用于癌癥中使用的抗il-1r1抑制劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及阻斷或抑制白介素-1受體1(IL-1R1)、IL-1β與IL-1R1的相互作用或IL-1R1和白介素-1受體輔助蛋白(IL-1RaCP)之間的相互作用的多肽。本發(fā)明具體涉及特異性靶向存在于腫瘤細胞、癌干細胞和對化療或放療耐受的癌干細胞上的IL-1R1的治療性多肽。本發(fā)明具體涉及表達所述抑制劑結合的IL-1R1的癌干細胞(CSC)。最后，本發(fā)明涉及組合治療，其包括借助標準化療或放療殺死致瘤分化的癌細胞，在此之前或之后，應用特異性靶向CSC且剝離具有其生成癌細胞子代能力的腫瘤的IL-1R1抑制劑。
【專利說明】用于癌癥中使用的抗IL-1R1抑制劑
發(fā)明領域
[0001]本發(fā)明涉及阻斷或抑制白介素-1受體I (IL-1Rl)、IL-1 P與IL-1Rl的相互作用或IL-1Rl和白介素-1受體輔助蛋白(IL-1RaCP)之間的相互作用的多肽。本發(fā)明具體涉及特異性靶向存在于腫瘤細胞、癌干細胞和對化療或放療耐受的癌干細胞上的IL-1Rl的治療性多肽。本發(fā)明具體涉及表達所述抑制劑結合的IL-1Rl的癌干細胞(CSC)。最后，本發(fā)明涉及組合治療，其包括借助標準化療或放療殺死正常分化的癌細胞，在此之前或之后，應用特異性靶向CSC的IL-1Rl抑制劑。
[0002]發(fā)明背景
腫瘤的細胞組成是異質的。如今已知，不是腫瘤中的每個細胞都是致瘤的。只有小亞群能夠重新形成新的腫瘤。該細胞群體能夠自我更新和產(chǎn)生異常分化的子代。由于這些功能與干細胞共享，所以該群體被命名為腫瘤干細胞(CSC) [Reya, T.，等人，Nature, 2001.414 (6859): p.105-11]，也被稱為腫瘤起始細胞。
[0003]近年來，構成腫瘤的細胞塊(bulk of cells)源自癌干細胞(CSC)亞群的概念已獲得廣泛的接受。CSC與腫瘤細胞的大群體的不同在于當它們以少量植入到實驗動物中時能夠成功地接種新的腫瘤，這樣做在體內(nèi)可以再生超過數(shù)代，且概括初始腫瘤的形態(tài)。相反，非CSC群體在體內(nèi)不能起始腫瘤生長，甚至當以高數(shù)量植入?yún)肌Ｓ捎贑SC亞群根據(jù)定義代表能夠起始新的腫瘤生長的唯一腫瘤細胞，那么應當預期CSC在轉移形成中發(fā)揮核心作用。
[0004]基于鑒定CSC的環(huán)境和腫瘤類型，CSC主要占腫瘤群體的1-10%。它們可操作地由以下特性來定義:(i)起始腫瘤和腫瘤増殖的選擇性能力，(ii)自我更新的能力，和
(iii)通過細胞分化產(chǎn)生更成熟的 非干細胞子代的能力。此外，CSC的特征在于對化療和放療的耐受性的増加。因此，它們主要是靜態(tài)或休眠的，從而避免了靶向增殖性腫瘤細胞的常規(guī)治療方案。CSC被認為是轉移的來源，因為它們活躍地貫穿機體遷移，在骨髄中的成骨細胞生境中停留，且歸巢到它們可以重新形成新的腫瘤的各個器官廠7>?取鞏A.和Viestler, Nat Clin Pract Oncol, 2008.5(6): p.337-47]。
[0005]歸巢主要由使這些細胞朝向趨化因子信號梯度遷移的表面分子所介導。因此，細胞因子和趨化因子信號例如基質衍生因子(SDF)-1 /趨化因子受體(CXCR)-4，或骨調(diào)素/CD44或類似信號被認為在CSC中發(fā)揮重要作用廠Gofer, A尤和ふZ.Allan, J Cell MolMedf 2008.12(2): p.辦7。作為邏輯結果，當這些細胞逃避免疫監(jiān)瞀時，貫穿機體的遷移過程僅僅是可能的Mo/?, T.和/Z Frank, Ann N Y Acad Sci，2009.1176:p.154-69'。在實體瘤中的CSC上已經(jīng)鑒定了幾種細胞表面標志物，諸如⑶133+、⑶44+、ABCB5+，然而在血液系統(tǒng)惡性腫瘤諸如AML和多發(fā)性骨髄瘤中，發(fā)現(xiàn)了上述所有⑶34+、CD38+。
[0006]當分離或富集的細胞注入免疫缺陷的小鼠中，并在其中形成初始腫瘤的新的擬表型時，定義癌干細胞的金標準仍然在體內(nèi)給出。初始擬表型含有與初始腫瘤相同量的CSC，盡管當連續(xù)重新移植腫瘤時，可以繁殖略微富集。當在超低結合(ULA)板中未粘附、無血清且在添加某些細胞因子如EGF和/或bFGF的情況下生長時，CSC可以形成3維(3D)結構，所述3維(3D)結構與胚胎干細胞(ESC)形成的球體相似，被稱為腫瘤球。喪失粘附后，分化細胞死于失巢凋亡(分離誘導的細胞凋亡)，因此，腫瘤球測定法富集具有致瘤潛能的CSC和未成熟祖細胞/--?體 G.和私 51 Wicha, J Mammary Gland Biol Neoplasia, 2005.10(1): p.人腫瘤球形成后，緊湊的聚集體可以通過使用酶混合物進行分離，且進一
步重新鋪板。連續(xù)重新鋪板在體外模擬自我更新特性，且暗示鋪板的細胞的干細胞能力。
[0007]常規(guī)腫瘤治療最初可以通過殺死具有有限自我更新和増殖能力的主要腫瘤塊群體而縮小腫瘤，然而根據(jù)CSC假設，耐受性CSC可以在治療后維持活力，且重建腫瘤生長，導致復發(fā)和腫瘤疾病進展。
[0008]與之相比，指向且靶向CSC的新療法可以降低腫瘤生成癌細胞后代的能力，其抑制腫瘤生長，且可以導致腫瘤退化。優(yōu)選的CSC目標和療法包含與生理干細胞相反的惡性細胞中優(yōu)先誘導或有效的那些分子或途徑。
[0009]癌癥治療的效率經(jīng)常受腫瘤對細胞毒性劑或電離輻射的內(nèi)在或獲得的耐受性的損害。
[0010]因此，存在開發(fā)新的有效的通過涉及CSC來治療癌癥疾病的策略。
[0011]IL-1細胞因子家族由三個成員(ILla (ILIA)、IL1@ (IL-1B)和ILl受體拮抗劑(ILlRA)，其各自由獨立的基因編碼)組成。這些基因產(chǎn)生前體蛋白，所述前體蛋白被蛋白水解切割以產(chǎn)生活性細胞因子。細胞因子的兩種激動性形式是IL-1a和IL-P。IL-1a主要是膜結合的，很少在循環(huán)中發(fā)現(xiàn)，然而，相反，IL-P主要是分泌的。IL-1a和IL-3在IL-1響應細胞中介導相同的下游效應。第三個細胞因子成員，IL-1RA，無法激活下游的信號傳遞，且競爭性地抑制IL-1a和IL-P的活性。
[0012]IL-1 a、IL-1 P和IL-1RA都通過結合至I型ILl受體(ILlRl)而介導其作用。IL-1a或IL-P結合后，ILlRl與IL1R3(也稱為ILl受體輔助蛋白(ILlRAcP))結合，導致形成活性信號傳遞復合物，所述活性信號傳遞復合物誘導包含IRAKs、MAPK p38、p42/44、ERK、JNK、STAT3的磷酸化級聯(lián)且活化NF- k B。已經(jīng)將IL1R2鑒定為不促進細胞內(nèi)信號傳遞的誘餌受體[I]。IL-1應答的幅度受途徑中拮抗和激動作用因子的平衡的嚴格調(diào)控。
[0013]炎癥應答是包含多種細胞類型和細胞因子的復雜信號傳遞級聯(lián)。對病原體的炎癥應答通常由巨噬細胞起始，在其活化后所述巨噬細胞分泌IL-1 ^，所述IL-1 ^充當負責觸發(fā)對感染的早期生理應答的急性期細胞因子。IL-1 P位于炎癥級聯(lián)的頂點，所述炎癥級聯(lián)包括產(chǎn)生各種額外的細胞因子和趨化因子包括IL8、IL6、MCP-1和VEGF。此外，IL-1驅動的Cox-2活化導致PGE2產(chǎn)生的増加。在正常狀態(tài)下，炎癥持續(xù)，直到感染根除。如果該反應受損，慢性炎癥可以發(fā)生，且與癌癥緊密相連。
[0014]隨著腫瘤進展，它們聚集炎癥細胞的致密浸潤物，所述炎癥細胞包括腫瘤相關巨噬細胞(TAM)和腫瘤浸潤性淋巴細胞(TIL)以及基質成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞。這些細胞類型生成支持腫瘤生長、轉移和新血管生成的腫瘤微環(huán)境。該群體(orchestra)中的主要起作用者是IL-1 3。
[0015]對病原體的正常應答包括細菌副產(chǎn)物樣LPS(是IL-1 P的強烈誘導劑)活化IL-1 P。LPS的感受細胞是分泌IL-1 P的巨噬細胞。表達ILlRl的細胞如內(nèi)皮細胞(ECs)、上皮細胞、成纖維細胞、軟骨細胞和淋巴細胞對IL-1 ^應答，且開始分泌促炎介質IL-1 ^自身、IL6、IL8、MCP-UMKP-1和Cox_2。為了控制該過程和調(diào)節(jié)體內(nèi)平衡，存在幾種ILlRl的生理抑制劑，特別是ILl受體拮抗劑和IL1R2受體，其作為誘餌受體起作用。右側小圖。促腫瘤炎癥是復雜腫瘤微環(huán)境(由基質成纖維細胞、腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)和腫瘤細胞自身組成)的產(chǎn)物。所有3種細胞類型都分泌IL-1 P和在它們的膜上表達IL-1a。ILl響應的細胞是腫瘤細胞、TAMs、成纖維細胞、ECs和淋巴細胞。這導致各種促炎蛋白如IL6、IL8、VEGF、MCP-1和C0X-2的表達。綜合起來，這些介質通過誘導支持腫瘤生長和免疫抑制的STAT3支持癌癥的發(fā)病機制。中性粒細胞的招募、C0X-2的表達和MCP-1還支持免疫抑制，且VEGF驅動腫瘤血管生成。
