專利名稱：一種抗耐藥性的順鉑礦化液及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
一種抗耐藥性的順鉑礦化液及其制備方法和應(yīng)用技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于配位化學(xué)和藥學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種抗耐藥性的順鉬礦化液及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
腫瘤治療一直是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中難以克服的課題，順鉬藥物對于腫瘤的治療是一種重要手段，而這種方法現(xiàn)在遇到的難題是隨著藥物化療過程的進(jìn)行，腫瘤會體現(xiàn)出獲得性的抵抗,這種抵抗使腫瘤組織對于化療藥物不再敏感,產(chǎn)生耐藥性,最終導(dǎo)致化療失敗。
耐藥性產(chǎn)生的原因可能是如下三種(I)細(xì)胞對于鉬類藥物的攝取量不足；⑵細(xì)胞中代謝的富含-NH2以及-SH的小分子和蛋白能夠絡(luò)合鉬類藥物，使其無法和DNA結(jié)合發(fā)揮作用；(3)鉬類藥物和DNA形成加合物之后，修復(fù)蛋白能夠識別破壞位點(diǎn)，完成對DNA的修復(fù)(D. J. Stewart, Oncology/Hematology 2007,63,12-31)。
其中談?wù)摫容^多的是細(xì)胞內(nèi)鉬的積累，產(chǎn)生耐藥的細(xì)胞在細(xì)胞膜上往往表達(dá)出相對較少的 Ctrl 蛋白(S.1shida, J. Lee, D. J. Thiele,1. Herskowitz, Proceedings of the National Academy of Sciences 2002,99,14298-14302.),這種蛋白是鉬類藥物進(jìn)入細(xì)胞的主要運(yùn)輸體，該蛋白的表達(dá)減少致使耐藥腫瘤細(xì)胞對于鉬類藥物的攝取減少，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)較少的DNA會被鉬類藥物破壞。
為了增加細(xì)胞對于鉬類藥物的攝取量，有報道將納米技術(shù)引入這種化療過程(R. Sinha, G.J.Kim, S.Nie, D. M. Shin, Molecular Cancer Therapeutics2006,5, 1909-1917.)，有機(jī)嵌段高分子，碳納米管，金納米晶體等都用來作為鉬類藥物的載體，用于藥物從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的傳遞。但是這些納米材料存在生物安全性的問題，它們往往在生理?xiàng)l件下不可降解，材料本身可能就具有破壞正常細(xì)胞的能力，進(jìn)而引起較大的副作用。所以，關(guān)于鉬類藥物的修飾與改造一直在研究中，不過目前對于耐藥腫瘤有效的治療方法依然不是很多。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供了一種抗耐藥性的順鉬礦化液及其制備方法和應(yīng)用，使用該方法制得的順鉬礦化液可以提高腫瘤細(xì)胞對鉬的攝取，逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對于藥物的抗藥性，而且具有較小的副作用。
一種抗耐藥性的順鉬礦化液的制備方法，包括以下步驟
(I)將順鉬加入到改進(jìn)型的DMEM培養(yǎng)基中，在含CO2的環(huán)境中進(jìn)行取代反應(yīng)，反應(yīng)完成后得到取代的中間體溶液；
(2)向步驟(I)得到的取代的中間體溶液中加入含鈣無機(jī)鹽，在含CO2的環(huán)境中進(jìn)行礦化反應(yīng)，反應(yīng)完成后得到納米固化的中間體體系；
(3)向步驟⑵得到的納米`固化的中間體體系中加入胎牛血清蛋白，得到所述的順鉬礦化液；
所述的改進(jìn)型的DMEM培養(yǎng)基為將DMEM培養(yǎng)基中的CaCl2、KCl和NaCl分別替換為 Ca (NO3) 2、KNO3 和 NaNO3 后得到；
其中步驟(I)和步驟(2)中，所述的含CO2的環(huán)境中CO2的含量為3 7%，具體可以通過培養(yǎng)箱進(jìn)行調(diào)節(jié)。
本發(fā)明中，所述的改進(jìn)型的DMEM培養(yǎng)基中的氯離子被硝酸根離子代替，而所述順鉬的氯配體容易在低氯環(huán)境下離去，因此以該改進(jìn)型的DMEM培養(yǎng)基作為組分，順鉬的氯配體會發(fā)生解離，然后被碳酸根和磷酸根取代，從而完成順鉬的修飾；再通過加入含鈣無機(jī)鹽，將鈣離子引入反應(yīng)體系，在生理?xiàng)l件(一般為37°〇，5%0)2，？!1為7. 2)下鈣離子與修飾有碳酸根或磷酸根的鉬體系發(fā)生作用，發(fā)生礦化反應(yīng)形成納米粒子；最后通過加入胎牛血清蛋白終止反應(yīng)，使納米粒子不再增大，得到的順鉬礦化液可以直接使用。
