo)致的，當(dāng)組分通過(guò)色譜進(jìn)行分離時(shí)所述多亞基分子可喪失活性(例如，紫色桿菌素)。此外，LC過(guò)程中的溶劑化和其它處理可使一些分子失活。為了區(qū)分這兩種情況，可組合不同的色譜級(jí)分，測(cè)試其活性的回復(fù)。
[0087]活性化合物的化學(xué)表征。使用薄層層析和MS分析來(lái)嘗試化學(xué)表征活性化合物。將薄層層析(TLC)用作廉價(jià)策略來(lái)研究芽孢桿菌屬菌株產(chǎn)生的抗生素的終化合物的同質(zhì)性(例如，通過(guò)UV、硫酸炭化來(lái)監(jiān)測(cè))和化學(xué)功能性(例如，茚三酮反應(yīng)性或乙?；磻?yīng))。這些初始化學(xué)測(cè)定為復(fù)雜分析例如MS和NMR奠定了基礎(chǔ)。LC/MS條件還允許克服可存在于混合樣品中的任何潛在離子抑制作用。進(jìn)一步的LC/MS實(shí)驗(yàn)在純化策略的改進(jìn)方面也是有價(jià)值的。進(jìn)行另外的LC/MS/MS和精確質(zhì)量實(shí)驗(yàn)以將化合物分選至具有結(jié)構(gòu)相似性的組中。來(lái)自單輪LC/MS/MS的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)通常不足以完全確定分子結(jié)構(gòu)。然而，可將數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)值匹配以鑒定先前描述的化合物。甚至不完全的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)亦可用于預(yù)測(cè)溶解度和穩(wěn)定性，分子量的測(cè)定使得能夠以已知的摩爾濃度產(chǎn)生溶液。制備已知濃度的抗生素化合物的能力對(duì)于測(cè)定效力和細(xì)胞毒性是非常重要的。進(jìn)行化學(xué)結(jié)構(gòu)分析。初步LC/MS數(shù)據(jù)有助于活性分子結(jié)構(gòu)的測(cè)定。用于發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物分子的結(jié)構(gòu)的提取和化學(xué)分析是相對(duì)昂貴的方法。為了節(jié)省項(xiàng)目預(yù)算，僅對(duì)少數(shù)(例如，〈6)具有高活性的抗生素化合物進(jìn)行完全化學(xué)結(jié)構(gòu)分析，所述化合物已通過(guò)先前的評(píng)估，并且對(duì)應(yīng)于被鑒定為具有顯著的生物防治活性的芽孢桿菌屬菌株。使用整組的光譜學(xué)技術(shù)(UV-vis、UV-vis-NIR、FT-1R、FT-Raman, GC-FTIR、拉曼共振和NMR波譜法)進(jìn)一步表征來(lái)自每一個(gè)結(jié)構(gòu)相似性組的有前景的候選分子。在初始階段，進(jìn)行一維1H和13C NMR (以天然豐度)實(shí)驗(yàn)和多維NMR1H-13C (以天然豐度)異核單量子相干(HSQC)實(shí)驗(yàn)以分類化合物。還可進(jìn)行完全NMR分析。
[0088]抗不同病原體的抗生素化合物的測(cè)定的相對(duì)效力。可將絕對(duì)和相對(duì)效力數(shù)據(jù)用于對(duì)化合物作為抗生素的效力進(jìn)行分級(jí)。將每一種先前測(cè)試的細(xì)菌和真菌病原體(n=7，參見(jiàn)上文)暴露于純化的化合物的系列稀釋物，以測(cè)定最小抑菌濃度(MIC)。來(lái)自LC/MS結(jié)構(gòu)分析的純化的化合物和分子量數(shù)據(jù)用于將化合物溶解至已知的濃度。將標(biāo)準(zhǔn)抗生素測(cè)定條件和培養(yǎng)基(陽(yáng)離子調(diào)整的Mueller-Hinton液體培養(yǎng)基，適當(dāng)時(shí))用于評(píng)估抗生素效力。簡(jiǎn)而言之，以一式三份重復(fù)，在寬范圍的抗生素濃度下接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期中的細(xì)菌培養(yǎng)物，測(cè)定相對(duì)于陰性對(duì)照(用于抗生素化合物的溶劑或緩沖液)的生長(zhǎng)抑制。測(cè)定每一個(gè)細(xì)菌種類的生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)以計(jì)算MIC5tl (50%的生長(zhǎng)抑制)，將每一種化合物的效力相對(duì)于其它已知的抗生素化合物進(jìn)行比較。陽(yáng)性對(duì)照包括具有先前確定的效力的不同種類的抗生素。
[0089]測(cè)定最有效的芽孢桿菌屬生物防治菌株的基因組的序列。可對(duì)通過(guò)本文中的實(shí)驗(yàn)鑒定的芽孢桿菌屬菌株進(jìn)行測(cè)序。獲得的DNA序列信息可用于基于DNA的菌株特異性跟蹤系統(tǒng)，以監(jiān)測(cè)引入的有益菌株在環(huán)境中的運(yùn)動(dòng)。此外，該工作提供了參與天然產(chǎn)物合成的生物合成途徑的詳盡基因目錄(genetic inventory),并且指明每一個(gè)菌株的代謝和酶促能力，從而使得將來(lái)的工作能夠使用這些基因組序列來(lái)測(cè)定芽孢桿菌全局基因表達(dá)和增強(qiáng)生物防治過(guò)程中的抗微生物生物合成。
[0090]芽孢桿菌屬菌株的基因組測(cè)序和裝配。通過(guò)脈沖場(chǎng)凝膠電脈(PFGE)評(píng)估每一個(gè)有前景的芽孢桿菌屬菌株的基因組尺寸。大多數(shù)芽孢桿菌的基因組為4至7Mbp，因此使用下一代測(cè)序法可容易地產(chǎn)生50倍覆蓋度的芽孢桿菌屬基因組。使用454焦磷酸測(cè)序(對(duì)于>30x基因組測(cè)序覆蓋度，約500bp的閱讀長(zhǎng)度)和使用Illumina測(cè)序(約70bp的配對(duì)末端閱讀長(zhǎng)度，對(duì)于>50x基因組測(cè)序覆蓋度)的組合方法是用于從頭細(xì)菌基因組測(cè)序的最佳策略。大規(guī)模(500ml)生長(zhǎng)芽孢桿菌屬培養(yǎng)物以用于DNA提取，將基因組DNA制備為條形碼標(biāo)記的子文庫(kù)，并進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)使用1/2板454格式，對(duì)于單個(gè)芽孢桿菌屬基因組能夠獲得足夠的測(cè)序覆蓋度。將基因組序列裝配成連續(xù)基因組。生物信息學(xué)軟件包CLC BioGenome Workbench用于進(jìn)行高通量從頭基因組裝配和注釋。特別地，基因組分析嘗試鑒定參與抗生素合成的遺傳途徑，和掃描基因組以尋找潛在地參與發(fā)病機(jī)制的任何基因(例如，溶血素、毒素)的證據(jù)。使用基于其它完全測(cè)序的芽孢桿菌屬基因組建立的隱馬爾可夫模型鑒定一系列預(yù)測(cè)的開(kāi)放閱讀框架(ORF)。利用BLAST算法搜索將芽孢桿菌屬ORF的數(shù)據(jù)庫(kù)與GenBank nr/nt數(shù)據(jù)庫(kù)相比較,根據(jù)每一個(gè)ORF的頂端GenBank命中制備初步注釋。完整(或幾乎完整的)芽孢桿菌屬基因組是用于將來(lái)基因挖掘和基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)(以支持院外資助機(jī)會(huì))的有價(jià)值資源。