[0016]IL-1 P結合至ILlRl后，ILlRl與ILlR輔助蛋白(ILlRaCP)異源二聚化，且觸發(fā)包括ILlR相關激酶(IRAK) ,MAPK和ERK/JNK的磷酸化級聯(lián)，最終轉錄激活STAT3和NF- k B。從而促炎分子表達，且最終分泌，其抑制抗腫瘤免疫、促進腫瘤血管形成、且增強腫瘤基質。
[0017]因此，IL-1與IL-1Rl的相互作用已經(jīng)牽連在幾種疾病、優(yōu)選免疫和炎性疾病、諸如關節(jié)炎(例如類風濕關節(jié)炎、骨關節(jié)炎)和炎性腸病的發(fā)病機制中。某些試劑，包括結合IL-1Rl和中和其活性(例如，IL-1Ra)的單克隆抗體已被證明是某些炎癥狀況的有效治療劑，所述炎癥狀況諸如乳糜瀉、克羅恩??；潰瘍性結腸炎；特發(fā)性胃輕癱；胰腺炎，包括慢性胰腺炎；急性胰腺炎，炎癥性腸病和潰瘍，包括胃和十二指腸潰瘍，和中度至重度活動性類風濕關節(jié)炎，其可以用抗IL-1Rl抗體AMG 108 (Amgen)進行治療。
[0018]其他針對IL-1 a或P (諸如CDP-484，Celltech)或針對IL-1受體(例如，AMG-108, Amgen ;R_1599, Roche)、或 IL-lRa (anakinra, Amgen)的嵌合、人源化或人抗體是眾所周知的。
[0019]如提到的，在治療炎癥性疾病中使用這些抗體中的大部分。在一些情況下，據(jù)報道，這些抗IL-1Rl抗體可用于治療淋巴增生性病癥，包括自身免疫性淋巴增生綜合征(ALPS)、慢性成淋巴細胞性白血病、毛細胞白血病、慢性淋巴性、白血病、伯基特淋巴瘤、組織細胞淋巴瘤、和霍奇金病。然而，沒有證據(jù)得到證明。此外，沒有關于使用IL-1Rl抑制劑用于治療源自非淋巴瘤的癌癥的可靠報道。
[0020]發(fā)明概述
本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，IL-1Rl在化療耐受和/或放療耐受的癌細胞(優(yōu)選癌干細胞(CSC))的表面上表達或過表達,然而該受體在正常分化的增殖性非致瘤腫瘤細胞或對化療劑和/或放射毒性劑不耐受或不是CSC的腫瘤細胞上不表達或只有輕微表達。
[0021]根據(jù)本發(fā)明，在專門體外系統(tǒng)(球測定法)中分析來自不同癌癥患者(諸如非小細胞肺癌(NSCLC)和結腸直腸癌(CRC)患者)的原發(fā)性CSC，并將它們與在分化條件下生長的CSC進行比較。此外，本發(fā)明人通過高劑量化療處理從NSCLC細胞系選擇耐受性腫瘤細胞。他們將細胞因子ILlP和其各自受體鑒定為差異調(diào)芐基因。ILlP是在各種細胞類型上表現(xiàn)其信號的細胞因子。在腫瘤背景中，它由腫瘤細胞產(chǎn)生且通過作用于內(nèi)皮細胞、成纖維細胞和浸潤性免疫細胞而影響腫瘤微環(huán)境。由此，它誘導ー些蛋白包括例如基質金屬蛋白酶、VEGF, bFGF、IL8、IL6和其他的表達。下游過程通過干擾免疫監(jiān)瞀和支持腫瘤生長和轉移而產(chǎn)生保護。借助單克隆抗體或小化學化合物對IL-1Rl的抑制可以降低腫瘤生長(通過使用腫瘤球顯示)，這與CSC表型的減少相關。由此表明，治療性抗體對IL-1Rl的抑制可以用來靶向合適的腫瘤且用于治療各自的腫瘤疾病。[0022]本發(fā)明提供以下結果:
1.將IL1/IL1R1信號傳遞鑒定為CSC相關途徑。
[0023]2.1L-1 ^和ILlRl基因的表達與癌癥患者中無腫瘤和整體存活的減少相關。
[0024]3.1LlRl在原發(fā)性CRC和NSCLC腫瘤細胞上表達，且在通過連續(xù)腫瘤球繁殖富集CSC后上調(diào)。
[0025]4.1LlRl在源自人原發(fā)性腫瘤的CRC和NSCLC細胞系上表達，且其表達在CSC富集的腫瘤球中上調(diào)。
[0026]5.LlRl的抗體阻斷在體外抑制腫瘤球形成。
[0027]6.1LlRl阻斷抑制IL-1 ^刺激的MAPKp38和STAT3磷酸化。
[0028]7.重組IL-1 ^誘導ILlRl在腫瘤球中的表達，而ILlRl的抗體阻斷下調(diào)ILlRl表達。
[0029]8.CSC-富集的腫瘤球分泌ILl-響應性細胞因子hIL8和hVEGF，且ILlRl阻斷可以抑制這些細胞因子的產(chǎn)生。
[0030]9.1LlRA藥物Kineret (Amgen)在體內(nèi)抑制源自CSC的異種移植腫瘤的生長且調(diào)節(jié)血清細胞因子。
[0031]10.腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)通過涉及IL-1的機制在體外促進腫瘤球形成。
[0032]總結且更歸納性地，本發(fā)明涉及以下主題:
?抑制ILlP和ILlRl的相互作用的藥劑，優(yōu)選多肽，更優(yōu)選單克隆抗體，其用于治療個體中的癌細胞和/或癌干細胞(CSC)，優(yōu)選CSC。本發(fā)明的癌細胞可以包含癌干細胞(CSC)的亞群。本發(fā)明的CSC可以包含不是CSC的其他腫瘤細胞。本發(fā)明的多肽靶向優(yōu)選在所述CSC的表面上、但不是或基本上不是在其他腫瘤細胞(其形成腫瘤組織上的主要群體，且不是癌干細胞)上表達的ILlRl。優(yōu)選地，待治療的癌癥對常規(guī)化療和/或放療和/或其他靶向治療耐受或主要耐受。
[0033]?抑制ILl ^和ILlRl的相互作用的各自藥劑、多肽或單克隆抗體，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中待治療的癌癥是乳腺癌、結腸直腸癌(CRC)或非小細胞肺癌(NSCLC)，優(yōu)選CRC。
[0034]?抑制ILlP和ILlRl的相互作用的各自藥劑、多肽或單克隆抗體，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述藥劑、優(yōu)選抗體與細胞生長抑制劑或細胞毒性劑或放療組合應用。所述細胞生長抑制劑或細胞毒性劑優(yōu)選是抗腫瘤抗體諸如赫賽汀、利妥昔或愛必妥、或化療劑，其在所述藥劑、優(yōu)選所述單克隆抗體之前或之后或與所述藥劑、優(yōu)選所述抗體同時應用于個體。
[0035]?適合用于治療癌癥疾病的藥物組合物，其包含治療有效量的如上所述的抗IL-1Rl藥劑、優(yōu)選多肽、更優(yōu)選抗IL-1Rl抗體連同藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
[0036]?藥劑盒，其包含至少ー個第一包裝和ー個第二包裝，其中
(i)所述第一包裝包含所述各自的抗IL-1Rl藥劑、優(yōu)選多肽或抗IL-1Rl抗體或包含這種藥劑/抗體的藥物組合物；且(ii)所述第二包裝包含細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑或包含所述藥劑的藥物組合物，其中所述第二包裝預期在施用所述第一包裝之前或之后、優(yōu)選在所述施用之前施用。
[0037]?抑制ILl ^和ILlRl的相互作用的藥劑、優(yōu)選多肽、更優(yōu)選單克隆抗體用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療個體中的単獨或與不是CSC或CSC組織的其他腫瘤細胞或腫瘤組織組合的癌細胞和癌組織和/或癌干細胞(CSC)，其中所述癌細胞或組織可以包含癌干細胞(CSC)的亞群，且所述CSC可能包含不是CSC的其他腫瘤細胞。所述多肽或抗體或融合蛋白靶向IL1R1，所述ILlRl優(yōu)選專門在所述CSC的表面上、但不是或基本上不是在其他腫瘤細胞(其形成腫瘤組織上的主要群體，且不是CSC)上表達。在本發(fā)明的ー個具體實施方案中，癌細胞和/或CSC對于常規(guī)化療和/或放療和/或其他靶向治療廣泛耐受。
[0038]?各自的藥劑、多肽、或單克隆抗體，其與細胞生長抑制劑或細胞毒性劑或放療組合應用于所述癌癥。
[0039]?治療個體中的化療和/或放療難治性癌癥的方法，其包括將抗IL-1Rl劑或抗體施用于所述個體，優(yōu)選地，其中所述個體中的化療和/或放療難治性癌癥由先前的化療和/或放療所引起。
[0040]?抑制ILl ^與ILlRl的結合和/或ILlRl與ILlRaCP的異源二聚化的多肽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療個體中的癌細胞群體，其中所述癌細胞群體包含単獨或與其他塊腫瘤細胞連同的癌干細胞(CSC)，其中任選地所述CSC對標準化療和/或放療和/或標準祀向治療耐受(i)。
[0041]?抑制ILl ^與ILlRl的結合和/或ILlRl與ILlRaCP的異源二聚化的多肽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療個體中的癌癥，其中所述癌細胞群體包含癌干細胞(CSC)和任選的正常塊腫瘤細胞，其中ILlR在所述CSC的表面上、但不是或基本上不是在非CRC腫瘤細胞上表達(ii)。
[0042]?各自(i) (ii)多肽的用途，其中所述癌癥選自:結腸直腸癌(CRC)、非小細胞肺癌(NSCLC)和乳腺癌(iii) 。
[0043]?各自(i) (ii) (iii)多肽的用途，其中所述多肽與細胞生長抑制劑、細胞毒性劑或放療組合施用于個體，其中例如所述細胞生長抑制劑或細胞毒性劑是抗腫瘤抗體，諸如赫賽汀、利妥昔或愛必妥、或化療劑，且其中例如所述多肽在所述細胞生長抑制劑或所述細胞毒性劑或所述放療治療之前、同時或之后應用于個體。
