本發(fā)明涉及增強(qiáng)作為由雄激素生物合成雌激素的酶的芳香化酶的活性的芳香化酶活化劑。

背景技術(shù)：
雌激素在人體中主要在卵巢中生成，在體內(nèi)作為女性荷爾蒙作用。作為雌激素，已知有17β-雌二醇、雌酮、雌三醇等。雌激素與子宮內(nèi)膜的增殖、性功能的調(diào)節(jié)、骨代謝的調(diào)節(jié)、脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)等各種生理功能相關(guān)。如果伴隨著年齡增長或者卵巢功能的下降體內(nèi)的雌激素缺乏，則會出現(xiàn)更年期障礙、性功能降低、自主神經(jīng)失調(diào)、脂質(zhì)代謝異常、血管運(yùn)動障礙、骨質(zhì)疏松癥等癥狀。因此，為了改善上述癥狀，嘗試荷爾蒙補(bǔ)充療法。但是，不容易根據(jù)癥狀將適量的荷爾蒙劑外部給藥，另外，已知在雌激素或者類似雌激素的物質(zhì)的直接給藥中，會伴隨有乳腺癌、子宮癌等的各種副作用的風(fēng)險(xiǎn)。因此，尋求如天生的荷爾蒙分泌那樣溫和并且安全地補(bǔ)充雌激素缺乏的方法。芳香化酶是具有將由膽固醇生成的雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素（雌二醇）的作用的雌激素合成酶。作為使芳香化酶活化的物質(zhì)，一直以來已知有選自土常山、山金車花、茴香、姜黃、延胡索、延命草、黃芩、莪術(shù)、梓樹、枳實(shí)、山白竹、荊芥、決明子、厚樸、吳茱萸、柴胡、細(xì)辛、花椒、小豆蔻、錦葵、川芎、當(dāng)歸、西紅柿、珊瑚菜、白術(shù)、絲瓜、紅花、寬葉香蒲、百合、龍膽、松香、鳶尾根、野芝麻、芒柄花（Ononis）、甘草、苦參、葡萄柚、桂皮、龍膽草、黃杞、康德郎樹皮、鼠尾草、山楂、山藥、生姜、菖蒲、白樺、忍冬、英國山楂、西洋耆草、桑白皮、百里香、丁香、陳皮、云杉、黃蓍、金縷梅、白芷、假葉樹、防己、茅根、防風(fēng)、蛇麻草、麻黃、薰衣草、蘋果、荔枝、萵苣、檸檬、白花春黃菊以及地榆中的植物或者它們的提取物、以及酵母提取物、絲蛋白提取物、乳蛋白提取物、海藻糖、納豆提取物、蜂王漿、稻米油、水解小麥提取物、乳木果油、以及米發(fā)酵提取物（專利文獻(xiàn)1和2）?，F(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)1：日本特開第2005-343872號公報(bào)專利文獻(xiàn)2：日本特開第2005-343873號公報(bào)

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
即，在一個實(shí)施方式中，本發(fā)明提供下述式（I）所表示的化合物或者其溶劑化物用于制造芳香化酶活化劑的用途。（式中，虛線表示是或者不是雙鍵。但是，式中的a和b不能同時為雙鍵）。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供上述式（I）所表示的化合物或者其溶劑化物用于制造雌激素缺乏性疾病或者癥狀的預(yù)防和/或改善劑的用途。在其它的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供上述式（I）所表示的化合物或者其溶劑化物用于制造毛發(fā)生長調(diào)節(jié)劑的用途。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供上述式（I）所表示的化合物或者其溶劑化物用于制造皮膚老化改善劑的用途。在其它實(shí)施方式中，本發(fā)明提供上述式（I）所表示的化合物或者其溶劑化物用于制造皮膚外用劑的用途。在另外的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種芳香化酶活化方法，所述方法包括將上述式（I）所表示的化合物或者其溶劑化物對對象進(jìn)行給藥。