[0091 ] 缺乏抗生素合成的芽孢桿菌屬突變體的產(chǎn)生。為了鑒定抗生素合成所需的特定基因，將Mariner轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(Wilson等人，2007)用于對(duì)被選擇用于完整基因組測(cè)序的芽孢桿菌屬菌株(n=3)進(jìn)行隨機(jī)轉(zhuǎn)座子誘變。芽孢桿菌屬Tn突變體編碼壯觀霉素抗性，用含有對(duì)數(shù)期鮰愛(ài)德華氏菌培養(yǎng)物的軟瓊脂(0.7%)覆蓋每一個(gè)突變體菌落。每一個(gè)無(wú)抑制區(qū)的突變體被選擇用于進(jìn)一步的研究。通過(guò)該方式，能夠就功能的喪失非?？焖俚睾Y選數(shù)以萬(wàn)計(jì)的突變體，從而提供了抗生素缺陷型突變體的窮盡集合。使用靶向轉(zhuǎn)座子盒的探針，通過(guò)Southern印跡分析比較每一個(gè)突變體,從而顯示在相同(或緊鄰)基因座中具有轉(zhuǎn)座子插入的突變體。針對(duì)上述更大范圍的細(xì)菌和真菌病原體組，測(cè)試每一個(gè)獨(dú)特的突變體，以確定抑制鮰愛(ài)德華氏菌生長(zhǎng)的抗生素的功能喪失對(duì)于其它病原體是否也類似地喪失了?？赡艿那闆r是，芽孢桿菌屬菌株可表達(dá)多種抗生素，在該情況下可將不同的病原體用于初步篩選以鑒定在抗生素合成中具有缺陷的功能喪失突變體。
[0092]為了鑒定抗生素合成所需的基因，提取獨(dú)特突變體的基因組DNA，將其用作反轉(zhuǎn)PCR的模板(使用位于轉(zhuǎn)座子盒內(nèi)部的引物)來(lái)鑒定與轉(zhuǎn)座子插入位點(diǎn)相鄰的芽孢桿菌屬基因。將DNA序列與完整芽孢桿菌屬基因組序列(作為參照基因組)相比較，以指示每一個(gè)轉(zhuǎn)座子插入在基因組內(nèi)的相對(duì)位置。這是理解參與抗生素合成的遺傳途徑的關(guān)鍵信息，所述抗生素可損害鮰愛(ài)德華氏菌和其它病原體的生長(zhǎng)或活力。通過(guò)使用多個(gè)芽孢桿菌屬菌株來(lái)進(jìn)行生物防治，這實(shí)際上是使用多藥制劑，從而減少了抗藥病原體的可能性。還有益的是，測(cè)試缺乏抗生素合成的芽孢桿菌屬突變體相較于其野生型親代菌株，是否有損于其生物防治活性。
[0093]開(kāi)發(fā)用于疾病生物防治的芽孢桿菌屬菌株的最佳制劑。用于疾病生物防治的最佳芽孢桿菌屬菌株或菌株組合的選擇可通過(guò)許多不同來(lái)源的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)來(lái)確定。該提出的研究鑒定用于控制ESC的最佳芽孢桿菌屬菌株和條件。
[0094]芽孢桿菌屬劑暈依賴性。在這些評(píng)價(jià)各個(gè)菌株體內(nèi)控制疾病的能力的實(shí)驗(yàn)的第一個(gè)實(shí)驗(yàn)中，將在上文中鑒定為預(yù)防鮰愛(ài)德華氏菌感染和死亡的最佳芽孢桿菌屬菌株中的4個(gè)用于確定摻入用于施用的飼料的最佳劑量。如上所述進(jìn)行芽孢桿菌屬孢子和飼料的制備；然而，可改變摻入飼料的孢子的數(shù)目。劑量將包括104、105、106或107CFU/g飼料+對(duì)照處理。將魚(yú)置于按處理分類的攻擊養(yǎng)魚(yú)缸(如上所述的)(每劑量5個(gè)重復(fù)養(yǎng)魚(yú)缸)中，每天喂食經(jīng)處理的飼料至飽足，喂食經(jīng)處理的飼料連續(xù)2周。如上所述通過(guò)靜態(tài)浸潰攻擊魚(yú)。在攻擊當(dāng)天不喂食魚(yú)，但在攻擊后第二天繼續(xù)喂食，在整個(gè)攻擊研究中用分配的處理飼料繼續(xù)喂食。監(jiān)測(cè)死亡率至少21天。單獨(dú)地評(píng)價(jià)每一個(gè)芽孢桿菌屬菌株。
[0095]用作預(yù)防劑或治療劑的芽孢桿菌。在第二系列實(shí)驗(yàn)中，就預(yù)防和/或消除正在進(jìn)行的感染的能力測(cè)試芽孢桿菌屬菌株。通過(guò)改變最初將孢子喂食給魚(yú)的時(shí)間(相對(duì)于攻擊的時(shí)間安排)來(lái)進(jìn)行這些測(cè)試。對(duì)于每一個(gè)上文中鑒定和使用的芽孢桿菌屬菌株，評(píng)價(jià)4個(gè)起始時(shí)間(加上對(duì)照組)。如上所述，將魚(yú)放養(yǎng)于攻擊養(yǎng)魚(yú)缸，隨機(jī)分配至下列5個(gè)處理之一:1)攻擊前I周開(kāi)始喂食芽孢桿菌改良飼料，2)攻擊前3天開(kāi)始喂食芽孢桿菌改良飼料，3)攻擊后I天開(kāi)始喂食芽孢桿菌改良飼料，4)出現(xiàn)第一例鮰愛(ài)德華氏菌相關(guān)死亡(基于臨床和行為體征)的當(dāng)天開(kāi)始喂食芽孢桿菌改良飼料，和5)對(duì)照飼料。在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，用提供至飽足的飼料量給所有處理組喂食芽孢桿菌改良飼料。如上所述進(jìn)行飼料制備和攻擊方案。
[0096]與芽孢桿菌屬的施用相關(guān)的生長(zhǎng)和病理學(xué)?；谏衔蔫b定的芽孢桿菌屬的劑量，使用4個(gè)最佳的鑒定的細(xì)菌菌株的每一個(gè)和它們各自最佳劑量，使鯰魚(yú)經(jīng)歷生長(zhǎng)性能試驗(yàn)。如先前所述，利用適當(dāng)?shù)难挎邨U菌屬劑量制備飼料。對(duì)幼魚(yú)(每條約5g)進(jìn)行計(jì)數(shù)，集體稱重，將其放養(yǎng)在養(yǎng)魚(yú)缸中，隨機(jī)分配指定的飼料處理，每種處理利用4個(gè)重復(fù)養(yǎng)魚(yú)缸，每重復(fù)缸16條魚(yú)。用制備的飼料每天喂食魚(yú)一次，使用大致4-5%的體重(大致飽足；基于初始重量)。每?jī)芍軐⑷眶~(yú)從缸中取出進(jìn)行集體稱重，進(jìn)行8周，重量用于調(diào)整提供的飼料的量。在第4和8周，從每個(gè)缸取出來(lái)自每一個(gè)缸的4條魚(yú)。取出部分下腸道，將其用于評(píng)估組織中定殖的期望的芽孢桿菌屬生物的數(shù)目(CFU/g)。將剩余的魚(yú)組織保存在10%的中性緩沖福爾馬林中，以進(jìn)行組織病理學(xué)評(píng)價(jià)。魚(yú)的終重量用于測(cè)定生長(zhǎng)性能影響和飼料轉(zhuǎn)化率。
[0097]用于ESC生物防治的不同芽孢桿菌屬菌株的組合(“混合物”)。在每一個(gè)可能的組合中以其理想劑量使用各個(gè)芽孢桿菌屬菌株，評(píng)估每一種芽孢桿菌屬“混合物”的控制ESC疾病的效力。如先前所述利用等孢子劑量的I至4個(gè)芽孢桿菌屬菌株制備處理飼料。如上所述進(jìn)行魚(yú)攻擊實(shí)驗(yàn)，每種混合物處理使用5個(gè)重復(fù)養(yǎng)魚(yú)缸(每個(gè)重復(fù)15條魚(yú))。隨后給魚(yú)喂食適當(dāng)?shù)奶幚盹暳?，進(jìn)行I周，然后進(jìn)行攻擊，隨后在攻擊后整個(gè)實(shí)驗(yàn)持續(xù)過(guò)程中，繼續(xù)喂食所述處理飼料。
[0098]實(shí)施例2-用于鯰魚(yú)病原體的生物防治的芽孢桿菌屬菌株的鑒定
[0099]在下列實(shí)施例2中，進(jìn)一步進(jìn)行和重復(fù)實(shí)施例1中提出的和完成的研究。
[0100]適要
[0101]選擇芽孢桿菌屬菌株，評(píng)價(jià)其對(duì)鯰魚(yú)疾病的生物防治。從土壤或斑點(diǎn)叉尾鮰腸分離芽孢桿菌屬菌株，就抗鮰愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的強(qiáng)有力拮抗性篩選所述菌株。選擇了 21個(gè)菌株，并測(cè)試它們抗其它水生動(dòng)物病原體的拮抗性活性。測(cè)定每一個(gè)芽孢桿菌屬菌株在斑點(diǎn)叉尾鮰腸中的存活，在重復(fù)養(yǎng)魚(yú)缸中進(jìn)一步評(píng)價(jià)5個(gè)具有最佳抗微生物活性譜和腸存活的芽孢桿菌屬菌株的抗鮰愛(ài)德華氏菌攻擊的保護(hù)活性。兩個(gè)芽孢桿菌屬菌株在減少鯰魚(yú)死亡率方面賦予顯著的益處(P〈0.05)。利用5個(gè)芽孢桿菌屬菌株中的4個(gè)在越南進(jìn)行的類似攻擊實(shí)驗(yàn)，也在條紋鯰魚(yú)中顯示了抗鮰愛(ài)德華氏菌的保護(hù)作用。所選擇的菌株中的3個(gè)菌株的安全性研究未顯示，針對(duì)臨床上重要的抗生素的質(zhì)粒和抗性的存在。當(dāng)作為飼料添加劑施用以控制由鮰愛(ài)德華氏菌引起的疾病時(shí)，芽孢桿菌屬菌株對(duì)于鯰魚(yú)是有益的。本研究中選擇的芽孢桿菌屬菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖中潛在地用作當(dāng)前使用的抗微生物化合物的具有成本效益的替代品。