[0044]?抑制或阻斷ILl ^與ILlRl的結合和/或阻斷或抑制ILlRl與ILlRaCP的異源二聚化的多肽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療個體中的癌癥，其中所述癌癥是結腸直腸癌(CRC)、非小細胞肺癌(NSCLC)或乳腺癌，并且其中所述多肽靶向CSC和/或其他腫瘤細胞上的ILlRl，其中ILlRl優(yōu)選在CSC的表面上、但不是或基本上不是在正常塊腫瘤組織細胞上或在正常塊腫瘤組織細胞上少于50%、60%、70%或80%(與CSC上的ILlRl表達相比)表達(iv)。
[0045]?各自(iv)多肽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述CSC至少對標準化療和/或放療耐受，所述CSC任選由化療劑、優(yōu)選細胞毒性劑和/或細胞生長抑制劑的先前治療所引起(V)。
[0046]?各自(iv)(v)多肽用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述多肽與細胞生長抑制劑或細胞毒性劑組合和/或與放療組合施用于個體(vi)。
[0047]?各自(i)-(vi)多肽或包含治療有效量的所述多肽的藥物組合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述多肽選自
(a)鼠單克隆抗體、人源化單克隆抗體、嵌合單克隆抗體或人單克隆抗體，優(yōu)選抗ILlR抗體、抗ILlP抗體、抗ILlaCP抗體(抗IL-1受體輔助蛋白抗體)、或靶向ILlR和ILlRaCP的雙特異性抗體；
(b)重組天然或修飾的ILlRA(白介素-1受體拮抗劑)，
(c)充當IL-1P的誘捕物且防止IL-1P可用干與IL-1Rl相互作用的ILlRl-1LlRaCP融合蛋白(vii)。
[0048]?生物標志物用于在基于細胞的先體內(nèi)后體外測定中評價和預測藥劑對癌癥的作用的用途，其中
(a)所述生物標志物是IL-1Rl，
(b)所述細胞是在其表面上表達ILlRl的化療或放療耐受的癌干細胞(CSC)，
(c)且所述藥劑是(i)-(vii)中所述的治療性多肽，其中優(yōu)選地，所述CSC通過用化療劑和/或通過放射處理這些組織樣品而作為個體的腫瘤組織樣品的細胞亞群獲得，其中，進ー步地，在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案中，在所述基于細胞的測定中的癌細胞源自患有NSCLC、CRC或乳腺癌的個體的樣品。
[0049]【專利附圖】

【附圖說明】:
a 1-.esc-標志物在高劑量化療劑選擇的細胞中富集。
[0050]A.已知ABC轉運蛋白在CSC中高度富集。它們負責藥物的快速排出，其導致對通常治療方案的耐受。高劑量化療劑選擇A549 NSCLC細胞系后，各種ABC轉運蛋白上調(diào)。
[0051]B.CSC獲得對通常治療方案耐受的ー種進一歩機制是解毒酶如醛脫氫酶(ALDH)的表達提高。高劑量化療劑選`擇后，ALDH的各種同種型也上調(diào)。
[0052]圖2'CSC-標志物在重新鋪板的來自源自NSCLC和CRC患者的原發(fā)性患者材料的月中瘤球中上調(diào)。
[0053]A.腫瘤球測定富集CSC，相比之下，貼壁條件主要驅動分化。在微陣列上分析貼壁傳代細胞相比于重新鋪板的腫瘤球，其顯示為已知CSC-標志物的ABCG2和ALDH-1的表達提聞。
[0054]B.用Aldefluor測定在功能上顯示ALDH-1表達增加。與初始鋪板細胞相比，重新鋪板的腫瘤球增加~10倍。
[0055]C.增加的ABCG2表達增加了側群中的細胞量，可以顯示SP細胞可在重新鋪板的腫瘤球中的增加。與初始鋪板細胞相比增加~10倍。
[0056]Mll將ILl P和其各自受體ILlRl鑒定為在重新鋪板的原發(fā)性腫瘤球和化療劑選擇的細胞中差異性上調(diào)的目標。
[0057]A.1Ll ^在貼壁(分化)條件下是穩(wěn)定的，但在來自源自患者的原發(fā)性NSCLC細胞的腫瘤球中上調(diào)。
[0058]B.當與貼壁對照相比，ILlP在重新鋪板的腫瘤球中顯著上調(diào)。各自受體ILlRl的表達在重新鋪板的源自患者的原發(fā)性NSCLC細胞的腫瘤球中也提高。
[0059]C.1LlP表達在來自源自患者的原發(fā)性CRC細胞的腫瘤球中上調(diào)。
[0060]D.當與貼壁對照相比，ILlP表達在重新鋪板的CRC腫瘤球中上調(diào)。各自受體ILlRl的表達在重新鋪板的源自患者的原發(fā)性CRC細胞的腫瘤球中明顯提高。
[0061]E.1LlP在高劑量紫杉醇(Pac)和多柔比星(Dox)選擇的細胞中顯著上調(diào)。
[0062]B A:1LlRl在腫瘤細胞上表達，其表達在重新鋪板的腫瘤球中提高。[0063]A.源自患者的原發(fā)性NSCLC細胞用來誘導免疫缺陷小鼠中的s.c.異種移植腫瘤。誘導腫瘤后，分離單細胞，并進ー步分析ILlRl的目標表達。CSC-標志物⑶133在這些群體中是低豐度的。
[0064]B.在腫瘤球測定中重新鋪板來自s.c.異種移植物(A.)的單細胞。ILlRl的表達增加~7倍，且CSC-標志物⑶133的表達增加~15倍。因此，ILlRl似乎是CSC相關表面分子。
[0065]重^肺腺癌I期和CRC患者中無疾病和整體生存與ILl J3和IL IRl表達水平相關。
[0066]A.1Ll ^的探針組215561_s_at顯示了肺腺癌I期患者的整體生存的生存益處和CRC患者中的無疾病生存益處。CRC患者的整體生存沒有顯著相關性。
[0067]B.1LlRA的探針組39402_at與肺腺癌I期的更好生存輕微相關，且與CRC中的無疾病和整體生存的生存益處相關。
[0068]圖6:中和性抗體對ILlRl的抑制以劑量依賴的方式降低腫瘤球形成。
[0069]A.B.在腫瘤球測定中將源自患者的原發(fā)性細胞鋪板，其中使用0，5和10 l^g/mL對照IgG(正常山羊IgG)或抗人ILlRl抗體。未經(jīng)處理的細胞用作球形成的陽性對照。
[0070]A.在原發(fā)性NSCLC中抗IL-1Rl處理以劑量依賴的方式降低腫瘤球形成。B.在原發(fā)性CRC中觀察到腫瘤球形成的劑量依賴性降低。實驗一式三份進行，條形圖表示相對于對照的倍數(shù)腫瘤球誘導；誤差條代表SD。
[0071 ]圖7:1LlRl在源自原發(fā)性CRC和NSCLC腫瘤的細胞系上表達，且其表達在作為腫瘤球鋪板后上調(diào)。
[0072]源自患者的原發(fā)性NSCLC和CRC細胞在體外分化貼壁條件下培養(yǎng)，使用多克隆或單克隆抗體針對ILlRl表達進行染色，且通過流式細胞術檢測表達。相同細胞系也進行如腫瘤球的ー輪培養(yǎng)。如NSCLC(上小圖)和CRC(下小圖)的柱狀圖疊加(貼壁=紅色，球=藍色)中顯示，將腫瘤球和貼壁細胞中的ILlRl表達進行比較。兩種抗體在NSCLC球培養(yǎng)物相比于貼壁培養(yǎng)物中檢測到ILlRl的顯著上調(diào)，然而在CRC球中，只有多克隆抗體能夠探測到ILlRl上調(diào)。
[0073]圖8:使用兩種不同抗體在原發(fā)性NSCLC和CRC中檢測ILlRl0
[0074]源自患者的原發(fā)性NSCLC和CRC細胞在體外分化貼壁條件下培養(yǎng)，使用以APC標記的來自R&D Systems的功能級PAB山羊AF269和以APC標記的對應于專利W02004022718A的Amgen Mab的MAB hIgG4 15C4針對ILlRl表達進行染色。使用對照山羊IgGl-APC作為各自同種型，且如從上至下的左邊和中間小圖中以藍線顯示，沒有給出任何信號。相同小圖中的紅線顯示兩種抗體對ILlRl目標的識別。在右側小圖(上側和下側)中比較了用兩種抗ILlRl抗體獲得的結果，顯示多克隆抗體AF269 (紅色柱狀圖)比單克隆抗體15C4 (藍色柱狀圖)具有較強的目標識別，這最可能是由于識別多個表位引起的。
[0075]S 9:1L-1 J3激活pMAPKp38和pSTAT3和15C4 Mab對該途徑的抑制作用。
[0076]在不存在生長因子的情況下將源自患者的原發(fā)性NSCLC細胞鋪板。在37°C /5%C02過夜孵育后，A.C:以0，lpg/mL至1 00pg/mL的漸增濃度添加重組ILl。細胞孵育20 min，然后用HGNT緩沖液裂解。裂解假設分化表型的貼壁生長NSCLC細胞作為對照。B.D.用Ipg/mL重組IL-1P誘導另一部分球30 min，然后添加漸增濃度的抗ILlRl hIgG4 15C4 Mab,孵育24h，然后裂解用于進一歩分析。A.B.C.D.遵循制造商的說明，分別對于PSTAT3或pMAPKp38使用Pathscan ELISA分析裂解物。結果顯示為任意單位的0D450nm。結果是初步的，仍有待確認結果。
[0077]圖10:在用重組IL-1 3刺激或用抗ILlRl抗體處理后通過western印跡檢測ILlRl水平。