在另外其它的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種雌激素缺乏性疾病或者癥狀的預(yù)防和/或改善方法，所述方法包括將上述式（I）所表示的化合物或者其溶劑化物對對象進(jìn)行給藥。在另外其它的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種毛發(fā)生長調(diào)節(jié)方法，所述方法包括將上述式（I）所表示的化合物或者其溶劑化物對對象進(jìn)行給藥。在另外其它的實(shí)施方式中，本發(fā)明提供一種皮膚老化改善方法，所述方法包括將上述式（I）所表示的化合物或者其溶劑化物對對象進(jìn)行給藥。具體實(shí)施方式在本說明書中，“非治療性”是不包括通過醫(yī)療行為、即治療對人體的處置行為的概念。在本說明書中，“改善”是指疾病或癥狀的好轉(zhuǎn)、疾病或癥狀的惡化的防止或者延遲、或者疾病或癥狀的進(jìn)行的逆轉(zhuǎn)、防止或延遲。在本說明書中，“預(yù)防”是指防止或者延遲個體的疾病或者癥狀的發(fā)病、或者降低個體的疾病或者癥狀的發(fā)病的危險(xiǎn)性。在本說明書中，“皮膚老化”包括由于雌激素缺乏引起的表皮·真皮厚度的減少、皮膚水分量的減少、血液循環(huán)障礙、骨膠原的減少、彈性的降低、皺紋的增加等的狀態(tài)。本發(fā)明涉及能夠通過增強(qiáng)作為由雄激素生物合成雌激素的酶的芳香化酶活性，從而安全地促進(jìn)體內(nèi)的雌激素生成的芳香化酶活化劑。本發(fā)明者們針對增強(qiáng)芳香化酶的活性的物質(zhì)進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)具有活化芳香化酶的作用的三萜型化合物。本發(fā)明的芳香化酶活化劑由于可以促進(jìn)體內(nèi)的雌激素生成，并且對人體的安全性高，因此作為以預(yù)防、改善或者治療由于雌激素缺乏引起的各種病變?yōu)槟康牡尼t(yī)藥或者化妝品等有用。本發(fā)明的芳香化酶活化劑以下述式（I）所表示的化合物或者其溶劑化物作為有效成分。（式中，虛線表示是或者不是雙鍵。但是，式中的a和b不能同時為雙鍵）。作為式（I）化合物的溶劑化物，除了使式（I）化合物溶解于溶劑而得到的通常的溶劑化物（例如水合物）之外，還可以列舉式（I）化合物從空氣中或者通過再結(jié)晶，吸收水分而形成的水合物。上述式（I）化合物如后述實(shí)施例所示，具有增強(qiáng)芳香化酶活性的作用。另外，通過式（I）化合物或者其溶劑化物，通過活化芳香化酶而促進(jìn)生物體內(nèi)的雌激素合成，由此，可以得到對由于雌激素引起的如下的疾病、癥狀或者狀態(tài)（身體科學(xué)No2192001日本評論社；女性荷爾蒙的作用和兩性差異的出現(xiàn)，玉舍輝彥著，金芳堂，2006年）的作用效果。1）關(guān)于骨代謝的作用：抑制副甲狀腺荷爾蒙的作用，抑制骨吸收，另外，促進(jìn)腎臟中的維生素D的活化，抑制骨質(zhì)疏松。2）關(guān)于高血脂癥的作用：防止由于雌激素的濃度降低導(dǎo)致的LPL（脂蛋白脂肪酶）活性亢進(jìn)而使LDL受體數(shù)減少，血中LDL蓄積進(jìn)而發(fā)展為粥樣硬化；使存在于血管內(nèi)皮中的mRNA的表達(dá)增加、使NO產(chǎn)生亢進(jìn)；促進(jìn)抗氧化作用、血管擴(kuò)張作用，對動脈硬化產(chǎn)生抑制性地作用。3）關(guān)于腦功能的作用：還報(bào)告有改善記憶、認(rèn)知功能、腦血流的變化等的腦功能，對感情或情緒也產(chǎn)生影響，與抑郁癥也有關(guān)聯(lián)。特別是關(guān)于老年癡呆癥，（i）作用于神經(jīng)細(xì)胞，增加Ach（乙酰膽堿）合成酶（膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶）的活性、（ii）刺激膽堿能神經(jīng)元中的神經(jīng)生長因子（NGF）或者腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子（BDNF）的受體等的表達(dá)、（iii）增加海馬中的突觸、（iv）作用于淀粉樣前體蛋白質(zhì)（APP），減少β-淀粉樣蛋白的蓄積減輕神經(jīng)細(xì)胞的損傷、（v）提高腦內(nèi)部的糖輸送和糖利用。