[0102]￡1=:
[0103]斑點(diǎn)叉尾鮰的水產(chǎn)養(yǎng)殖在過(guò)去30年中已為北美最成功的動(dòng)物生產(chǎn)工業(yè)之一，并且目前代表了美國(guó)的最大水產(chǎn)養(yǎng)殖工業(yè)。超過(guò)90%的所有美國(guó)產(chǎn)鯰魚(yú)產(chǎn)于亞拉巴馬州、阿肯色州、路易斯安那州和密西西比州，并且主要生長(zhǎng)在大小在2至10公頃之間的土制池塘中(USDA2003a，2003b)。鯰魚(yú)養(yǎng)殖者通常以高密度養(yǎng)魚(yú)。
[0104]與高密度魚(yú)養(yǎng)殖相關(guān)的高飼料輸入刺激了機(jī)會(huì)感染菌的增殖(Austin等人，1995)。此外，高魚(yú)密度以及水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘的快速改變的溫度和化學(xué)組成對(duì)魚(yú)產(chǎn)生了壓力，為疾病的發(fā)作和傳播提供了有利條件。由革蘭氏陰性細(xì)菌鮰愛(ài)德華氏菌引起的鯰魚(yú)腸敗血癥(ESC) (Hawke 1979)是斑點(diǎn)叉尾鮰水產(chǎn)養(yǎng)殖工業(yè)的最重要的地方流行性感染性疾病(Hawke和Khoo2004)。據(jù)報(bào)導(dǎo)，由ESC造成的損失超過(guò)78%的所有操作成本，且在42%的鯰魚(yú)生產(chǎn)池塘中報(bào)導(dǎo)了暴發(fā)，每年經(jīng)濟(jì)損失為200 0萬(wàn)至3000萬(wàn)美元(Wagner等人，2002;USDA2003a, 2003b)。
[0105]斑點(diǎn)叉尾鮰的另一個(gè)重要病原體是嗜水氣單胞菌，其為能動(dòng)氣單胞菌敗血癥(motile aeromonad septicaemia, MAS)的主要病原體(Harikrishnan 等人，2003)并且可感染多種魚(yú)包括羅非魚(yú)、鯰魚(yú)、金魚(yú)、鯉魚(yú)和鰻魚(yú)(Pridgeon等人，2011)。在2009年和2010年，嗜水氣單胞菌被鑒定為養(yǎng)殖的斑點(diǎn)叉尾鮰的疾病流行的病原體，導(dǎo)致比通常對(duì)于MAS看到的更高的死亡率，造成亞拉巴馬州商業(yè)鯰魚(yú)工業(yè)超過(guò)500萬(wàn)磅的鯰魚(yú)損失。從疾病流行期間的患病魚(yú)分離的嗜水氣單胞菌菌株(例如，菌株AL09-119)在養(yǎng)魚(yú)缸疾病攻擊試驗(yàn)中，相較于嗜水氣單胞菌參照菌株，具有高毒力(Pridgeon等人，2011)。
[0106]水晶巴丁魚(yú)(Pangasianodonhypophthalmus Sauvage,通常稱為條紋It魚(yú))是越南的湄公河三角州的天然鯰魚(yú)。水晶巴丁魚(yú)的農(nóng)業(yè)部門已記錄了過(guò)去十年全球最高體積生長(zhǎng)速率(相較于任何其它水產(chǎn)養(yǎng)殖商品)(Phan等人，2009; Phuong和0anh2009)。該部門在2007年和2008年分別負(fù)責(zé)687，000和1，094, 879t產(chǎn)量，后者占越南(全球水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量中排名第5的國(guó)家)的總水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量的34%(De Silva等人，2010)。此外，超過(guò)90%的養(yǎng)殖鯰魚(yú)被加工和出口至全球100多個(gè)國(guó)家(Phuong和0anh2009)。巨鯰屬(Pangasius)的種的壞死桿菌病(BNP)(也由鮰愛(ài)德華氏菌引起)是湄公河三角州條紋鯰魚(yú)水產(chǎn)養(yǎng)殖工業(yè)的經(jīng)濟(jì)上重大的疾病，其可造成50-90%的死亡率并且在98%的養(yǎng)殖場(chǎng)中發(fā)生(Phan等人2009)。
[0107]通過(guò)在魚(yú)飼料中口服施用抗生素的化學(xué)療法是細(xì)菌疾病的最常用治療；然而，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的抗生素使用因抗藥性微生物的出現(xiàn)和抗生素殘留而可對(duì)公共衛(wèi)生和環(huán)境造成潛在危害(Johnsonl991;DePaola等人，1995;Plumb等人，1995)。此外，消化道中對(duì)魚(yú)的健康和營(yíng)養(yǎng)具有貢獻(xiàn)的正常共棲微生物被口服化學(xué)療法抑制(Gerald和Janel966; Sugita等人，1990)。為了整改該情況，已對(duì)改善的畜牧業(yè)給予了更大的重視(通過(guò)更好的營(yíng)養(yǎng)、改善的水質(zhì)、更低的放養(yǎng)密度以及疫苗和非特異性免疫刺激劑的使用)(Austin和Austinl999)。已進(jìn)行少數(shù)研究來(lái)研究用于緩解斑點(diǎn)叉尾鮰的感染性疾病的益生菌，未曾報(bào)導(dǎo)過(guò)在飼料中進(jìn)行直接施用的研究。Queiroz和Boyd(1998)將商業(yè)益生菌產(chǎn)品Biostart (其包含少數(shù)幾種芽孢桿菌屬的種)用于斑點(diǎn)叉尾鮰的池塘水中，并且顯示用芽孢桿菌屬的種處理的魚(yú)的存活和凈產(chǎn)量顯著大于對(duì)照。然而，該先前的研究中使用的細(xì)菌不是針對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰中的使用而特異性分離的，并且也沒(méi)有表征它們的抗斑點(diǎn)叉尾鮰重要病原體的抗微生物活性。
[0108]在本研究中，測(cè)試從土壤分離的芽孢桿菌屬菌株的集合(n=160)和來(lái)自斑點(diǎn)叉尾鮰的腸的菌株(n=17)的抗鮰愛(ài)德華氏菌菌株(從患病鯰魚(yú)分離的)，嗜水氣單胞菌以及斑點(diǎn)叉尾鮰的其它細(xì)菌和真菌病原體的體外抗微生物活性。評(píng)價(jià)顯示有效抗生作用的芽孢桿菌屬菌株各自在斑點(diǎn)叉尾鮰的腸中的存活率。在養(yǎng)魚(yú)缸系統(tǒng)中，使用斑點(diǎn)叉尾鮰和條紋鯰魚(yú)疾病攻擊研究來(lái)評(píng)估性能最佳的芽孢桿菌屬菌株當(dāng)被改良至飼料中時(shí)的生物防治活性。還在針對(duì)抗生素的質(zhì)粒和抗性的存在方面評(píng)估所選擇的芽孢桿菌屬菌株的安全性。
[0109]材料和方法
[0110]細(xì)菌菌株。將鮰愛(ài)德華氏菌菌株S97-773用于芽孢桿菌屬抗生作用的初步篩選和ESC攻擊實(shí)驗(yàn)，因?yàn)樵摼陮?duì)于斑點(diǎn)叉尾鮰是高度致病的，并且先前已在SoutheasternCooperative Fish Disease Laboratory (SCFDL), Auburn University 用于攻擊研究。鮰愛(ài)德華氏菌菌株R-4383、愛(ài)德華氏菌菌株Alg-08-200、遲鈍愛(ài)德華氏菌、海豚鏈球菌、魯氏耶爾森氏菌、柱狀黃桿菌和水霉(Saprolegnia ferax)來(lái)自SCFDL的病原性分離株的集合。鮰愛(ài)德華氏菌NLF33分離自越南的患病條紋鯰魚(yú)。嗜水氣單胞菌AL09-119分離自2009年的患MAS的斑點(diǎn)叉尾鮰。土壤來(lái)源的芽孢桿菌屬菌株的集合(n=160)由Dr.Joseph Kloepper的實(shí)驗(yàn)室(Department of Entomology and Plant Pathology, Auburn University)提供?？莶菅勘U菌 1E17 獲自 Bacillus Genetic Stock Centre。