[0078]在不存在生長因子的情況下在37°C /5%C02將源自患者的原發(fā)性NSCLC和CRC腫瘤球鋪板。A.C:以0，lpg/mL至100pg/mL的漸增濃度添加重組IL-1 3。細胞孵育20 min,然后用HGNT緩沖液裂解。使用來自貼壁生長的NSCLC (代表分化表型)的裂解物作為對照。B.D:用lpg/mL重組IL-1 ^刺激腫瘤球30 min,隨后添加漸增濃度的15C4抗ILlRl抗體。24h后，從細胞制備裂解物。A.B.C.D:通過western印跡分析裂解物。用5%乳封閉膜，且用在TBS中1:1000的抗ILlRl兔IgG(Millipore) —抗進行孵育。用在TBS中1:2000的抗兔POD 二抗進行檢測。使用VersaDoc設備將膜成像。使用Quantity one軟件進行密度分析，其結果表示為以上述任意単位的條形圖。結果是初歩的，仍有待確認結果。
[0079] S 11:111-響應性細胞因子hIL8和h VEGF的體外分泌可以被抗ILlRl阻斷。
[0080]將源自患者的原發(fā)性NSCLC細胞作為腫瘤球鋪板，且在不存在生長因子的情況下在37°C /5%C02培養(yǎng)過夜。A.B:球和貼壁生長細胞的上清液在24小時后收集，且使用來自R&D Systems的定量ELISA分析hIL8和hVEGF水平。結果用以pg/mL為單位的細胞因子濃度的條形圖顯示。C.D:用lpg/mL重組IL-1 P刺激球30min，隨后添加漸增濃度的15C4抗ILlRl Mab。孵育6h后，收集培養(yǎng)上清液，且通過ELISA測定hIL8和hVEGF水平。結果用以Pg/mL為單位的細胞因子濃度的條形圖顯示。結果是初歩的，仍有待確認結果。
[0081 ] 圖12:使用來自Amgen的ILlRA藥物Kineret抑制原發(fā)性CRC和NSCLC-CSC-腫瘤的腫瘤生長。
[0082]基于如通過Aldefluor分析測定的ALDH活性從源自原發(fā)性腫瘤的NSCLC和CRC細胞系培養(yǎng)物FACS富集CSC。將IO4個細胞/小鼠連同基質膠皮下移植到N0D/SCID小鼠中。將上樣劑量的5Pg/mL Kineret (重組IL1RA，Amgen)應用于基質膠，隨后在移植后第I天開始進行用5或10 mg Kineret的毎日皮下處理。每周監(jiān)測腫瘤體積，對于CRC模型(A.)在第76天，對于NSCLC模型(B.)在第91天，將來自每組的三只小鼠處死，用于進一歩研究。對于其余動物，停止Kineret處理，且繼續(xù)監(jiān)測腫瘤進展。當腫瘤達到>2000 mm3時處死小鼠。在處死時一起采集血清用于細胞因子分析。A.CRC腫瘤模型研究中的腫瘤生長曲線和B.NSLCL模型研究中的生長曲線。曲線代表來自10只小鼠/組的以mm3為單位的平均腫瘤體積；誤差條為SEM。對于每種模型顯示的數(shù)據(jù)代表n = 2的類似實驗。
[0083]圖13:在用CSC-異種移植腫瘤移植的N0D/SCID小鼠血清中檢測hIL8和h VEGF。
[0084]對從如圖18中所述的腫瘤模型研究收集的血清進行本分析。使用從R&D systems獲得的高靈敏度ELISA檢測試劑盒進行血清分析。A.C.分析在第76天(CRC)(藍色)和在第91天(NSCLC)(紅色)的3只小鼠的血清的hIL8和hVEGF血清水平。結果以條形圖顯示，代表來自n=3只小鼠/組的以pg/mL +/- SD表示的平均細胞因子濃度。B.D:在CRC模型中停止Kineret處理后，本發(fā)明人基于腫瘤進展率將分類為高響應者、中等響應者和低響應者的三只個別小鼠的細胞因子水平進行比較。在所有條件下，在Kineret處理的小鼠中，hVEGF水平保持穩(wěn)定，然而hIL-8水平急劇下降，觀察到這與腫瘤負荷直接相關。這些結果將用第二次體內(nèi)實驗的血清進行確認。
[0085]圖14:中和性抗體對ILlRl的抑制以劑量依賴的方式降低TAM支持的腫瘤球形成。
[0086]A.分離來自HER/neu轉基因小鼠的自發(fā)性乳腺腫瘤，且分離腫瘤細胞。使用⑶IIb和F4/80連同泛造血標志物⑶45分選腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)。A.B.將HER2/neu細胞作為單獨的腫瘤球和連同TAM進行鋪板。単獨的TAM充當對照。來自一式三份的每孔腫瘤球數(shù)的平均值和SD顯示為條形圖。TAM支持的HER2/neu球以TAM細胞數(shù)依賴的方式生長。C.抗鼠ILlRl倉鼠IgG Mab以0，5Mg/mL和10Mg/mg(左小圖)添加至HER2/neu月中瘤球以及ffiR2/neu+TAM共培養(yǎng)物。腫瘤球數(shù)顯示為來自一式三份的平均值和SD的條形圖。在抗ILlRl處理下以劑量依賴的方式抑制TAM支持的球生長。
[0087]發(fā)明詳述
如果沒有另有指出，否則本發(fā)明中使用的術語及短語優(yōu)選具有下文給定的意義和定義。此外，這些定義和意義更詳細地描述了包括優(yōu)選實施方案和/或方面的本發(fā)明。
[0088]“癌干細胞(CSC) ”:美國癌癥研究協(xié)會(the American Association of CancerResearch)召集的ー個共識小組已經(jīng)將CSC定義為“腫瘤內(nèi)具有自我更新且引起組成腫瘤的癌細胞的異質譜系的能力的細胞”。應當指出的是，該定義沒有指明這些細胞的來源ー這些腫瘤形成細胞可以假設源自干細胞、祖細胞或分化的細胞。因此，有時使用術語“腫瘤起始細胞”或“癌癥起始細胞”而非“癌干細胞”，以避免混淆。腫瘤源自正常細胞通過遺傳修飾聚集的轉化，但它并沒有明確確定干細胞是所有CSC的來源。因此，CSC假說沒有暗示癌癥總是由干細胞引起，或如同該報告的其他章節(jié)中討論的，干細胞治療狀況諸如心臟疾病或糖尿病的可能應用將導致腫瘤形成。相反，腫瘤起始細胞在一定程度上具有干細胞樣特征，其程度足以保證與干細胞進行比較；觀察到的轉移性癌細胞的實驗和臨床行為非常讓人想起干細胞的經(jīng)典特性。
[0089]因此，本發(fā)明的CSC可以視為腫瘤組織包括實體瘤和轉移瘤內(nèi)細胞的一個亞群(1-10%，優(yōu)選2-5% )，其功能和任選表型不同于標準腫瘤組織細胞。CSC是致瘤的，這意味著它們可以生成新的腫瘤細胞。CSC顯示長期的自我更新能力且生成分化的腫瘤塊群體。CSC的特征還在于顯示對化療和/或放療的耐受性的增強的能力。此外，CSC可以通過驅動將疾病傳播到不同器官而支持轉移。存在試圖解釋CSC來源的幾種假說。CSC可能由(i)干細胞、由(ii)祖細胞、和由(iii)分化的成熟細胞產(chǎn)生。本發(fā)明的CSC可以包括其他不是CSC的腫瘤細胞，其范圍為0 - 30%。
[0090]術語“腫瘤細胞”或“癌細胞”涉及，如果沒有不同地指定，不受控制生長的細胞，其不是癌干細胞。腫瘤或癌細胞可以包含范圍為0-30%的CSC。腫瘤細胞代表普通腫瘤組織的大部分群體。
[0091] 術語“癌”描述ー組疾病，其特征在于不受控制的細胞生長、細胞侵入相鄰組織、和如果未在足夠早期進行處理則轉移的潛能。這些細胞畸變經(jīng)由根本基因序列變化或表觀改變(例如，不影響基因序列本身的基因活化或DNA相關蛋白的修飾)累積的遺傳修飾而產(chǎn)生。癌癥可以在實體器官諸如肺、腦或肝臟中形成腫瘤，或在組織諸如血液或淋巴中作為惡性腫瘤而存在。由異常細胞生長導致的腫瘤和其他結構含有具有不同生物學特征和潛力的異質細胞群體。事實上，癌組織足夠異質，使得研究人員可能鑒定來自相同樣本的幾種組織樣品之間的遺傳概況之間的差異。盡管ー些基因分組允許科學家將器官或組織特異性癌癥分類為可以最終提供治療信息且提供預測信息的亞類，但是癌癥生物學的顯著復雜性繼續(xù)混淆治療努力。
[0092]借助本發(fā)明的藥物組合物可治療腫瘤，諸如乳房、心臟、肺、小腸、結腸、脾、腎、膀胱、頭和頸、卵巣、前列腺、腦、胰腺、皮膚、骨、骨髄、血液、胸腺、子宮、睪丸、子宮頸和肝臟的腫瘤。更具體地，所述腫瘤選自腺瘤、血管肉瘤、星形細胞瘤、上皮癌、生殖細胞瘤、成膠質細胞瘤、神經(jīng)膠質瘤、錯構瘤、血管內(nèi)皮瘤、血管肉瘤、血腫、肝母細胞瘤、白血病、淋巴瘤、成神經(jīng)管細胞瘤、黑素瘤、神經(jīng)母細胞瘤、骨肉瘤、視網(wǎng)膜母細胞瘤、橫紋肌肉瘤、肉瘤和畸胎瘤。還更優(yōu)選，腫瘤/癌癥選自腦腫瘤、頭頸部癌、直腸癌、星形細胞瘤，優(yōu)選I1、III或IV級星形細胞瘤、膠質母細胞瘤，優(yōu)選多形性膠質母細胞瘤(GBM)、小細胞肺癌(SCLC)和非小細胞肺癌(NSCLC)，優(yōu)選非小細胞肺癌(NSCLC)、轉移性黑素瘤、轉移性雄激素非依賴性前列腺癌(AIPCa)、轉移性雄激素依賴性前列腺癌(AIPCa)、乳腺癌和結腸直腸癌(CRC)。
[0093]“受體”或“受體分子”優(yōu)選為包含一個或多個結構域(配體可結合所述結構域以形成受體-配體復合體)的可溶性或膜結合或膜相關的蛋白或糖蛋白。通過結合可能是激動劑或拮抗劑的配體，所述受體被激活或失活，并可以啟動或阻斷信號轉遞途徑。
[0094]“配體”或“受體配體”優(yōu)選指結合受體分子以形成受體-配體復合體的天然或合成化合物。術語配體包括激動劑、拮抗劑和具有部分激動劑/拮抗劑活性的化合物。
[0095]“激動劑”或“受體激動劑”優(yōu)選為天然或合成化合物，其結合受體以形成受體-激動劑復合體，分別通過激活所述受體和受體-激動劑復合體來啟動信號轉遞途徑和進一歩生物學過程。
[0096]“拮抗劑”或“受體拮抗劑”優(yōu)選指具有與激動劑相反的生物效應的天然或合成化合物。拮抗劑通過與激動劑競爭受體來結合受體并阻斷受體激動劑的作用。通過其阻斷激動劑作用的能力來定義拮抗劑。受體拮抗劑也可以是抗體或其免疫治療有效片段。下文引用并討論了本發(fā)明的優(yōu)選拮抗劑。