4）關(guān)于更年期障礙的作用：改善由于雌激素的減少導(dǎo)致的下丘腦-下垂體-卵巢體系中的負(fù)反饋不工作，下丘腦、下垂體處于功能亢進(jìn)狀態(tài)，即改善由于LH（黃體生成素）、FSH（促卵泡刺激素）增加引起的自主神經(jīng)失調(diào)癥狀。5）關(guān)于眼的作用：抑制更年期之后的女性中多發(fā)的黃斑變性或者白內(nèi)障的發(fā)病。另外，改善淚腺功能，抑制干眼癥。6）關(guān)于毛發(fā)的作用：對于頭發(fā)通過延長生長期來促進(jìn)毛發(fā)的生長，對于體毛通過抑制生毛，減少體毛密度。7）美容效果：改善表皮·真皮厚度的減少，皮膚水分量的減少，或者血液循環(huán)障礙、骨膠原的減少、彈性的降低、皺紋的增加等狀態(tài)。因此，上述式（I）化合物或者其溶劑化物（以下稱為式（I）化合物等）可以作為用于芳香化酶活化、用于活體的雌激素缺乏性疾病或者癥狀的預(yù)防和/或改善、用于毛發(fā)生長調(diào)節(jié)、或者用于皮膚老化改善的有效成分使用。該用途可以為在人或者非人動物、或者來自于它們的組織、器官、細(xì)胞中的用途，另外，可以是治療性用途、也可以非治療性用途。作為上述雌激素缺乏性疾病或者癥狀，可以列舉骨質(zhì)疏松癥、高血脂癥、動脈硬化等的心血管障礙、抑郁癥、老年癡呆癥等的記憶障礙、更年期障礙、黃斑變性、白內(nèi)障、干眼癥等，優(yōu)選可以列舉表皮·真皮厚度的減少、皮膚水分量的減少、血液循環(huán)障礙、骨膠原的減少、彈性的降低、皺紋的增加等的狀態(tài)。根據(jù)本發(fā)明，可以提供作為有效成分含有上述式（I）化合物等的芳香化酶活化劑、雌激素缺乏性疾病或者癥狀的預(yù)防和/或改善劑、毛發(fā)生長調(diào)節(jié)劑、以及皮膚老化改善劑。在一個實(shí)施方式中，這些制劑本質(zhì)上由上述式（I）化合物等構(gòu)成。另外，根據(jù)本發(fā)明，可以提供上述式（I）化合物等用于制造芳香化酶活化劑、雌激素缺乏性疾病或者癥狀的預(yù)防和/或改善劑、毛發(fā)生長調(diào)節(jié)劑、或者皮膚老化改善劑的用途。進(jìn)一步，根據(jù)本發(fā)明，可以提供上述式（I）化合物等用于制造皮膚外用劑的用途。在一個實(shí)施方式中，這些制劑本質(zhì)上由上述式（I）化合物等構(gòu)成。在其它的實(shí)施方式中，上述雌激素缺乏性疾病或者癥狀選自骨質(zhì)疏松癥、高血脂癥、動脈硬化、抑郁癥、記憶障礙、老年癡呆癥、更年期障礙、黃斑變性、白內(nèi)障、以及干眼癥。另外，在其它實(shí)施方式中，上述毛發(fā)生長調(diào)節(jié)為頭發(fā)的生長促進(jìn)或者體毛的生毛抑制。進(jìn)一步，在其它的實(shí)施方式中，上述皮膚老化選自表皮·真皮厚度的減少、皮膚水分量的減少、血液循環(huán)障礙、骨膠原的減少、彈性的降低、以及皺紋的增加。通過上述雌激素缺乏性疾病或者癥狀的預(yù)防和/或改善劑的雌激素缺乏性疾病或者癥狀的預(yù)防和/或改善作用、通過上述毛發(fā)生長調(diào)節(jié)劑的毛發(fā)生長調(diào)節(jié)作用、以及通過上述皮膚老化改善劑的皮膚老化改善作用可以由芳香化酶活化產(chǎn)生。上述式（I）化合物等另外還可以用于制造用于芳香化酶活化、用于雌激素缺乏性疾病或者癥狀的預(yù)防和/或改善、用于毛發(fā)生長調(diào)節(jié)、或者用于皮膚老化改善的組合物、醫(yī)藥、準(zhǔn)醫(yī)藥品、化妝品等。上述組合物、醫(yī)藥、準(zhǔn)醫(yī)藥品、化妝品等可以作為人或者非人動物用而制造或者使用。上述式（I）化合物等可以配合于該組合物、醫(yī)藥、準(zhǔn)醫(yī)藥品、化妝品等中，可以是用于芳香化酶活化、用于雌激素缺乏性疾病或者癥狀的預(yù)防和/或改善、用于毛發(fā)生長調(diào)節(jié)或者用于皮膚老化改善的有效成分。