[0111]從斑點(diǎn)叉尾鮰的腸分離芽孢桿菌屬的種的菌株并評(píng)價(jià)抗微生物活性。通過(guò)施用過(guò)量MS-222處死健康鯰魚(yú)(7-lOcm)，完整地取出消化道。將約1.0g在9.0ml的無(wú)菌鹽水(0.9%w/v)中進(jìn)行勻漿。在新鮮鹽水中制備10倍系列稀釋物直至10_6，將0.1ml分散在一式三份胰蛋白胨大豆瓊脂(TSA)板的表面上，在28°C溫育48h (Irianto和Austin，2002)。隨機(jī)挑揀芽孢桿菌屬樣菌落，通過(guò)將分離的菌落在新鮮培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)來(lái)進(jìn)行純化，使用雙層軟瓊脂法(Jack等人，1996)檢查抗鮰愛(ài)德華氏菌生長(zhǎng)的抑制作用。為了進(jìn)行軟瓊脂覆蓋，將細(xì)菌分離株在30°C于5ml胰蛋白胨大豆液體培養(yǎng)基(TSB)中生長(zhǎng)24小時(shí)。隨后將5 μ I的體積點(diǎn)在一式三份TSA板上，再溫育24小時(shí)。將利用TSB制備的軟瓊脂(0.7%w/v瓊脂)熔化，隨后冷卻至37°C，用對(duì)數(shù)期鮰愛(ài)德華氏菌菌株S97-773的接種物進(jìn)行接種，以獲得輕微濁度(即，IO7個(gè)細(xì)胞/ml)。立即將軟瓊脂中的細(xì)菌細(xì)胞懸浮液傾倒在TSA板上方，在30°C溫育24小時(shí)，隨后將清亮區(qū)在鮰愛(ài)德華氏菌的菌苔生長(zhǎng)中的存在(以mm表示)記錄為生長(zhǎng)抑制的證據(jù)。記錄為對(duì)鮰愛(ài)德華氏菌具有抑制作用的培養(yǎng)物通過(guò)革蘭染色法來(lái)表征，并使用‘通用細(xì)菌’引物組27F和1492R進(jìn)行16S rRNA基因測(cè)序(Weisburg等人，1991)。使用 Chromas Pro (Technelysium Pty Ltd.，Queensland, Australia)產(chǎn)生共有 16S rRNA序列，利用BLASTn將每一個(gè)序列與GenBank非冗余核苷酸數(shù)據(jù)庫(kù)相比較。在_80°C冷凍保存芽孢桿菌屬的種的菌株。使用相同方法測(cè)試土壤來(lái)源的芽孢桿菌屬菌株的集合(n=160)的抗鮰愛(ài)德華氏菌的抗微生物活性。
[0112]測(cè)試50個(gè)具有抗鮰愛(ài)德華氏菌S97-773的拮抗活性的芽孢桿菌屬菌株的抗其它鮰愛(ài)德華氏菌菌株(鮰愛(ài)德華氏菌R-483、鮰愛(ài)德華氏菌Alg-08-200)的抑制活性。進(jìn)一步評(píng)價(jià)顯示抗所有3種鮰愛(ài)德華氏菌菌株的抗微生物活性的芽孢桿菌屬菌株的抑制嗜水氣單胞菌菌株AL09-119的生長(zhǎng)的活性。使用上述軟瓊脂覆蓋法，測(cè)試21個(gè)芽孢桿菌屬菌株(其顯示顯著的抗鮰愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抗微生物活性)的抗幾種其它的斑點(diǎn)叉尾鮰病原體(包括遲鈍愛(ài)德華氏菌、海豚鏈球菌、魯氏耶爾森氏菌、水霉)的活性。
[0113]利用瓊脂孔擴(kuò)散法(agar well diffusion method)測(cè)試抗柱狀黃桿菌的抗微生物活性。為了進(jìn)行孔擴(kuò)散測(cè)定，將芽孢桿菌屬菌株在30°C于5ml TSB中生長(zhǎng)48小時(shí)。在以3，600x g離心10分鐘后，通過(guò)0.2 μ m濾器過(guò)濾培養(yǎng)上清液。隨后將200 μ I過(guò)濾滅菌的上清液添加至在柱狀黃桿菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基(FCGM)瓊脂板中制備的圓孔(直徑約20mm)中(Farmer2004)。在上清液被吸收進(jìn)入瓊脂培養(yǎng)基后，使用無(wú)菌棉簽將在FCGM液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期柱狀黃桿菌充分散布在板上。將板在30°C溫育48小時(shí)。
[0114]還測(cè)試芽孢桿菌屬菌株AP79、AP143、AP193L、AP254L和ABOl的抗鮰愛(ài)德華氏菌NLF33(條紋鯰魚(yú)的BNP的病原體)的體外抗微生物活性。將鮰愛(ài)德華氏菌的液體培養(yǎng)物調(diào)整至106CFU/mL，均勻涂抹在TSA板上。在瓊脂板上鉆3個(gè)孔，將50 μ L的108CFU/mL的無(wú)芽孢桿菌屬細(xì)胞上清液(于TSB中培養(yǎng)48小時(shí))添加至每一個(gè)孔。在30°C下溫育24小時(shí)后測(cè)量抑菌區(qū)。
[0115]芽抱桿菌屬的基因組測(cè)序。使用Promega基因組DNA分離試劑倉(cāng)(Madison, WI)從生長(zhǎng)在TSB中的500ml培養(yǎng)物提取芽孢桿菌屬菌株的基因組DNA。使用Nanodrop分光光度計(jì)(Thermo Scientific，Wilmington, DE)評(píng)估基因組DNA的收率和純度，將約7微克芽孢桿菌屬基因組DNA送至Lucigen Corporation (Middleton, WI),以利用鈦化學(xué)來(lái)產(chǎn)生用于454焦磷酸測(cè)序的條形碼標(biāo)記的子文庫(kù)。在Hudson Alpha的Genomic ServicesLab (Huntsville, AL),使用 Roche454Genome Sequencer FLX (Branford, CT)對(duì)條形碼標(biāo)記的芽孢桿菌屬子文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，每半個(gè)454板使用2個(gè)芽孢桿菌屬基因組(菌株AP143和AP254L)或每整個(gè)454板使用3個(gè)芽孢桿菌屬基因組(菌株AP18、AP193L和本研究中未描述的另一個(gè)菌株)。將基因組序列輸入CLC Genomics Workbench (Cambridge, MA),以0.01的嚴(yán)謹(jǐn)度進(jìn)行質(zhì)量修剪，使用長(zhǎng)度分?jǐn)?shù)=0.5和相似性=0.8的裝配設(shè)置進(jìn)行從頭裝配。將大于IOkb的連續(xù)基因組序列(毗連群)的集合輸出至FASTA格式的文件中，利用BLASTn將每一個(gè)Btt連群與GenBank nr數(shù)據(jù)庫(kù)相比較。此外,利用用于原核生物程序的GeneMark.hmm預(yù)測(cè)每一個(gè)紙連群上的開(kāi)放閱讀框架(ORF),所述GeneMark.hmm使用枯草芽孢桿菌ORF-發(fā)現(xiàn)模型。通過(guò)BLASTn和BLASTx將每一個(gè)芽孢桿菌屬基因組的預(yù)測(cè)的ORF與GenBank nr數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列相比較。通過(guò)如下步驟評(píng)估芽孢桿菌屬基因組序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已知的芽孢桿菌屬基因組的百分比同一性:將所有大于IOkb的毗連群的BLAST結(jié)果包括在一起，評(píng)估所有毗連群對(duì)特定芽孢桿菌屬基因組的累加百分比同一性(對(duì)于各個(gè)比對(duì)的基因組區(qū)域，除以這些毗連群內(nèi)測(cè)序的堿基對(duì)的總數(shù))。由此，每一個(gè)測(cè)序的芽孢桿菌屬菌株的物種命名被確定并且示于表I中，大于70%的百分比同一性值指示物種相關(guān)性(speciesaffiliation)。