[0097]本文術語“抗體”或“免疫球蛋白”優(yōu)選在最廣泛的意義上使用并具體涵蓋完整的單克隆抗體、多克隆抗體、由至少兩種完整抗體形成的多特異性抗體(例如，雙特異性抗體)和抗體片段(諸如Fe、Fab、F (ab’)2、scFv等)，只要它們展示出所需的生物學活性。該術語通常包括異種抗體，所述異種抗體由連接在一起的具有不同結合特異性的兩種或更多種抗體或其片段構成。該術語還包括抗體融合蛋白(所述抗體融合蛋白由抗體或抗體片段和與抗體或抗體片段重組融合的多肽或蛋白構成)和免疫綴合物，其中所述抗體或抗體片段與化學實體化學連接。該術語進ー步包括人抗體、人源化抗體和嵌合抗體。
[0098]如本文所用的術語“細胞毒性劑”優(yōu)選指抑制或阻止細胞功能和最后引起細胞解體和細胞死亡(尤其是腫瘤細胞死亡)的物質。所述術語優(yōu)選g在包括放射性同位素、化學治療劑和毒素諸如細菌、真菌、植物或動物來源的酶活性毒素或其片段。所述術語還可包括細胞因子家族成員，優(yōu)選為IFNy以及也具有細胞毒活性的抗腫瘤劑。
[0099]如本文所用的術語“細胞生長抑制劑”優(yōu)選指抑制或阻止細胞功能、或阻礙細胞活性和復制、且最終引起防止細胞生長而沒有殺死它們的物質，包括抗體、抗體片段、免疫綴合物或抗體融合蛋白。
[0100]根據(jù)本發(fā)明的理解，術語“ 化學治療剤”、“化療劑”或“抗腫瘤劑”優(yōu)選認為是如上述的“細胞毒性劑”或“細胞生長抑制劑”類的成員，并包括直接作用在腫瘤細胞上例如通過細胞生長抑制作用或細胞毒作用來產(chǎn)生抗腫瘤效果(即阻止腫瘤細胞的發(fā)育、成熟或擴散)的化學活性剤，而不是通過諸如生物學應答修飾的機制間接作用。本發(fā)明合適的化療劑優(yōu)選為天然的或合成的化學化合物，但不表示排除生物分子諸如蛋白、多肽等。有大量處于商業(yè)使用、臨床評價和臨床前開發(fā)中可獲得的抗腫瘤劑，其可包括在本發(fā)明中用于治療腫瘤/瘤形成?；焺┗蛩巹┑膶嵗ㄍ榛瘎绲?、乙烯亞胺化合物、烷基磺酸酷和具有烷化作用的其它化合物諸如亞硝基脲、順鉬和達卡巴嗪；抗代謝物，例如葉酸、嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂抑制劑，例如長春堿和鬼白毒素的衍生物；細胞毒抗生素和喜樹堿衍生物。優(yōu)選的化療劑或化療包括阿米斯丁(氨磷汀)、順鉬、達卡巴嗪(DTIC)、放線菌素D、二氯甲基二こ胺(氮芥)、鏈脲霉素、環(huán)磷酰胺、卡莫司汀(BCNU)、洛莫司汀(CCNU)、多柔比星(阿霉素)、多柔比星脂質體(鹽酸多柔比星脂質體)、吉西他濱(健擇)、柔紅霉素、柔紅霉素脂質體(枸櫞酸柔紅霉素脂質體)、甲基芐肼、絲裂霉素、阿糖胞苷、依托泊苷、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶(5-FU)、長春堿、長春新堿、博來霉素、紫杉醇(泰素)、多西他賽(多西紫杉醇)、阿地白介素、天冬酰胺酶、白消安、卡鉬、卡拉屈濱、喜樹堿、CPT-1lUO-羥基-7_乙基-喜樹堿(SN38)、達卡巴嗪、氟尿苷、氟達拉濱、羥基脲、異環(huán)磷酰胺、伊達比星、美司鈉、a干擾素、P干擾素、伊立替康、米托蒽醌、拓撲替康、醋酸亮丙瑞林、甲地孕酮、美法侖、巰基嘌呤、普卡霉素、曼托坦、培門冬酶(pegaspargase)、噴托他丁、哌泊溴燒、普卡霉素、鏈脲霉素、他莫昔芬、替尼泊苷、睪內(nèi)酷、硫鳥嘌呤、噻替哌、尿嘧啶氮芥、長春瑞濱、苯丁酸氮芥及其組合。與本發(fā)明的任何工程改造抗體組合使用的優(yōu)選化療劑可以是例如氨甲喋呤、長春新堿、阿霉素、順鉬、不含糖的氯乙基亞硝基脲(non-sugar containingchloroethyl nitrosoureas)、5 -氟尿嘧唳、絲裂霉素C、博來霉素、多柔比星、達卡巴嗪、紫杉醇、fragyline、Meglamine GLA、戍柔比星、卡莫司汀、UFT (替加氟/尿嘧唳)、ZD 9331、泰索帝/多西他賽、氟尿嘧啶(5-FU)、長春花堿、和該類別的其他已知化合物。
[0101]術語“治療有效的”或“治療有效量”指在哺乳動物中有效治療疾病或病癥的藥物量。在癌的情況下，藥物的治療有效量可減少癌細胞數(shù)目；降低腫瘤大??；抑制(即在一定程度上減慢并優(yōu)選停止)癌細胞浸潤進周邊的器官；抑制(即在一定程度上減慢并優(yōu)選停止)腫瘤轉移；在一定程度上抑制腫瘤生長；和/或在一定程度上減輕ー種或多種與癌相關的癥狀。達到藥物可以阻止癌細胞生長和/或殺死存在的癌細胞的程度，它可以是細胞生長抑制的和/或細胞毒性的。對于癌的治療，例如可通過評估疾病進展時間(TTP)和/或測定應答率(RR)來測定效力。
[0102]對于約70千克的成人，本發(fā)明中使用的抗體(包括抗ILlIRl多肽)的治療有效量為約50至4000毫克/每劑量的范圍內(nèi)，優(yōu)選約100至1000 mg毫克/每劑量的范圍內(nèi)。對于每個月治療一次或兩次的70 kg成人，最優(yōu)選劑量是約200 - 500毫克。
[0103]本文提到的化療劑的治療有效量通常是10 mg/kg至100 mg/kg的劑量。
[0104]施用優(yōu)選為每2周一次或每個月一次，但是根據(jù)各自藥劑在給定個體中的藥代動力學行為也可以更多或更少。
[0105]術語“放療”和相關術語根據(jù)本發(fā)明指施用或遞送局灶性電離輻射，其中毎次施用或遞送優(yōu)選以每次0.5到5戈瑞(Gy)，更優(yōu)選0.8到3 Gy,尤其是I到2.5 Gy,例如約1.0、約1.3 Gy、約1.6 Gy、約1.8 Gy、約2.0 Gy、約2.5 Gy或約3.0 Gy (其也優(yōu)選為所述放射施用或遞送發(fā)生的每天的放射量)，對患者施用或遞送20到50戈瑞(Gy)，優(yōu)選25到40Gy,更優(yōu)選28到25 Gy,例如約28 Gy,約30 Gy或約35 Gy0因此，優(yōu)選在一周內(nèi)2天或3天姆天施用或遞送1.5到2.5 Gy,并優(yōu)選1.8到2.2 Gy。因此,也優(yōu)選在一周內(nèi)3天到6天，優(yōu)選5天,并更優(yōu)選連續(xù)5天姆天施用或遞送0.7到1.3 Gy,并優(yōu)選0.9到1.2 Gy。通常，尤其優(yōu)選在一周內(nèi)2天或3天姆天施用或遞送1.0到3.0 Gy,優(yōu)選約1.0、約2.0 Gy或約3.0 Gy0在癌類型的治療中優(yōu)選如上所述局灶性放射治療的應用類型，所述癌類型選自小細胞肺癌和非小細胞肺癌，優(yōu)選非小細胞肺癌、乳腺癌、轉移性黑素瘤、前列腺癌、和結腸直腸癌。
[0106]將本發(fā)明的“藥物組合物”配制成與其預期的施用途徑相客。施用途徑的實例包括腸胃外的例如靜脈內(nèi)的、真皮內(nèi)的、皮下的、經(jīng)ロ的(例如吸入)、經(jīng)皮的(局部的)、跨粘膜的和直腸的施用。用來進行腸胃外、真皮內(nèi)或者皮下應用的溶液或懸浮液可以包括下列組分:無菌的稀釋劑諸如注射用水、鹽水溶液、固定油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成的溶劑；抗細菌劑諸如芐醇或對羥基苯甲酸甲酯；抗氧化劑諸如抗壞血酸或亞硫酸氫鈉；螯合劑諸如こ二胺四こ酸；緩沖劑諸如醋酸鹽、杵檬酸鹽或磷酸鹽以及調(diào)節(jié)張力的試劑諸如氯化鈉或右旋糖。pH可以用酸或堿諸如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)。腸胃外制劑可以包裝在安瓿、一次性注射器或用玻璃或塑料制成的多劑量小瓶中。
[0107]“IL-1R抑制劑”:本發(fā)明的合適的IL-1R抑制劑是多肽，優(yōu)選人單克隆抗體、嵌合單克隆抗體或人源化單克隆抗體，以及IL-1R受體拮抗劑(IL-1RA)，其是IL-1Rl的天然抑制劑。合適的抗體是抗IL-1Rl抗體或抗IL-1 P抗體或針對IL-1R輔助蛋白(IL-1RaP)的抗體或IL-1RaP和IL-1Rl兩者的抗體，包括雙特異性抗體。本發(fā)明的合適的IL-1R抑制劑進ー步包括上述特定抗體與其他靶向或功能上有效的分子的融合分子，以及作為天然IL-1Rl配體IL-1 ^的誘捕物發(fā)揮功能的融合分子，從而阻止IL-1 ^與IL-1受體的結合。
[0108]本發(fā)明的這種多肽的實例是本領域已知的。
[0109]WO 2004/039951 和 TO 2000/018932 描述了由與 IL-lRaP (Acralyst)融合的IL-1Rl組成的IL-1 P誘捕物。WO 1989/011540和WO 2001/042305描述了重組天然和修飾的 IL-1RA (anakinra/Kineret)。WO 2004/022718 公開了抗 IL-1R 抗體(AMG-108)。進一步的抗 IL-1R 抗體描述于 WO 2005 023872 (2D8)。WO 2002/016436 描述了人抗 IL-1 3抗體(canakinumab / Ilaris),且WO 2007/002261公開了另一種針對IL-1 ^的人源化抗體。在WO 2010/052505中公開了其他抗IL-1Rl抗體。
[0110]所有上述這些多肽/抗體曾經(jīng)和現(xiàn)在僅用于治療炎癥性疾病的實踐中。
[0111]由本發(fā)明提供且由本發(fā)明人下面詳細展示的數(shù)據(jù)顯示，沿IL-1 P/IL-1Rl軸的信號傳遞在CSC、腫瘤維持和轉移中起重要作用。因此，IL-1Rl對CSC的抑制是腫瘤學中治療原發(fā)性和轉移性疾病的有效且有希望的目標。