另外，該組合物、醫(yī)藥、準(zhǔn)醫(yī)藥品、化妝品等也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。上述醫(yī)藥或者準(zhǔn)醫(yī)藥品含有上述式（I）化合物等作為有效成分。該醫(yī)藥或者準(zhǔn)醫(yī)藥品可以以任意的給藥方式進(jìn)行給藥。給藥可以是經(jīng)口，也可以是非經(jīng)口。作為用于經(jīng)口給藥的劑型，例如可以列舉如片劑、包覆片劑、顆粒劑、散劑、膠囊劑那樣的固體給藥形態(tài)，以及如酏劑、糖漿以及懸濁液那樣的液體給藥形態(tài)；作為用于非經(jīng)口給藥的劑型，可以列舉注射、輸液、經(jīng)皮、經(jīng)粘膜、經(jīng)鼻、經(jīng)腸、吸入、栓劑、丸劑、貼附劑等。上述醫(yī)藥或者準(zhǔn)醫(yī)藥品可以單獨(dú)含有上述式（I）化合物等，或者也可以與藥學(xué)上允許的載體組合來含有上述式（I）化合物等。作為所述的載體，例如可以列舉賦形劑、覆膜劑、結(jié)合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑、稀釋劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、分散劑、乳化劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、著色劑、紫外線吸收劑、保濕劑、增粘劑、活性增強(qiáng)劑、抗炎癥劑、殺菌劑、香料、矯味劑、矯臭劑等。另外，該醫(yī)藥或者準(zhǔn)醫(yī)藥品只要不失去式（I）化合物的芳香化酶活化作用，也可以含有其它的有效成分或者藥理成分。上述醫(yī)藥或者準(zhǔn)醫(yī)藥品可以通過常用方法由上述式（I）化合物等制得，或者根據(jù)需要與上述載體和/或其它有效成分或藥理成分組合而制得。該醫(yī)藥或者準(zhǔn)醫(yī)藥品中的上述式（I）化合物等的含量，換算為式（I）化合物只要為0.0001～50質(zhì)量%即可，優(yōu)選為0.001～10質(zhì)量%，更加優(yōu)選為0.01～1質(zhì)量%。上述化妝品含有上述式（I）化合物等作為有效成分。該化妝品可以單獨(dú)含有上述式（I）化合物等，或者也可以與作為化妝品所允許的載體組合來含有上述式（I）化合物等。作為所述的載體，例如可以列舉賦形劑、覆膜劑、結(jié)合劑、填充劑、崩解劑、潤滑劑、稀釋劑、滲透壓調(diào)節(jié)劑、pH調(diào)節(jié)劑、分散劑、乳化劑、防腐劑、穩(wěn)定劑、抗氧化劑、著色劑、紫外線吸收劑、保濕劑、增粘劑、活性增強(qiáng)劑、抗炎癥劑、殺菌劑、香料、矯味劑、矯臭劑等。另外，該化妝品只要不失去式（I）化合物的芳香化酶活化作用，也可以含有其它的有效成分或者化妝成分，例如保濕劑、美白劑、紫外線保護(hù)劑、細(xì)胞賦活劑、清潔劑、角質(zhì)溶解劑、彩妝成分（例如，底妝、粉底、白粉、香粉、腮紅、口紅、眼部彩妝、眉筆、睫毛膏、其它）等。作為制成化妝品情況下的形態(tài)，可以列舉乳霜、乳液、化妝水、懸濁液、凝膠、粉體、敷料、薄片、貼片、膏棒、粉餅等可以用于化妝品的任意的形態(tài)。上述化妝品可以通過常用方法由上述式（I）化合物等制得，或者根據(jù)需要通過常用方法組合上述載體和/或其它有的效成分或者化妝成分制得。該化妝品中的上述式（I）化合物等的含量，換算為式（I）化合物只要為0.0001～50質(zhì)量%即可，優(yōu)選為0.001～10質(zhì)量%，更加優(yōu)選為0.01～1質(zhì)量%。另外，本發(fā)明提供活化對象中的芳香化酶的方法。該方法包括對具有芳香化酶表達(dá)能力并且想活化芳香化酶的對象添加或者給藥上述式（I）化合物等的工序。作為給藥對象，可以列舉來自動物的組織、器官、細(xì)胞、或者它們的分離物、以及需要芳香化酶活化的動物。