所述的DMEM培養(yǎng)基的具體組分為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，具體可以為DMEM(H)培養(yǎng)基或DMEM (L)培養(yǎng)基。
作為優(yōu)選，所述的改進(jìn)型的DMEM培養(yǎng)基中，Ca(NO3)2的濃度為420 430mg/l ； KNO3 的濃度為 540 550mg/l ；NaNO3 的濃度為 9300 9310mg/l。
作為優(yōu)選，步驟⑴中，所述的取代反應(yīng)為20 24h。
作為優(yōu)選，步驟(2)中，所述的含鈣無機(jī)鹽為Ca(NO3)2，采用硝酸鈣時，溶解度較大，而且硝酸根負(fù)離子對生物礦化反應(yīng)的影響較小。
作為優(yōu)選，步驟⑵中，所述的含鈣無機(jī)鹽加入后的濃度為4mol/L 10mol/L，所述含鈣無機(jī)鹽的離子濃度會影響所述礦化反應(yīng)的速度，進(jìn)而影響所述納米固化的中間體體系中的納米粒子的粒徑尺寸和產(chǎn)量，濃度過大產(chǎn)生的納米粒子尺寸太大，濃度過小產(chǎn)生的納米粒子產(chǎn)量太低，這都會影響最后得到的順鉬溶液的對耐藥腫瘤的抑制效果。
作為優(yōu)選，步驟⑵中，所述的礦化反應(yīng)的時間為4 8小時，反應(yīng)時間會影響納米粒子粒徑的尺寸和產(chǎn)量，時間過長產(chǎn)生的納米粒子尺寸過大，時間太短產(chǎn)生的納米粒子產(chǎn)量過低，這都會使得到的順鉬溶液的對耐藥腫瘤的抑制效果下降。
本發(fā)明還提供了一種抗耐藥性的順鉬礦化液，該順鉬礦化液由上述的制備方法制備得到。采用MTT方法分別檢測該順鉬礦化液和未經(jīng)過生物礦化的順鉬對于人的肺癌細(xì)胞株A549及其耐藥細(xì)胞株A549/DDP的殺傷和抑制作用，結(jié)果顯示，同未經(jīng)過生物礦化的順鉬相比，該順鉬礦化液的藥效明顯增強(qiáng)。
通過構(gòu)建耐藥腫瘤的動物模型，采用皮下腫瘤移植的技術(shù)在裸鼠的腋下種上 A549/DDP細(xì)胞形成的耐藥腫瘤組織，并采用尾靜脈注射的方式化療，分別使用未經(jīng)過生物礦化的順鉬和所述的順鉬礦化液并對結(jié)果進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，對于未經(jīng)過生物礦化的順鉬無法治療的耐藥腫瘤，所述的順鉬礦化液依然顯示除了良好的治療效果。
本發(fā)明還提供了所述的抗耐藥性的順鉬礦化液在抑制癌細(xì)胞中的應(yīng)用，使用該順鉬礦化液可以使原來順鉬藥物難以控制的腫瘤得以控制。
同現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果體現(xiàn)在
(I)本發(fā)明提 供的生物礦化的原位修飾有效的改變了順鉬藥物進(jìn)入細(xì)胞的方式， 修飾之后的順鉬藥物是以依賴于溶酶體的細(xì)胞內(nèi)吞的方式進(jìn)入細(xì)胞，修飾之前的順鉬藥物主要依賴細(xì)胞膜上的銅轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Ctrl的運(yùn)輸作用內(nèi)化進(jìn)入細(xì)胞。這種方式的改變可以有效提高因Ctrl表達(dá)下降而產(chǎn)生抵抗的耐藥腫瘤細(xì)胞中的鉬含量，從而可以有效提高藥效；
(2)本發(fā)明提供的生物礦化的原位修飾明顯增強(qiáng)了順鉬藥物對于A549細(xì)胞的殺傷力，并且同時對于順鉬作用效果不佳A549/DDP細(xì)胞也有明顯的療效；
(3)本發(fā)明提供的生物礦化的原位修飾明顯增強(qiáng)了順鉬藥物對于小鼠體內(nèi)耐藥腫瘤的抑制效果，使原來順鉬藥物難以控制的腫瘤得以控制。


圖1為納米固化的順鉬水解中間體的透射電子顯微鏡照片(TEM)，圖中標(biāo)尺為 IOOnm(白色)以及500nm(黑色)；
圖2為納米固化的順鉬水解中間體的粒徑分布；
圖3為納米固化的順鉬水解中間體的能譜分析；
圖4為流式細(xì)胞儀分析納米固化順鉬中間體的吞噬效率，a，c，e為用FITC-BSA標(biāo)記的納米固化順鉬中間體作用的細(xì)胞的熒光照片和流式結(jié)果，b，d，f為只用FITC-BSA處理的細(xì)胞的熒光照片和流式結(jié)果。圖中標(biāo)尺為1(^!11(白色)；
圖5為順鉬以及生物礦化修飾順鉬的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)；
圖6為不含順鉬的獨(dú)立的礦化修飾液對于細(xì)胞的兼容性實(shí)驗(yàn)，a為不含順鉬的礦化修飾液的能譜分析，b為不含順鉬的礦化修飾液的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)。