[0112]假設大劑量化療劑將根除腫瘤細胞的增生塊且只留下具有內(nèi)在耐受性的細胞，則本發(fā)明人用高劑量的多柔比星(Doxorubicin)和紫杉醇(Paclitaxel)處理人A549非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系，通過密度梯度離心回收幸存的細胞，且制備RNA提取物用于在AfTymetrix微陣列平臺上的進ー步基因表達分析。通過來自Affymetrix的基因表達微陣列huU133 2.0plus分析樣品，然后進一歩分析差異表達。將未處理的/野生型(WT)細胞與紫杉醇和多柔比星富集的A549進行比較。如下所示，在高劑量化療劑選擇的腫瘤細胞中，干細胞標志物如ABC轉運蛋白(圖1A)和用于快速排出和代謝的ALDH-同種型(圖1B)上調(diào)。
[0113]在第二個步驟中，本發(fā)明人建立了模型系統(tǒng)來分析CSC相比于分化的腫瘤塊細胞。腫瘤球測定用來通過連續(xù)重新鋪板而富集CSC，然而使有血清的貼壁條件含有較高量的分化細胞。如圖2A中所示，與貼壁條件相比，在腫瘤球中測定中干細胞標志物ABCG2和ALDH1A1上調(diào)。這些結果可以在干細胞的兩個金標準功能測定中進行證明:來自StemCell Technologies (SCT)的 Aldefluor (AF)-測定和側群(side population, SP)測定[GoodelI, M.A.,等人，J Exp Med, 1996.183(4): p.1797-806.]。當細胞作為腫瘤球鋪板時，兩種CSC-標志物上調(diào)，這顯示腫瘤球測定是功能富集CSC的真正干細胞測定法(圖2B和C)。
[0114]從鋪板前的初始細胞(PO)和然后從連續(xù)重新鋪板輪次的腫瘤球以及從連續(xù)的貼壁代提取RNA。以該方式培養(yǎng)來自結腸直腸癌(CRC)或NSCLC的原發(fā)性患者材料。
[0115]還通過來自Affymetrix的基因表達微陣列huU133 2.0plus分析樣品，然后進一步分析差異表達。此處將貼壁代與腫瘤球鋪板進行比較，且還考慮鑒定的差異表達基因的線性。線性表示腫瘤球與貼壁代相比一致的上調(diào)或下調(diào)。
[0116]本發(fā)明人鑒定了各種差異表達的基因，本發(fā)明人從其中選擇分泌或者定位于細胞表面的基因。IL-1 P是原發(fā)性NSCLC中最嚴厲調(diào)控的基因之一(圖3A和B)，且在CRC中也上調(diào)(圖3C和D)。IL-1P在貼壁/分化代中的表達低且穩(wěn)定，然而當與貼壁/分化代相比時，其在腫瘤球中顯著上調(diào)。因此，明顯地，在分化條件下，IL-1 P不發(fā)揮主要作用，然而在代表CSC條件的腫瘤球中，IL-1P上調(diào)，所以假設它是非常重要的。還發(fā)現(xiàn)，IL-1的受體，IL-1受體I (IL-1Rl)在NSCLC球中輕微上調(diào)(圖3B)。在原發(fā)性CRC中，IL-1 ^只有略微上調(diào)，然而，ILlRl顯著上調(diào)(圖3D)。細胞因子IL-1 P在化療劑選擇的細胞中也上調(diào)，這提供了富集CSC的功能選`擇方法的進ー步驗證(圖3E)。
[0117]IL-1 P及其各自受體的mRNA水平在功能富集的CSC中上調(diào)。為了在蛋白水平上進ー步評價關聯(lián)性，本發(fā)明人分析源自原發(fā)性患者材料的NSCLC樣品?；颊卟牧献鳛樵诿庖呷毕菪∈蟮钠は?s.c.)異種移植物在體內(nèi)繁殖。分離腫瘤，且在腫瘤球測定中進ー步分析以及重新鋪板。ILlRl的蛋白表達存在于親本患者腫瘤細胞(圖4A)和衍生的腫瘤球兩者上。在腫瘤球重新鋪板后，表面上的IL-1Rl蛋白表達也上調(diào)，這與我們在RNA /微陣列-水平上的發(fā)現(xiàn)是一致的。CSC-標志物CD133在相同的重新鋪板的腫瘤球中也上調(diào)，這表明LlRl是CSC相關表面分子(圖4B)。
[0118]假設IL-1 P或其各自受體在腫瘤維持和轉移中發(fā)揮主要作用，本發(fā)明人使用計算機芯片上的方法來評價IL-1 ^和IL-1Rl對無疾病和整體存活的影響。對于針對IL-1 ^的探針組215561_s_at和針對IL-1Rl的39402_at，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)IL-1 ^的低表達與肺腺癌I期患者中的生存益處和與在CRC中的延長的無疾病生存相關。CRC的整體生存沒有顯示出與高或低IL-1B表達的顯著差異(圖5A)。IL-1Rl的高表達顯示了肺腺癌I期中生存的輕微生存益處和CRC中的無疾病和整體生存的明顯益處(圖5B)。
[0119]在腫瘤球重新鋪板后，表面上的IL-1Rl RNA和蛋白表達上調(diào)，然而在貼壁條件下的RNA表達是穩(wěn)定的。腫瘤球測定得以確立，且已經(jīng)顯示富集CSC和CSC樣祖細胞，而分化的細胞死亡。因此，可以假設，IL-1 ^ /IL-1Rl信號傳遞可能在CSC表型的發(fā)生和/或維持中起重要作用。為了測試IL-1 P/IL-1Rl信號傳遞是否在腫瘤球中是重要的，本發(fā)明人在腫瘤球測定中鋪板原發(fā)性NSCLC或CRC，且用O，5、5和10/50l^g/mL劑量范圍的正常山羊IgGl或中和性山羊抗人IL-1Rl抗體處理細胞。此處，本發(fā)明人顯示在源自NSCLC(圖6A)和CRC患者的細胞系(圖6B)中，中和性抗體對IL-1Rl的抑制以劑量依賴的方式降低鋪板的細胞的球形成能力。
[0120]圖7和8表示CRC和NSCLC腫瘤上IL-1Rl的表達上調(diào)和不同抗體對其的檢測。
[0121]還顯示了抗IL-1Rl抗體對IL-1 P的抑制作用(圖9、10、14)。
實施例
[0122]實施例1:鑒定IL1/IL1R1信號傳遞作為CSC相關途徑:
CSC的特征在于它們的藥物流出轉運蛋白和解毒酶的高表達。因此，本發(fā)明人假設，他們可以通過用超生理、高劑量的化療劑處理癌細胞系而選擇具有固有的CSC樣特性的細胞。該方法根除了過度增生的塊且留下具有固有(而非獲得)耐受性的細胞。發(fā)明人用高劑量的多柔比星(Doxorubicin)和紫杉醇(Paclitaxel)處理A549非小細胞肺癌(NSCLC)細胞系，通過密度梯度離心回收幸存的細胞，且制備RNA提取物用于在AfTymetrix微陣列平臺上的進ー步基因表達分析。樣品通過來自Affymetrix的基因表達微陣列huU133
2.0plus進行分析，然后通過與未處理/野生型(WT)細胞的比較來進一歩分析差異表達。如下所示，在高劑量化療劑選擇的細胞中，ABC轉運蛋白(藥物排出泵)(圖1A)和ALDH-同種型(解毒酶)(圖1B)的表達上調(diào)。因此，本發(fā)明的方法成功地富集表達高水平的已知CSC標志物的細胞群體。
[0123]CSC的另ー個特征是當它們放置在非貼壁培養(yǎng)條件時作為球體結構生長的能力。腫瘤球測定促進了 CSC在體外自我更新且防止分化。因此，將腫瘤球重新連續(xù)鋪板進ー步富集CSC。通過比較，在貼壁條件下`，培養(yǎng)細胞的塊代表分化的腫瘤細胞。使用源自人原發(fā)性NSCLC腫瘤材料的癌細胞，本發(fā)明人進行重新連續(xù)鋪板的腫瘤球相比于貼壁培養(yǎng)物中基因表達模式的差異分析..如圖2 A中所示，與分化的貼壁細胞相比，在腫瘤球中干細胞標志物ABCG2和ALDH1A1上調(diào)。使用兩個干細胞的’金標準’功能測定進一步證明球繁殖細胞的 CSC-特性:來自 Stem Cell Technologies (SCT)的 Aldefluor (AF)-測定和側群(side population, SP)測定[Godell 等人，1996, J.Exp.Med.183(4): 1797)]。AF+和SP+部分在腫瘤球中均顯著增加，確認腫瘤球測定是用于功能富集CSC的真正測定(圖2B 和 2C)。
[0124]使用人原發(fā)性CRC和NSCLC腫瘤材料，本發(fā)明人進行基因表達的差異分析，該分析比較了鋪板前的初始細胞(PO)、作為腫瘤球連續(xù)傳代的細胞和作為貼壁培養(yǎng)物連續(xù)傳代的細胞。通過來自Affymetrix的基因表達微陣列huU133 2.0plus分析樣品。分析考慮鑒定的差異表達基因的線性，線性被定義為在腫瘤球和貼壁代中一致的上調(diào)或下調(diào)。
[0125]鑒定了各種差異表達的基因，從該基因選擇編碼分泌或位于細胞表面上的蛋白的基因，因為本發(fā)明人認為該蛋白代表藥物最容易到達的目標。IL-1 P的表達在貼壁/分化代中是低且穩(wěn)定的，且被鑒定為原發(fā)性NSCLC中上調(diào)最高的基因之一(圖3A和B)，且在CRC中也輕微上調(diào)(圖3C和D)，這提示我們，IL-1 P可能在CSC的生物學中發(fā)揮重要作用。支持該假說的是，我們發(fā)現(xiàn)，ILl受體I(ILlRl)在NSCLC球中略有上調(diào)(圖3B)。在原發(fā)性CRC中，IL-1 ^只有略微上調(diào)，然而，ILlRl顯著上調(diào)(圖3D)。還發(fā)現(xiàn)IL-1 ^在通過高劑量化療劑選擇而針對CSC樣特征富集的細胞中上調(diào)(圖3E)。
[0126]實施例2 ,IL-1P和ILlRl基因的表達與癌癥患者中無腫瘤和整體存活的減少相關:
假設IL-13或其各自受體在腫瘤維持和轉移中發(fā)揮主要作用，本發(fā)明人使用計算機芯片上的方法來評價IL-1 ^和ILlRl對無疾病和整體存活的影響。使用針對ILlRl的探針組215561_s_at和針對ILl ^的205067_at或39402_at，發(fā)現(xiàn)ILlRl的低表達與肺腺癌I期患者中的生存益處和與在CRC中的延長的無疾病生存相關。ILlRl表達水平的差異沒有改變CRC中的整體生存(圖5A)。ILl ^的高表達顯示了朝向肺腺癌I期中的生存益處和CRC中的無疾病和整體生存的明顯益處的趨勢(圖5B)。選擇CRC和NSCLC適應癥用于分析，這是基于以下事實:我們使用源自患有這些腫瘤類型的患者的原發(fā)性材料進行了 CSC中IL-1 ^和ILlRl表達的初步鑒定。
[0127]實施例3..1LlRl在原發(fā)性CRC和NSCLC腫瘤細胞上表達，且在通過連續(xù)腫瘤球繁歹直雖集CSC后上iM:
IL-1B及其各自受體的RNA水平在功能富集的CSC或CSC樣細胞中上調(diào)。為了在蛋白水平上確定ILlRl的表達，進行源自患者的NSCLC原發(fā)性腫瘤樣品的FACS分析。在分析之前，患者材料作為在免疫缺陷小鼠的皮下(s.c.)異種移植物在體內(nèi)繁殖。將異種移植腫瘤酶促分解成單細胞，且使用市售熒光團綴合的抗體檢測ILlRl表面表達。將直接取自異種移植腫瘤的細胞中的ILlRl表達與作為腫瘤球連續(xù)傳代的源自異種移植物的細胞進行比較。ILlRl的蛋白表達存在于親本異種移植腫瘤細胞(圖4A)和源自異種移植的腫瘤球兩者上。然而，與親本細胞相比，腫瘤球中ILlRl蛋白表達更高；這與mRNA表達水平的發(fā)現(xiàn)是一致的，并且表明CSC具體依賴于ILl途徑。CSC-標志物⑶133在腫瘤球中也上調(diào)，提供了ILlRl是CSC相關表面分子的進ー步證據(jù)(圖4B)。
[0128]實施例4:1LlRl在源自人原發(fā)性腫瘤的CRC和NSCLC細胞系上表達，且其表達在CSC富集的腫瘤球中上調(diào)
為了進一步評價原發(fā)性NSCLC和CRC細胞表面上的ILlRl表達，使用市售多克隆抗體(AF269; R&D systems)和源自 Amgen 專利 W02004022718A2 的單克隆抗體(15C4)。后者抗體作為單克隆hlgG4產(chǎn)生。兩種抗體都用APC標記，且通過流式細胞術檢測表達。在圖7中可見，兩種抗體都能夠檢測到與貼壁細胞培養(yǎng)條件下生長的細胞相比在一輪球鋪板后NSCLC細胞中ILlRl表達的上調(diào)(圖7上小圖)，而在CRC細胞系中，球中ILlRl的上調(diào)是弱的，并且只能用多克隆抗體檢測到，但單克隆抗體檢測不到(圖7下小圖)。
[0129]這些結果與圖4中描述的結果是一致的，在圖4中，發(fā)現(xiàn)與新鮮分離的異種移植腫瘤細胞相比，在源自連續(xù)傳代的異種移植物的腫瘤球中ILlRl表達上調(diào)。
[0130]圖8顯示了對應于圖10中顯示的柱狀圖的源自原發(fā)性腫瘤的NSCLC和CRC細胞系各自的同種型對照(左邊和中間小圖的上方和下方)。當比較兩種抗ILlRl抗體吋，清楚地觀察到多克隆抗體對于目標識別具有更高的靈敏度，這最可能是由于識別多個表位引起的(圖7，右小圖的上方和下方)。
[0131 ] 實施例5 'LlRl的抗體阻斷在體外抑制腫瘤球形成
根據(jù)本發(fā)明觀察，由源自患者的原發(fā)性腫瘤生成的CSC-富集的腫瘤球的特征在于IL-1B和ILlRl基因表達和ILlRl蛋白表達的上調(diào)。因此，本發(fā)明人假設，IL-1途徑在CSC表型的發(fā)生和/或維持中起重要作用。為了測試IL-1信號傳遞在體外是否促進腫瘤球形成，將原發(fā)性NSCLC和CRC細胞系鋪板在腫瘤球培養(yǎng)條件下，且用一定濃度范圍的中和性山羊抗人ILlRl抗體或同種型匹配的陰性對照IgG處理所述細胞。此處，顯示在源自NSCLC (圖6A)和CRC患者的細胞系(圖6B)中，中和性抗體對ILlRl的抑制以劑量依賴的方式降低鋪板的細胞的球形成能力。這些結果支持針對IL-1途徑的治療作為抑制CSC擴增的方式的用途。
[0132]實施例6 ,ILlRl阻斷抑制IL-1P刺激的MAPKp38和STAT3磷酸化
顯示ILlRl的抗體阻斷部分抑制源自人原發(fā)性腫瘤的細胞系的腫瘤球形成。因此，本發(fā)明人考慮抑制IL-1信號傳遞是治療干預癌癥的可行策略，其具有抑制CSC功能的獨特潛力。為了評價可以用來提供IL-1途徑抑制劑的藥理學評價信息的潛在生物標志物，分析絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)p38和信號轉導子和轉錄激活子(STAT)3(已知其在IL1/IL1R1級聯(lián)中被磷酸化)的狀態(tài)。使用Pathscan ELISA (Cell Signaling)進行pMAPKp38和PSTAT3的檢測。將腫瘤球鋪板在缺乏生長因子的培養(yǎng)基中過夜，然后添加一定劑量范圍的重組IL-1 P，隨后孵育20 min。如圖9A和C中可見，作為ILl刺激后的早期事件，MAPKp38和STAT3以劑量依賴的方式發(fā)生磷酸化。在沒有用IL-1 ^刺激的情況下，已經(jīng)在腫瘤球培養(yǎng)物中檢測到pMAPKp38，而在貼壁生長的細胞中沒有檢測到，表明可能的自分泌活化回路在CSC中起作用(圖9 A和B)。在相同測定條件下，觀察到用抗ILlRl 15C4抗體的處理以劑量依賴的方式減少pMAPKp38和pSTAT3兩者的磷酸化(圖9 B和D)，pMAPKp38和pSTAT3的 IC50 分別為 0，69 nM 和 4，42 nM 。
[0133]可以得出結論，這兩種蛋白的磷酸化狀態(tài)可以用作針對鑒定抑制IL-1途徑的化合物的篩選級聯(lián)的讀出值，并且還代表用于體外和體內(nèi)藥理學研究的最有希望的生物標志物。因為圖9中的結果是初歩的，需要確認獲得的結果以建立穩(wěn)定的篩選級聯(lián)。
[0134]實施例7.?重會日IL-13誘導ILlRl在腫瘤球中的表達，而ILlRl的抗體阻斷下調(diào)ILlRl表達
為了建立最有希望的生物標志物，通過Western印跡分析上述相同樣品的ILlRl表達水平(圖9)。如圖1OA和C中可見，ILlRl的表達存在于腫瘤球中，并且在重組IL-1 @刺激后進ー步增加。在源自CRC的腫瘤球中，ILlRl的誘導遵循明顯的劑量依賴趨勢，而在NSCLC球中，我們觀察到ILlRl表達在高于I pg/mL濃度的降低；這表明在原發(fā)性NSCLC細胞中由于內(nèi)在高ILlP產(chǎn)生而導致的負反饋回路。這與我們在微陣列分析中的發(fā)現(xiàn)是一致的，表明原發(fā)性NSCLC球具有顯著較高水平的IL-1 ^ mRNA。用15C4抗ILlRl抗體處理后，IL-1 ^刺激的ILlRl表面表達降低，表明抗體參與觸發(fā)了受體降解(圖10 B和D)。
[0135]實施例8 ,CSC-富集的腫瘤球分泌ILl-響應性細胞因子hIL8和h VEGF，且ILlRl阻斷可以抑制這些細胞因子的產(chǎn)生
上面已經(jīng)顯示，IL-1生物活性可以通過監(jiān)測MAP38K和STAT3的磷酸化而在細胞系中檢測到。然而，為了支持臨床轉化，鑒定可以在容易收集的液體生物材料(諸如尿或血液)中檢測到的生物標志物將是重要的。細胞因子可以使用ELISA方法容易地在血清中測定。IL-1 P本身是ー種可以很容易地在血清樣品中監(jiān)測的細胞因子。公認的是，IL-1刺激其他細胞因子諸如IL-8和VEGF a的分泌。[0136]為了測試這些細胞因子是否可以用來監(jiān)測對抗ILlRl抗體的響應，在來自CSC-富集的腫瘤球培養(yǎng)物的上清液(SN)中測定IL-8和VEGF水平。當比較分化的(貼壁)和腫瘤球培養(yǎng)物的上清液吋，發(fā)現(xiàn)在來自腫瘤球的SN中，IL8誘導' 7倍(圖11A)，且VEGF誘導顯著(圖11B)。基于該觀察結果，測定來自抗ILlRl-Mab處理的腫瘤球的SN中的IL-8和VEGF水平(圖1lC和D)。如下面可見，ILlRl的阻斷以劑量依賴的方式降低IL-8水平(圖11C)，且還顯著降低了 VEGF水平(圖11D)。
[0137]這些數(shù)據(jù)將IL8和VEGF鑒定為可以用于評價IL-1途徑抑制劑在體內(nèi)的藥理學活性的候選生物標志物。與來自圖9和10的數(shù)據(jù)類似，該數(shù)據(jù)被認為是初歩的，因為它還沒有在重復實驗中證明。
[0138]實施例9 ,ILlRA藥物Kineret (Amgen)在體內(nèi)抑制源自CSC的異種移植腫瘤的生長且調(diào)節(jié)血清細胞因子
基于本發(fā)明人的觀察結果(即抗ILlRl抗體在體外抑制腫瘤球形成)，進ー步測試了在體內(nèi)CSC-異種移植模型中IL-1途徑的抑制。用于該體內(nèi)研究的最合適且隨時可獲得的分子是已知與mILlRl交叉反應的人ILlR-拮抗劑(IL1RA)。在此設置中，可以期望抗腫瘤活性與ILlRl抑制對腫瘤微環(huán)境(炎癥性浸潤細胞，間質成纖維細胞等)以及CSC區(qū)室的影響相關。ILlRA以商品名Kineret銷售，且專利由Amgen (W01989/011540)持有。目前，Kineret被批準用于治療類風濕關節(jié)炎。