[0116]芽孢桿菌屬孢子和孢子改良飼料的制備。通過(guò)Kenny和Couch(1981)描述的方法(具有一些改進(jìn))制備芽孢桿菌屬孢子。將芽孢桿菌屬菌株在30°C于TSB中生長(zhǎng)過(guò)夜。隨后利用無(wú)菌棉簽，將液體培養(yǎng)基涂鋪在孢子制備瓊脂(蛋白胨3.3g/l,牛肉提取物粉末1.0g/
I,NaC15.0g/l, Κ2ΗΡ042.0g/l, KCll.0g/l, MgSO4.7Η200.25g/l, MnSO40.01g/l,乳糖 5g/l,瓊脂15g/l)上，在28°C溫育5至7天。為了收集孢子，將5ml無(wú)菌蒸餾水添加至板，使用接種環(huán)將孢子懸浮于水中。隨后將孢子懸浮液在85°C溫育15min以殺死營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞。孢子懸浮液的濃度通過(guò)系列稀釋并將其涂鋪至TSA上來(lái)測(cè)定。利用無(wú)菌水將孢子懸浮液的終濃度調(diào)整至1.25xl010CFU/ml以用于腸存活測(cè)試，和109CFU/ml以用于ESC攻擊研究。為了制備孢子改良飼料，使用漂白劑滅菌的和乙醇滅菌的泵式噴霧器將80ml孢子懸浮液噴霧至IOOOg商購(gòu)可得的緩慢下沉的粒狀魚(yú)飼料(2mm, 40%蛋白質(zhì)，Zeigler, Gardners, PA),以實(shí)現(xiàn)約8%v/w的孢子懸浮液施用。隨后將飼料與30ml魚(yú)油充分混合。對(duì)照飼料僅用魚(yú)油進(jìn)行改良。
[0117]芽孢桿菌屬的種在斑點(diǎn)叉尾鮰的腸中的接種和定暈。將斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種(7-10cm)分配入22個(gè)60L的缸，每一個(gè)缸裝有15L水和3條魚(yú)。實(shí)驗(yàn)前將魚(yú)饑餓一周。通過(guò)使用先前描述的孢子施用法，在分開(kāi)的批次中用21個(gè)顯示良好的抗鮰愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抗微生物活性的芽孢桿菌屬菌株改良鯰魚(yú)飼料。將每一種獨(dú)特的芽孢桿菌屬菌株改良飼料(約109CFU/g飼料)供給一個(gè)養(yǎng)魚(yú)缸。每天用孢子改良飼料或?qū)φ诊暳衔故臭~(yú)一次，進(jìn)行I周，隨后全部魚(yú)接受對(duì)照飼料3天。將一個(gè)缸用作對(duì)照并且在整個(gè)實(shí)驗(yàn)期間接受未處理的魚(yú)飼料。日喂食率為3%的總體重。
[0118]實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，通過(guò)施用過(guò)量MS-222來(lái)處死所有魚(yú)。取出腸，稱重，隨后于2ml無(wú)菌鹽水(0.9%w/v)中勻漿。隨后將勻漿樣品于無(wú)菌鹽水中進(jìn)行系列稀釋，涂覆在TSA上，在28°C溫育48小時(shí)。從板隨機(jī)挑揀3個(gè)代表性菌落(其具有與施用的芽孢桿菌屬菌株相同的形態(tài)學(xué))，在新板上純化菌落，并通過(guò)先前描述的16S rRNA基因測(cè)序鑒定菌落，將其與來(lái)自各個(gè)芽孢桿菌屬菌株的已知的16S rRNA基因序列相比較。對(duì)于對(duì)照組和處理組，僅記錄對(duì)應(yīng)于改良用芽孢桿菌屬菌株的菌落形態(tài)學(xué)的獨(dú)特菌落形態(tài)學(xué)。將從腸回收的各個(gè)芽孢桿菌屬菌株的可培養(yǎng)計(jì)數(shù)測(cè)定為CFU/g腸樣品。
[0119]養(yǎng)隹缸攻擊研究。5個(gè)芽孢桿菌屬菌株(AB01、AP143、AP193L、AP254L和AP79)被選擇用于在利用鮰愛(ài)德華氏菌菌株S97-773的養(yǎng)魚(yú)缸攻擊試驗(yàn)中進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)價(jià)。包括5種芽孢桿菌屬處理和一個(gè)對(duì)照(每一種處理利用4個(gè)重復(fù)養(yǎng)魚(yú)缸)。每一個(gè)重復(fù)養(yǎng)魚(yú)缸放養(yǎng)25條重量約13g的斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種。使魚(yú)適應(yīng)商業(yè)干燥飼料I周。隨后以2.5%fw/bw (飼料重量/體重)的日喂食率，用補(bǔ)充以芽孢桿菌屬菌株的孢子(8X107CFU/g)的實(shí)驗(yàn)膳食喂食每一個(gè)處理組的魚(yú)，進(jìn)行2周。對(duì)照組中的魚(yú)僅接受正常飼料。
[0120]通過(guò)在IOL含有鮰愛(ài)德華氏菌S97-773的水中浸潰45分鐘來(lái)攻擊魚(yú)。將來(lái)自相同組的所有魚(yú)在單個(gè)容器中浸潰。鮰愛(ài)德華氏菌S97-773的濃度被缺點(diǎn)為4.5X 106CFU/ml。對(duì)照組的攻擊條件與其它處理相同，除添加BHI培養(yǎng)基而非鮰愛(ài)德華氏菌培養(yǎng)物外。在21天的時(shí)期中監(jiān)測(cè)死亡率，解剖死亡的魚(yú)，通過(guò)在TSA上進(jìn)行腎和肝拭子的微生物檢查來(lái)確認(rèn)鮰愛(ài)德華氏菌的存在。通過(guò)生物化學(xué)分析確認(rèn)回收的鮰愛(ài)德華氏菌的身份。
[0121]在適應(yīng)期期間，將魚(yú)飼養(yǎng)在循環(huán)系統(tǒng)中。在開(kāi)始芽孢桿菌喂食后和在攻擊期期間，使用每日進(jìn)行20-30分鐘水交換的靜態(tài)系統(tǒng)。將海綿生物濾器和未吃的物質(zhì)/廢料的每日去除包括進(jìn)來(lái)以控制潛在的水質(zhì)量問(wèn)題。將水溫保持在26±2°C。在靜止期期間，將與可沉入水中的養(yǎng)魚(yú)缸水加熱器結(jié)合的中央室加熱系統(tǒng)用于控制所需的水溫，水加熱器系統(tǒng)用于在水交換過(guò)程中控制新來(lái)的水的溫度。
[0122]用較低劑量的鮰愛(ài)德華氏菌和流通條件進(jìn)行使用斑點(diǎn)叉尾鮰的另一個(gè)攻擊試驗(yàn)。在該攻擊實(shí)驗(yàn)中，使用5種芽孢桿菌屬處理(AP79、AP143、AP193L和AB01)和一個(gè)對(duì)照，每一種處理使用4個(gè)重復(fù)養(yǎng)魚(yú)缸。每一個(gè)養(yǎng)魚(yú)缸放養(yǎng)20條斑點(diǎn)叉尾鮰魚(yú)種(約12g)。將較低劑量的鮰愛(ài)德華氏菌S97-773(8X 105CFU/ml)用于攻擊魚(yú)，且緊在攻擊后開(kāi)始沖洗養(yǎng)魚(yú)缸，每天5-8小時(shí)。該攻擊中的所有其它條件與先前攻擊相同。在攻擊后21天期間監(jiān)測(cè)死亡率，如先前所述確認(rèn)鮰愛(ài)德華氏菌在死亡的魚(yú)中的存在。
[0123]進(jìn)行另一個(gè)攻擊試驗(yàn)以評(píng)價(jià)4個(gè)芽孢桿菌屬菌株(AP79、AP193L、AP254L和AB01)抗條紋鯰魚(yú)的鮰愛(ài)德華氏菌的保護(hù)作用。本研究中使用5種處理(每種處理使用4個(gè)重復(fù)缸)。每一個(gè)缸放養(yǎng)18只條紋鯰魚(yú)(約14g)。給條紋鯰魚(yú)施用芽孢桿菌屬孢子改良的飼料(約107CFU/g飼料)和對(duì)照飼料，進(jìn)行2周，將魚(yú)轉(zhuǎn)移至80L缸以用鮰愛(ài)德華氏菌NLF33進(jìn)行浸浴攻擊。將魚(yú)浸潰在靜態(tài)充氧的養(yǎng)魚(yú)缸中30分鐘(約106CFU/mL的劑量)，以在對(duì)照組中達(dá)到約70%死亡率。在整個(gè)攻擊期間提供對(duì)照和測(cè)試膳食。如上進(jìn)行死亡率的記錄和死亡的魚(yú)中的鮰愛(ài)德華氏菌的確認(rèn)。