動物優(yōu)選為人或非人哺乳動物，更加優(yōu)選為人。在一個實(shí)施方式中，作為需要芳香化酶活化的動物，可以列舉患有雌激素缺乏性疾病或者癥狀的動物、疑似患有該病癥的動物、或者患有該病癥風(fēng)險(xiǎn)性高的動物、需要激素補(bǔ)充療法的動物、或者需要調(diào)節(jié)毛發(fā)生長或者改善皮膚老化的動物。在對象為培養(yǎng)細(xì)胞的情況下，上述方法可以通過將該細(xì)胞在上述式（I）化合物等的存在下培養(yǎng)來進(jìn)行。另外，根據(jù)本發(fā)明，上述式（I）化合物等可以用于雌激素缺乏性疾病或癥狀的預(yù)防和/或改善并向?qū)Υ擞行枰膶ο笠杂行Я拷o藥。作為給藥的對象，可以列舉患有該雌激素缺乏性疾病或癥狀的動物、疑似患有該病癥的動物、或者患有該病癥風(fēng)險(xiǎn)性高的動物。動物優(yōu)選為人或者非人哺乳動物、更加優(yōu)選為人。另外，根據(jù)本發(fā)明，上述式（I）化合物等可以用于活體的毛發(fā)生長調(diào)節(jié)并向?qū)Υ擞行枰膶ο笠杂行Я拷o藥。另外，根據(jù)本發(fā)明，上述式（I）化合物等可以用于活體的皮膚老化改善并向?qū)Υ擞行枰膶ο笠杂行Я拷o藥。作為給藥對象，優(yōu)選可以列舉人或者非人哺乳動物，更加優(yōu)選為人。優(yōu)選這些給藥是以美容目的的毛發(fā)生長調(diào)節(jié)或者皮膚老化改善為目的非治療性地進(jìn)行。在上述本發(fā)明的方法的一個實(shí)施方式中，上述雌激素缺乏性疾病或者癥狀選自骨質(zhì)疏松癥、高血脂癥、動脈硬化、抑郁癥、記憶障礙、老年癡呆癥、更年期障礙、黃斑變性、白內(nèi)障、以及干眼癥。在其它的實(shí)施方式中，上述毛發(fā)生長調(diào)節(jié)為頭發(fā)的生長促進(jìn)或者體毛的生毛抑制。另外，在其它的實(shí)施方式中，上述皮膚老化選自表皮·真皮厚度的減少、皮膚水分量的減少、血液循環(huán)障礙、骨膠原的減少、彈性的降低、以及皺紋的增加。在上述本發(fā)明的方法中，添加或者給藥式（I）化合物等的濃度，在對象為培養(yǎng)細(xì)胞的情況下，作為換算為式（I）化合物的培養(yǎng)物中的最終濃度為0.00000001～1.0%（v/v），優(yōu)選為0.0000001～0.1%（v/v），更加優(yōu)選為0.000001～0.01%（v/v），在對成人給藥的情況下，換算為式（I）化合物每一天可以為0.000001～10000mg/kg，優(yōu)選為0.00001～1000mg/kg，更加優(yōu)選為0.0001～100mg/kg。在一個實(shí)施方式中，式（I）化合物等可以經(jīng)皮給藥。實(shí)施例以下，展示實(shí)施例，進(jìn)一步具體地說明本發(fā)明。制造例1：化合物1和2的調(diào)制在2000g鳶尾根（OrrisRoot：株式會社栃本天海堂）中加入23L己烷，在室溫下進(jìn)行5天的提取。將提取液進(jìn)行減壓濃縮，得到25.7g提取物。將該提取物用硅膠柱色譜儀（己烷:乙酸乙酯=2:1→1:1→氯仿:甲醇=7:1）進(jìn)行分離，得到4.65g分離物。接下來，用ODS柱色譜儀（甲醇→乙醇→異丙醇）進(jìn)行分離，得到1.21g分離物。接下來，使用得到的1.21g組分中的0.12g通過ODS分離（水:乙腈=4:6→0:10）進(jìn)行分離，得到分離物14.8mg。接下來，將用ODS循環(huán)分離（水:乙腈=15:85）第4次循環(huán)中洗脫的94分鐘和102分鐘的峰分離。將102分鐘的峰進(jìn)一步用ODS循環(huán)分離（水:甲醇=10:90）循環(huán)，分離第7次中洗脫的71分鐘的峰，得到4.4mg化合物1。另外，對于94分鐘的峰，進(jìn)一步用ODS循環(huán)分離（水:甲醇=10:90）循環(huán)，將第7次循環(huán)中洗脫的52分鐘的峰分離，得到1.2mg化合物2。