[0139]使用熒光激活細胞分選(FACS)對源自從CRC(圖12A)和NSCLC(圖12B)患者獲得的原發(fā)性腫瘤的人細胞培養(yǎng)物分選Aldeflour陽性群體。Aldefluor是高醛脫氫酶活性(其與正常干細胞和CSC表型相關)的標志物。將分選的aldefluor陽性(AF+)細胞懸浮于基質膠中，且以非常低的細胞數(shù)(2xl04個細胞/小鼠)皮下注射到N0D/SCID免疫缺陷小鼠中?；|膠懸浮物含有5|ag/mL的Kineret上樣劑量，其相當于每天s.c.給藥后報告的Kineret血清水平。AF+細胞接種后I天開始，姆天用5mg或IOmg的Kineret (購自Biovitrum)或藥物媒介物處理 小鼠。施用途徑是臨床上對于Kineret標準的s.c.。
[0140]對于CRC模型每周監(jiān)測腫瘤體積，持續(xù)76天，對于NSCLC模型每周監(jiān)測腫瘤體積，持續(xù)91天。如在圖12中可見，在兩種模型中，我們觀察到腫瘤生長的劑量依賴的抑制。在CRC中，我們看到在5和10 mg劑量兩者的強烈抑制(圖12A)，而僅在10mg/kg的較高劑量實現(xiàn)了 NSCLC響應。兩種劑量都被小鼠良好耐受。
[0141]在第76天(CRC)或第91天(NSCLC)將來自每個研究組的三只小鼠處死。將腫瘤切下，分離成單細胞，且有活力地冷凍保存。還收集血清用于細胞因子檢測。對于其余小鼠，停止Kineret處理，且進一步監(jiān)測小鼠的腫瘤生長。當腫瘤達到倫理腫瘤負荷限值時，將小鼠處死，且收集腫瘤細胞和血清。停止Kineret處理后，在CRC研究中有一只小鼠幾乎沒有顯示任何進展，被指定為對Kineret的高響應者(高響應者)，具有生長緩慢的腫瘤的一只小鼠被指定為中間響應者(中等響應者)，且具有快速生長的腫瘤的一只小鼠被指定為低響應者(低響應者)。從所有處死的小鼠，我們還收集且凍存了來自股骨和脛骨的骨髓細胞用于可能的分析。
[0142]經(jīng)由ELISA的血清細胞因子分析顯示在CRC和NSCLC模型兩者中媒介物對照組中容易檢測到的人IL8和人VEGF水平(圖13)。用Kineret處理沒有改變小鼠血清中的hVEGF水平(圖13C);然而，發(fā)現(xiàn)hIL-8降低到檢測不到的水平(圖13A)。[0143]由于處理組的腫瘤的生長得到抑制，所以必須考慮降低的hIL8水平是降低的腫瘤大小的直接反映，因此hIL-8水平不能被驗證為異種移植模型中的藥效動力學響應的生物標志物(圖13A)。在CRC模型中的三種不同分類的響應者中，我們再次觀察到，hIL8的量與腫瘤大小密切對應(圖13B)，我們沒有看到VEGF水平的任何變化(圖13D)。
[0144]這些初步的藥理學研究表明，ILlRl抑制對于CRC和NSCLC源自CSC的異種移植模型在體內(nèi)是有效的。小鼠血清中的人IL-8水平可以用作這些模型中與腫瘤大小相關的疾病響應的生物標志物，并且其在將來將可用作其中不能直接測量腫瘤體積的原位模型中腫瘤負荷的替代物讀出值。人VEGF不能作為這些模型中的體內(nèi)生物標志物，因為ILlRl抑制對hVEGF血清水平?jīng)]有任何影響。
[0145]實施例10 腫瘤相關巨噬細胞(TAMs)通過涉及IL-1的機制在體外促進腫瘤球形成
腫瘤被所謂的腫瘤相關巨噬細胞(TAM)(已經(jīng)顯示促進腫瘤細胞増殖、腫瘤免疫逃避、轉移和血管生成)嚴重浸潤。巨噬細胞是在炎癥應答過程中分泌的IL-1的主要來源；考慮這一事實連同我們對于IL-1在支持CSC中作用的發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明人假設，源自巨噬細胞的IL-1可能代表支持腫瘤內(nèi)CSC生境的關鍵因素。
[0146]為了實驗上解決該假設，使用上面描述和開發(fā)的Herf/neu腫瘤球/TAM共培養(yǎng)模型。Her2/neu小鼠是大鼠HER2/neu癌基因轉基因的，所述大鼠HER2/neu癌基因在小鼠乳腺腫瘤病毒(MMTV)啟動子的轉錄調(diào)控之下。Her2/neU小鼠在 4個月齡自發(fā)發(fā)展出乳腺腫瘤。建立了用于從Her2/neu腫瘤分離TAM的方法，其包括切出原發(fā)性乳腺腫瘤，將腫瘤酶促分離成單細胞，通過磁珠分離陰性選擇(depletion)成纖維細胞、內(nèi)皮細胞和紅細胞譜系。然后經(jīng)由FACS將腫瘤細胞和TAM分選成不同群體。最后，將TAM連同Her2/neu腫瘤細胞置于促進腫瘤球的培養(yǎng)條件下(圖14A)。
[0147]培養(yǎng)的TAM不能形成 球體結構，然而HER2/neu腫瘤細胞容易形成乳腺腫瘤乳腺球(圖14B)。在多輪共培養(yǎng)實驗中，我們已經(jīng)顯示，TAM的存在一致促進HER2/neu腫瘤球形成。此外,腫瘤球數(shù)目隨著共鋪板的TAMs的數(shù)目增加而線性增加(圖14B)。
[0148]為了研究IL-1信號傳遞在TAM支持的腫瘤球生長中的可能作用，以兩種不同劑量的抗鼠ILlRl Mab處理HER2/neu-TAM共培養(yǎng)物。ILlRl阻斷對僅含有TAM或僅含有HER2/neu腫瘤細胞的培養(yǎng)物沒有顯著影響。然而，在共培養(yǎng)條件下，ILlRl阻斷導致Herf/neu腫瘤球形成的明顯的劑量依賴的降低(圖14C)，支持了 IL-1途徑在CSC的TAM-介導的支持中的作用。
[0149]因此，可以說，ILlRl抑制對于乳腺癌干細胞及其保護微環(huán)境具有影響。
【權利要求】
1.抑制ILl^與ILlRl結合和/或ILlRl與ILlRaCP異源二聚化的多肽，其用于治療個體中的癌細胞和/或癌干細胞(CSC)。
2.權利要求1的多肽，其用于治療CSC。
3.權利要求2的多肽，其用于治療CSC，其中所述CSC包含其他不是CSC的腫瘤細胞。
4.權利要求1的多肽，其用于治療癌細胞，其中所述癌細胞進一歩包含CSC。
5.權利要求1-4中任ー項的多肽，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中ILlR在所述CSC的表面上、但不是或基本上不是在不是CSC的腫瘤細胞上表達。
6.權利要求1-5中任ー項的多肽，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述癌干細胞至少對化療和/或放療是耐受的。
7.權利要求1-6中任ー項的多肽，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中待治療的癌癥選自:結腸直腸癌(CRC)、非小細胞肺癌(NSCLC)和乳腺癌。
8.權利要求1-7中任ー項的多肽，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述多肽與細胞生長抑制劑、細胞毒性劑或放療組合施用于所述個體。
9.權利要求8的多肽，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述細胞生長抑制劑或細胞毒性劑是抗癌抗體或化療劑。
10.權利要求8或9的多肽，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述多肽在所述細胞生長抑制劑或所述細胞毒性劑或所述放療治療之前、同時或之后應用于所述個體。
11.權利要求1-10中任ー項的多肽，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述多肽是人單克隆抗體、嵌合單克隆抗體或人源化單克隆抗體。
12.權利要求11的多肽，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述單克隆抗體是抗ILlRl抗體、抗ILl ^抗體、抗ILlaCP抗體、或靶向ILlRl和ILlRaCP的雙特異性抗體。
13.權利要求1-10中任ー項的多肽，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述多肽是重組的天然或修飾的IL1RA。
14.權利要求1-10中任ー項的多肽，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述多肽是ILlRl-1LlRaCP 融合蛋白。
15.權利要求1-14中任ー項的多肽，其用于治療癌細胞和/或CSC，其中所述多肽是藥物組合物的組分，所述藥物組合物包含治療有效量的所述多肽連同藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載體。
16.生物標志物用于在基于細胞的先體內(nèi)后體外測定中評價和預測藥劑對癌癥的作用的用途，其中 (i)所述生物標志物是IL-1Rl， (ii)所述細胞是在其表面上表達ILlRl的化療或放療耐受的癌干細胞(CSC)， (ii)且所述藥劑是如權利要求1-15中任ー項指定的治療性多肽。
17.權利要求16的生物標志物的用途，其中所述CSC通過用化療劑或通過放射處理個體的腫瘤組織樣品而作為這些腫瘤組織樣品的細胞亞群獲得。
18.權利要求16或17的生物標志物的用途，其中所述基于細胞的測定中的癌細胞源自患有NSCLC、CRC或乳腺癌的個體的樣品。
【文檔編號】A61P35/00GK103492416SQ201280018582
【公開日】2014年1月1日 申請日期:2012年4月13日 優(yōu)先權日:2011年4月15日
【發(fā)明者】A.澤希雷, M.沃爾夫, R.蒂格, H.薩布澤瓦里 申請人:默克專利股份公司