[0124]質(zhì)粒分析。通討堿裂解法(Birnboim和Dolyl979)從芽孢桿菌屬菌株AP79、AP193L和ABOl提取質(zhì)粒DNA。將含有質(zhì)粒pC194的枯草芽孢桿菌1E17用作陽(yáng)性對(duì)照。通過(guò)Chef-DR II脈沖場(chǎng)電泳系統(tǒng)(Bio-Rad, Hercules, CA)分析提取的DNA。脈沖時(shí)間為I至15秒，以6V/cm進(jìn)行15小時(shí)。用溴化乙錠對(duì)凝膠進(jìn)行染色，使用AlphaImager HP凝膠記錄系統(tǒng)(ProteinSimple, Santa Clara, CA)進(jìn)行顯現(xiàn)。
[0125]抗牛.素抗件分析。按照National Committee for Clinical LaboratoryStandards (CLSI2012)概括的方法，通過(guò)紙片擴(kuò)散測(cè)試(disc diffusion test)測(cè)定芽孢桿菌屬菌株AP79、AP193L和ABOl對(duì)羧芐西林、氨芐西林、大觀霉素、苯唑西林、萬(wàn)古霉素、頭孢菌素、新生霉素、磺胺嘧啶、阿米卡星、紅霉素、新霉素、青霉素、氯霉素、磺胺甲噁唑、諾氟沙星、慶大霉素和環(huán)丙沙星的易感性。將每一個(gè)菌株的對(duì)數(shù)期培養(yǎng)物稀釋至約I X IO8至2 X 108CFU/ml的濃度(McFarland標(biāo)準(zhǔn)0.5)。隨后使用棉簽將接種物接種至Mueller-Hinton瓊脂板上。將抗生素浸透的圓片(BD Biosciences)置于接種的板上,在37°C溫育18小時(shí)后，測(cè)量生長(zhǎng)抑制區(qū)的直徑。重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，計(jì)算抑制區(qū)的平均直徑。
[0126]統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。將完全隨機(jī)化的設(shè)計(jì)用于該研究。數(shù)據(jù)表示為平均值土標(biāo)準(zhǔn)誤差(SE)。將攻擊數(shù)據(jù)經(jīng)歷SAS9.2的方差分析。通過(guò)杜凱氏差距檢驗(yàn)(Tukey’s range test)來(lái)檢驗(yàn)平均值之間的差異，當(dāng)獲得小于0.05的概率(P)值時(shí)，差異被認(rèn)為是顯著的。
[0127]
[0128]芽孢桿菌屬分離株的表征。從土壤或鯰魚(yú)腸分離的、顯示抗鮰愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的抑制性活性的每一個(gè)芽孢桿菌屬菌株能夠形成內(nèi)生孢子。對(duì)每一個(gè)純的芽孢桿菌屬培養(yǎng)物進(jìn)行核糖體分型，結(jié)果顯示大多數(shù)芽孢桿菌屬菌株在枯草芽孢桿菌組內(nèi)(包括解淀粉芽孢桿菌在內(nèi))，并且兩個(gè)短小芽孢桿菌菌株也在集合中。由于不能基于生物化學(xué)或16S rRNA基因序列數(shù)據(jù)確定性地區(qū)分枯草芽孢桿菌或解淀粉芽孢桿菌分離株，因此，在一些情況下可獲得基因組序列數(shù)據(jù)(即，對(duì)于菌株AP18、AP143、AP193L和AP254L)，并且將其用于系統(tǒng)分類(phylogenetic classification)。對(duì)于這些菌株的每一個(gè)，與最密切相關(guān)的芽孢桿菌屬菌株基因組具有大于80%的同一性，這提供了種系發(fā)生親緣關(guān)系(phylogenetic affiliation)的明確證據(jù)。在選擇用于基因組測(cè)序的菌株中，唯有菌株AP193L是僅基于其抗水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體的拮抗性和在減少因ESC引起的死亡方面的效力而選擇的。這些基因組的完全注釋超出了本研究的范圍，但這些基因組序列確實(shí)提供了系統(tǒng)發(fā)生的客觀評(píng)估，并且顯示了可與鯰魚(yú)病原體的生物防治相關(guān)的抗微生物合成的推定的生物合成途徑(數(shù)據(jù)未顯示)。
[0129]芽孢桿菌屬菌株的抗微生物活性。從鯰魚(yú)腸分離的芽孢桿菌屬菌株ABOl顯示顯著的抗鮰愛(ài)德華氏菌的抗微生物活性。來(lái)自土壤來(lái)源的芽孢桿菌屬菌株的集合的50個(gè)菌株顯示顯著的抗鮰愛(ài)德華氏菌的拮抗性。所有50個(gè)芽孢桿菌屬菌株還顯示抗鮰愛(ài)德華氏菌R-4383和鮰愛(ài)德華氏菌Alg-08-200的抑制活性。總共21個(gè)芽孢桿菌屬菌株顯示抗鮰愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌的有力的抗生素活性(例如，圖1)。測(cè)試21個(gè)選擇的芽孢桿菌屬菌株的抗水產(chǎn)養(yǎng)殖中的多種病原體的活性。所有菌株都具有抗多種鯰魚(yú)病原體(包括革蘭氏陰性和革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌以及卵菌綱水霉屬)的拮抗性。芽孢桿菌屬菌株AB01、AP193L、AP219和AP301顯示抗所有測(cè)試的病原體的抗微生物活性(表I)。同樣地，所有5個(gè)測(cè)試的芽孢桿菌屬菌株(AP79、AP143、AP193L、AP254L和AB01)顯示顯著的抗鮰愛(ài)德華氏菌NLF33的拮抗活性。
[0130]芽孢桿菌屬菌株在斑點(diǎn)叉尾鮰的腸中的存活和保留時(shí)間。從腸回收施用的細(xì)菌。對(duì)于菌株AB01，AP76, AP77, AP79, AP143和AP254L，在腸中觀察到超過(guò)107CFU/g的引入的芽孢桿菌(圖4)。對(duì)于菌株AP18、AP280和AP303，回收的細(xì)菌的量相對(duì)較低，并且它們?cè)谶M(jìn)一步的調(diào)查中被消除。從對(duì)照組中沒(méi)有回收到所述21個(gè)芽孢桿菌屬菌株的任一個(gè)菌株。在所有情況下，從代表性菌落測(cè)定的16S rRNA基因序列匹配添加至鯰魚(yú)飼料的各個(gè)芽孢桿菌屬菌株的16S rRNA基因序列。對(duì)于被觀察到具有高CFU/g腸計(jì)數(shù)的一些芽孢桿菌屬菌株(例如，菌株ABOl和AP76)，在10_6和10_7的稀釋度上，觀察到對(duì)應(yīng)于各自芽孢桿菌屬菌落形態(tài)學(xué)的唯一菌落。
[0131]攻擊研究。在第一個(gè)攻擊中，對(duì)照組的平均死亡率為98.0%。芽孢桿菌屬菌株AP143或ABOl的處理組與對(duì)照相比較，顯示顯著下降的死亡率(P〈0.05)，對(duì)于這些菌株，死亡率分別為83.1%、84.8%和79.6%。在兩個(gè)所述菌株之間不存在顯著差異。芽孢桿菌屬菌株AP79、AP193L或AP254L的處理組(死亡率分別為89.0%、95.0%和93.7%)相較于對(duì)照未顯示顯著的差異(圖5A，表2)。對(duì)于第二個(gè)攻擊，對(duì)照組中41.3%的魚(yú)死亡。處理組中的死亡率為35.0%至46.3%，在任何處理組與對(duì)照之間未觀察到顯著差異(圖5B，表2)。
[0132]在條紋鯰魚(yú)攻擊實(shí)驗(yàn)中，喂食菌株AP79孢子改良飼料的處理組具有最低(9.7%)的累積死亡率并且與對(duì)照顯著不同(P〈0.05)。喂食菌株AP193L-改良飼料的處理組具有
30.6%的死亡率；然而，應(yīng)當(dāng)指出，在攻擊的第4天在單個(gè)養(yǎng)魚(yú)缸中記錄了大部分死亡數(shù)目。喂食菌株AP254L和ABOl的鯰魚(yú)分別具有54.2%和56.9%的死亡率，然而對(duì)照組具有70.8%死亡率(圖5C，表2)。