化合物11H-NMR(CDCl3，δppm)：0.62(s，3H)，0.83(d，J=6.7Hz，3H)，0.86(s，3H)，1.09(s，3H)，1.16(s，3H)，1.54(s，3H)，1.69(s，3H)，1.84(brs，3H)，1.0～2.2(m，20H)，2.58(m，2H)，3.31(d，J=9.5Hz，1H)，3.60(t，J=6.4Hz，2H)，4.98(m，1H)，5.31(m，1H)，10.2(s，1H)化合物21H-NMR(CDCl3，δppm)：0.52(s，3H)，0.82(d，J=6.7Hz，3H)，0.94(s，3H)，1.09(s，3H)，1.17(s，3H)，1.52(s，3H)，1.84(brs，3H)，1.0～2.2(m，21H)，2.27(m，1H)，2.57(m，2H)，3.31(d，J=9.5Hz，1H)，3.61(t，J=6.4Hz，2H)，4.50(brs，1H)，4.81(brs，1H)，4.93(t，J=7.0Hz，1H)，10.2(s，1H)試驗(yàn)例1：化合物1以及2的芳香化酶活化效果參考StampferMJ，WillettWC，ColditzGA，RosnerB，SpeizerFEandHennenkensCH，N.Engl.J.Med.，313，1044-1049，1985，調(diào)查在制造例1中調(diào)制的化合物1和2的芳香化酶活化效果。在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（FALCON）中，接種來自人皮膚的纖維芽細(xì)胞（HDF1616：KURABO），培養(yǎng)至融匯狀態(tài)。除去培養(yǎng)基，加入900μL無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24小時。此時，在孔中加入使用95%乙醇水溶液使最終濃度為4.65×10-6mol/L的制得的化合物1或者化合物2。另外，作為對照準(zhǔn)備加入有95%乙醇水溶液的樣品，和什么也不添加的樣品（非添加）。在無血清培養(yǎng)基中加入作為芳香化酶的基質(zhì)的1β-3H-雄甾-4-烯-3,17-二酮（1β-3H-androst-4-ene-3,17-dione）（PerkinElmer）至37kBq/100μL，在各孔中分別添加100μL，培養(yǎng)24小時。從一個孔中取900μL到2mL的管中，加入1mL的CHCl3劇烈攪拌。以15,000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，將上層（水層）移至其它管中，加入200μL的Charcoal/Dextran（右旋糖酐（Dextran）包覆的木炭（Charcoal）（SIGMA）、將5g懸濁于50mL的水中得到的物質(zhì)）混合均勻，在室溫下放置30分鐘。以15,000rpm的轉(zhuǎn)速離心10分鐘，將上層清液移至新的管中。加入1mL的CHCl3劇烈攪拌，在15,000rpm的條件下離心分離10分鐘，將上層（水層）加入到5mL的UltimaGold（PerkinElmer）中，用液體閃爍計(jì)數(shù)器（PerkinElmerTricarb2550）測定3H的放射活性。作為本底（background）將不含有細(xì)胞的相同無血清培養(yǎng)基不添加試劑地培養(yǎng)同樣的時間，之后也進(jìn)行同樣的操作測定3H的放射活性，從上述測定值中減去該值。通過芳香化酶的反應(yīng)，1β-3H-雄甾-4-烯-3,17-二酮放出3H2O，轉(zhuǎn)化為沒有放射性的雌激素。檢測在該實(shí)驗(yàn)法中放出的3H2O的放射活性，放射活性越高表示芳香化酶的活性越高。如表1所示，對照（非添加）中基本沒有基質(zhì)的分解，相對于此，添加有化合物1或2的細(xì)胞中都得到了由于芳香化酶基質(zhì)的分解產(chǎn)生的高放射活性，因此，顯示化合物1和2活化存在于細(xì)胞中的芳香化酶。[表1]樣品添加量（mol/L）芳香化酶活性（fmol/天/孔）化合物14.65×10-621.68化合物24.65×10-622.34對照6.85