[0133]質(zhì)粒和抗生素抗性研究。通過(guò)PFGE進(jìn)行所選擇的芽孢桿菌屬菌株的質(zhì)粒DNA含量的分析，我們未觀察到任何質(zhì)粒在這4個(gè)菌株內(nèi)的存在，但陽(yáng)性對(duì)照確實(shí)顯示質(zhì)粒PC194的存在(數(shù)據(jù)未顯示)?？股匾赘行缘脑u(píng)估表明，所有4個(gè)菌株都在不同的程度上對(duì)所有測(cè)試的抗生素易感。它們?nèi)紝?duì)羧芐西林、頭孢菌素、磺胺甲噁唑和環(huán)丙沙星高度易感(>25_的抑制區(qū)直徑)。氨芐西林、青霉素、萬(wàn)古霉素、新生霉素、阿米卡星、紅霉素、新霉素、氯霉素、諾氟沙星和慶大霉素也有效地抑制它們的生長(zhǎng)(20-25_的抑制區(qū))，而大觀霉素，苯唑西林，磺胺嘧啶顯示中度抑制(15-20_抑制區(qū))。這4個(gè)菌株顯示非常相似的抗菌譜，4個(gè)菌株內(nèi)的抑制區(qū)直徑的變化小于各個(gè)測(cè)試的抗生素的平均直徑的10%。
[0134]討論
[0135]本研究的結(jié)果表明，枯草芽孢桿菌組群內(nèi)的特定菌株在鯰魚(yú)水產(chǎn)養(yǎng)殖中顯示用于疾病控制的前景。在先前的研究中，將芽孢桿菌屬培養(yǎng)物施用至池塘水導(dǎo)致改善的魚(yú)存活和產(chǎn)量(Queiroz和Boydl998)。然而，用于后一研究的芽孢桿菌屬培養(yǎng)物的抗鮰愛(ài)德華氏菌或其它水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體的拮抗性從未進(jìn)行過(guò)評(píng)價(jià)。此外，來(lái)自該商業(yè)產(chǎn)品的芽孢桿菌屬培養(yǎng)物降低因ESC引起的死亡率或疾病癥狀的能力未進(jìn)行過(guò)評(píng)價(jià)，并且是復(fù)雜的(由于在實(shí)驗(yàn)期間，鯰魚(yú)被增生性腮病感染)。本研究首次選擇益生菌來(lái)控制鯰魚(yú)的ESC和其它病原體，且首次評(píng)價(jià)它們通過(guò)飼料施用產(chǎn)生的生物防治效率。將芽孢桿菌屬的種用于本研究，因?yàn)樗鼈兛梢砸枣咦有问绞┯?，從而有利于?jiǎn)單貯存和施用，并且先前已研究了許多芽孢桿菌屬菌株的拮抗植物的細(xì)菌和/或真菌病原體的能力(Klo印per等人，2004)。
[0136]Gatesoupe (1999)得出了這樣的結(jié)論:用于水產(chǎn)養(yǎng)殖的益生菌應(yīng)當(dāng)拮抗病原體，定殖在腸中，以及增加宿主對(duì)病原體的抗性。理想地，應(yīng)當(dāng)通過(guò)考慮所有3個(gè)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)選擇益生菌。然而，難以就第二和第三標(biāo)準(zhǔn)在大量候選細(xì)菌中評(píng)價(jià)潛在的益生菌菌株。因此，體外抗微生物活性是籍以評(píng)價(jià)大量菌株的首要標(biāo)準(zhǔn)，未顯示拮抗活性的候選細(xì)菌菌株在進(jìn)一步的研究中被消除。本研究項(xiàng)目的主要目的是，鑒定可用于控制鮰愛(ài)德華氏菌、嗜水氣單胞菌以及鯰魚(yú)的其它細(xì)菌和卵菌綱病原體的細(xì)菌菌株。由于細(xì)菌病原體鮰愛(ài)德華氏菌和嗜水氣單胞菌造成目前在鯰魚(yú)水產(chǎn)養(yǎng)殖中觀察到的大部分死亡率，因此芽孢桿菌屬菌株抑制這兩種病原體生長(zhǎng)的能力是最重要的，并且只有能夠抑制兩種病原體的菌株才可被選擇來(lái)在養(yǎng)魚(yú)缸疾病攻擊中進(jìn)行測(cè)試。
[0137]益生菌菌株在其宿主內(nèi)或其宿主上的定殖和存活的能力也是菌株選擇的重要標(biāo)準(zhǔn)。然而，在許多情況下，益生菌可能不會(huì)永久地定殖在胃腸道中，而相反地達(dá)到持久的過(guò)渡狀態(tài)(Robertson2000; Irianto和Austin，2002)。如果通過(guò)食物連續(xù)或半連續(xù)地人工引入細(xì)胞，即使是短暫居留的細(xì)菌也可有效地介導(dǎo)疾病的生物防治(Gournier-Chateau等人，1994;GateS0upel999)。在用芽孢桿菌屬孢子改良飼料喂食后3天，從鯰魚(yú)腸回收了高群體水平的幾個(gè)芽孢桿菌屬菌株。對(duì)于在腸中具有高計(jì)數(shù)的芽孢桿菌屬菌株而言，與應(yīng)用的芽孢桿菌屬菌株具有相同的形態(tài)學(xué)菌落占據(jù)了 TSA板的大部分，代表性菌落的核糖體分型確認(rèn)，它們的身份為應(yīng)用的芽孢桿菌屬菌株。在關(guān)于鮰愛(ài)德華氏菌特異性噬菌體在斑點(diǎn)叉尾鮰的腸內(nèi)的保留能力的先前研究中，觀察到，在喂食后72小時(shí)，在腸樣品內(nèi)未檢測(cè)到噬菌體(Carrias2011)。這表明，任何惰性顆粒在喂食后72小時(shí)將被從鯰魚(yú)腸中消除，并且在該時(shí)幀后檢測(cè)到的細(xì)菌菌株可具有一定程度的腸保留能力?？紤]到腸中細(xì)菌群體水平在停止喂食含孢子膳食后應(yīng)當(dāng)下降，在喂食方案過(guò)程中達(dá)到的芽孢桿菌屬菌株的最高水平(CFU/g腸組織)可以更高。此處的細(xì)菌群體水平(對(duì)于大部分菌株，106-107CFU/g)總體上與先前牽涉魚(yú)的研究一致(J5boril等人,1997;Gildberg和Mikkelsenl998;Robertson等人，2000; Irianto和Austin，2002)。這些結(jié)果表明，本研究中評(píng)價(jià)的一些芽孢桿菌屬菌株可在鯰魚(yú)胃腸道內(nèi)保留至少3天。然而，在該點(diǎn)上保留的程度和定殖腸粘膜的能力對(duì)于每一個(gè)菌株都是未知的。將進(jìn)行更詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)來(lái)評(píng)價(jià)特定芽孢桿菌屬菌株在鯰魚(yú)腸內(nèi)的定殖和/或保留，從而幫助理解芽孢桿菌屬菌株的生物防治機(jī)制，以及指導(dǎo)喂食芽孢桿菌的持續(xù)時(shí)間和時(shí)間安排。將來(lái)的研究還將檢查每一個(gè)芽孢桿菌屬菌株在水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體不存在的情況下對(duì)腸微生物叢以及魚(yú)的健康和生長(zhǎng)的影響。
[0138]在一個(gè)ESC攻擊研究中，在對(duì)照組中觀察到極高死亡率(98.0%)，這可能已影響由芽孢桿菌屬菌株提供的保護(hù)作用的程度。理想地，養(yǎng)魚(yú)缸疾病攻擊將導(dǎo)致60%-70%的死亡率，這更精確地模擬了 ESC的天然發(fā)展。高死亡率可能是在攻擊過(guò)程中維持靜態(tài)系統(tǒng)導(dǎo)致的，其中鮰愛(ài)德華氏菌長(zhǎng)期保持在缸中。盡管在該攻擊中觀察到更高的死亡率，但兩個(gè)芽孢桿菌屬菌株(AP143和AB01)為斑點(diǎn)叉尾鮰提供了顯著保護(hù)作用。應(yīng)注意的是，顯示芽孢桿菌屬菌株的保護(hù)作用的兩個(gè)攻擊是在每天進(jìn)行20-30分鐘水交換的靜態(tài)系統(tǒng)中進(jìn)行的，然而無(wú)顯著作用的攻擊是在攻擊后每天沖洗5-8h的系統(tǒng)中進(jìn)行的。這表明，更加池塘樣的環(huán)境(其中益生菌保留在水，和潛在地，保留在魚(yú)的皮膚和腮中)可能更有助于有效的疾病生物防治。此外推斷，在較低劑量的鮰愛(ài)德華氏菌(在水產(chǎn)養(yǎng)殖池塘中鯰魚(yú)通常暴露于較低劑量的鮰愛(ài)德華氏菌)的情況下，由芽孢桿菌屬菌株提供的生物防治程度將具有甚至更大的量級(jí)。
[0139]對(duì)于所有芽孢桿菌屬菌株，使用條紋鯰魚(yú)的攻擊研究顯示，降低水平的因鮰愛(ài)德華氏菌而導(dǎo)致的死亡率，特別地，相較于70.8%死亡率的對(duì)照水平，菌株AP79的使用使死亡率降至僅9.7%。有趣地，測(cè)試的芽孢桿菌屬菌株的相對(duì)生物防治活性在兩個(gè)鯰魚(yú)物種中是不同的。這可反映出芽孢桿菌屬菌株與它們各自的宿主之間的相互作用的生物學(xué)上的重大差異。此外，在宿主、病原體和益生菌之間可存在獨(dú)特的三方相互作用，該作用可受環(huán)境因素影響。很顯然，需要進(jìn)行更多的研究來(lái)理解宿主、病原體和益生芽孢桿菌屬菌株之間的復(fù)雜相互作用，和如何操縱環(huán)境來(lái)實(shí)現(xiàn)疾病的最佳生物防治。需要進(jìn)行使用具有靜態(tài)條件的養(yǎng)魚(yú)缸疾病模型的進(jìn)一步研究，以最優(yōu)化使用性能最佳的芽孢桿菌屬菌株的用于攻擊的重要參數(shù)，例如劑量和時(shí)間安排，隨后需要在池塘規(guī)模上進(jìn)行研究以評(píng)價(jià)水產(chǎn)養(yǎng)殖池糖生態(tài)系統(tǒng)內(nèi)的生物防治效力。
[0140]被人直接消費(fèi)的活細(xì)菌的安全性要求之一是，不存在對(duì)臨床上重要的抗生素的任何獲得性抗性(SOTOkulOva2008)。雖然本研究中使用的芽孢桿菌屬菌株不直接被人消費(fèi)，但它們可能不經(jīng)意地被消費(fèi)，因?yàn)樗鼈兊乃拗魇桥囵B(yǎng)來(lái)用作食物的。因此，分析益生菌菌株的抗生素抗性以及區(qū)分天然抗性(其為物種的表型特征之一)與獲得性(即，可轉(zhuǎn)移的)抗性(其與質(zhì)粒的存在相關(guān))是非常重要的。此外，致病性和腸毒素的產(chǎn)生與質(zhì)粒密切相關(guān)(Pannucci等人，2002)。所選擇的芽孢桿菌屬菌株都不具有任何質(zhì)粒，并且各個(gè)菌株對(duì)測(cè)試的廣譜的抗生素易感，這確保它們不能接合轉(zhuǎn)移任何可能賦予抗生素抗性的質(zhì)粒。[0141]對(duì)各個(gè)芽孢桿菌屬菌株表達(dá)的次級(jí)代謝物的了解可促進(jìn)菌株和菌株“混合物”的合理選擇，從而增強(qiáng)抗水產(chǎn)養(yǎng)殖病原體的生物防治效力。具有相似的抗水產(chǎn)養(yǎng)殖和植物病原體的抗生特征的芽孢桿菌屬菌株可被分類在一起(Kloepper等人,2004)。由來(lái)自不同抗生組的菌株產(chǎn)生的抗微生物化合物應(yīng)當(dāng)是不同的。推斷來(lái)自不同抗生組的菌株的組合因通過(guò)不同機(jī)制產(chǎn)生多種抗生素化合物作用而提供甚至更優(yōu)異的疾病生物防治。可擴(kuò)散的抗微生物化合物明確地參與在軟瓊脂覆層中和在擴(kuò)散測(cè)試中觀察到的體外拮抗活性。相較于增強(qiáng)魚(yú)免疫能力和/或病原體拮抗性的競(jìng)爭(zhēng)排斥機(jī)制，用于體內(nèi)生物防治的次級(jí)代謝產(chǎn)物的相對(duì)重要性還不清楚。將來(lái)的研究將調(diào)查特定抗生素化合物對(duì)一些芽孢桿菌屬菌株的生物防治活性的相對(duì)貢獻(xiàn)。
[0142]總之，鑒定了一系列芽孢桿菌屬菌株，所述菌株拮抗鯰魚(yú)的主要病原體，并且當(dāng)在飼料上施用以分別控制ESC和BNP時(shí)，對(duì)斑點(diǎn)叉尾鮰和條紋鯰魚(yú)是有益的。這些細(xì)菌在水產(chǎn)養(yǎng)殖中潛在地可用作當(dāng)前使用的抗微生物化合物的具有成本效益的替代品。
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[0218]本文中引用了許多專利和非專利參考資料。所引用的參考資料通過(guò)引用整體并入本文。當(dāng)本說(shuō)明書(shū)中的術(shù)語(yǔ)定義與引用的參考資料中的術(shù)語(yǔ)定義不一致時(shí)，應(yīng)基于本說(shuō)明書(shū)中的定義來(lái)解釋術(shù)語(yǔ)。
[0219]
【權(quán)利要求】
1.一種用于水生動(dòng)物的飼料組合物，其包含芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株。
2.權(quán)利要求1的組合物，其中所述芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株是具有包含SEQID N0:l、2或3的16S rDNA序列或包含與SEQ ID NO: 1、2或3具有至少約90%的序列同一性的16SrDNA序列的芽孢桿菌屬的種。
3.權(quán)利要求1的組合物，其中所述芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株對(duì)一種或多種選自羧芐西林、氨芐西林、大觀霉素、苯唑西林、萬(wàn)古霉素、頭孢菌素、新生霉素、磺胺嘧啶、阿米卡星、紅霉素、新霉素、青霉素、氣霉素、橫胺甲嚼卩坐、諾氣沙星、慶大霉素和環(huán)丙沙星的抗生素易感。
4.權(quán)利要求1的組合物，其中所芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株選自在登錄號(hào)NRRLB-50745、NRRL B-5074UNRRL B-50742 和 NRRL B-50743 以及 NRRL B-50745 下保藏的菌株。
5.權(quán)利要求1的組合物，其中所述飼料組合物是用于養(yǎng)殖的魚(yú)的飼料組合物。
6.權(quán)利要求1的組合物，其中所述芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株以至少約104CFU/g飼料的濃度存在。
7.權(quán)利要求1的組合物，其包含芽孢桿菌屬的單個(gè)菌株。
8.權(quán)利要求1的組合物，其包含菌株的混合物。
9.權(quán)利要求1的組合物，其中所述芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株抑制一種或多種選自嗜水氣單胞菌、鮰愛(ài)德華氏菌、遲鈍愛(ài)德華氏菌、柱狀黃桿菌、海豚鏈球菌和魯氏耶爾森氏菌的細(xì)菌的生長(zhǎng)。
10.權(quán)利要求1的組合物，其中所述芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株抑制卵菌綱真菌水霉屬的生長(zhǎng)。
11.權(quán)利要求1的組合物，其還包含感染鮰愛(ài)德華氏菌的噬菌體。
12.權(quán)利要求11的組合物，其中所述噬菌體是OeiAU。
13.權(quán)利要求1的組合物，其還包含選磺胺地托辛、奧美普林和氟苯尼考的試劑。
14.權(quán)利要求1的組合物，其還包含鮰愛(ài)德華氏菌的減毒菌株。
15.一種用于治療或預(yù)防動(dòng)物的疾病的方法，其包括給所述動(dòng)物施用權(quán)利要求1。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述動(dòng)物是養(yǎng)殖的魚(yú)。
17.權(quán)利要求15的方法，其中所述疾病是腸敗血癥。
18.—種殺微生物組合物，其被配制用于給水生環(huán)境施用并且包含有效量的用于治療或預(yù)防腸敗血癥的芽孢桿菌屬的產(chǎn)孢菌株。
19.權(quán)利要求18的組合物，其中所述水生環(huán)境是飼養(yǎng)水生動(dòng)物的環(huán)境。
20.一種治療或預(yù)防水生動(dòng)物的腸敗血癥的方法，包括給飼養(yǎng)所述水生動(dòng)物的環(huán)境施用權(quán)利要求18的組合物。
【文檔編號(hào)】A61K35/74GK103826476SQ201280027776
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2012年4月30日 優(yōu)先權(quán)日:2011年4月29日
【發(fā)明者】J·特休恩, M·萊爾斯, J·克洛波 申請(qǐng)人:奧本大學(xué)