圖7為順鉬以及生物礦化順鉬的耐藥瘤小鼠動物實(shí)驗(yàn)，a)A549/DDP耐藥瘤在不同藥物治療作用下的生長曲線，b)不同藥物治療16天后小鼠外形以及腫瘤的形貌以及大小的照片(圖中標(biāo)尺為1cm)，c)不同藥物治療16天后耐藥腫瘤的質(zhì)量，d)不同藥物治療的耐藥腫瘤小鼠的體重變化。
具體實(shí)施方式
所用的順鉬藥物，無機(jī)鹽，有機(jī)小分子以及蛋白質(zhì)都是化學(xué)純以上進(jìn)口試劑，下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明，應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
實(shí)施例1
本發(fā)明采用原位生物礦化的技術(shù)，在改進(jìn)型的DMEM培養(yǎng)基(又稱為低氯培養(yǎng)基) 中，利用細(xì)胞培養(yǎng)的條件，反應(yīng)生成順鉬的納米固化水解中間體，并且進(jìn)行了形貌，粒徑和元素的分析，分別參見圖1，圖2，圖3。
具體步驟如下
1、順鉬的水解平衡與取代
10 組順鉬(0，2. 188，3. 125，4，375，6. 250，8. 750，12. 500，17. 500，25. 000，35. 000 μ Μ)加入到2ml低氯培養(yǎng)基中平衡24小時后，條件為37°C，95%空氣氛圍，5% CO2, PH為7. 2，低氯培養(yǎng)基中的碳酸根和磷酸根會自發(fā)取代分子中的氯配體，完成藥物的修飾， 約有10%的順鉬分子進(jìn)入到納米固化中間體中，該低氯培養(yǎng)基的配方如下
權(quán)利要求
1.一種抗耐藥性的順鉬礦化液的制備方法，其特征在于，包括以下步驟(1)將順鉬加入到改進(jìn)型的DMEM培養(yǎng)基中，在含CO2的環(huán)境中進(jìn)行取代反應(yīng)，反應(yīng)完成后得到取代的中間體溶液；(2)向步驟(I)得到的取代的中間體溶液中加入含鈣無機(jī)鹽，在含CO2的環(huán)境中進(jìn)行礦化反應(yīng)，反應(yīng)完成后得到納米固化的中間體體系；(3)向步驟(2)得到的納米固化的中間體體系中加入胎牛血清蛋白，得到所述的順鉬礦化液；所述的改進(jìn)型的DMEM培養(yǎng)基為將DMEM培養(yǎng)基中的CaCl2、KCl和NaCl分別替換為 Ca (NO3) 2、KNO3 和 NaNO3 后得到。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗耐藥性的順鉬礦化液的制備方法，其特征在于，所述的改進(jìn)型的DMEM培養(yǎng)基中，Ca(NO3)2的濃度為420 430mg/l ；ΚΝ03的濃度為540 550mg/l ； NaNO3 的濃度為 9300 9310mg/l。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗耐藥性的順鉬礦化液的制備方法，其特征在于，步驟(I) 中，所述的取代反應(yīng)為20 30小時。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗耐藥性的順鉬礦化液的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中，所述的含鈣無機(jī)鹽為Ca (NO3) 2。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的抗耐藥性的順鉬礦化液的制備方法，其特征在于，步驟 (2)中，所述的含鈣無機(jī)鹽加入后的濃度為4mol/L 10mol/L。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗耐藥性的順鉬礦化液的制備方法，其特征在于，步驟(2) 中，所述的礦化反應(yīng)的時間為4 8小時。
7.一種抗耐藥性的順鉬礦化液，其特征在于，所述的順鉬礦化液由權(quán)利要求1 6任一項(xiàng)所述的制備方法制備得到。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的抗耐藥性的順鉬礦化液在抑制癌細(xì)胞中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種抗耐藥性的順鉑礦化液的制備方法，包括以下步驟(1)將順鉑加入到改進(jìn)型的DMEM培養(yǎng)基中，在類似生理?xiàng)l件下反應(yīng)得到取代的中間體溶液；(2)向得到的取代的中間體溶液中加入含鈣無機(jī)鹽，在類似生理?xiàng)l件下反應(yīng)得到納米固化的中間體體系；(3)向得到的納米固化的中間體體系中加入胎牛血清蛋白，得到所述的順鉑礦化液。本發(fā)明還公開了該制備方法制得的順鉑礦化液及其應(yīng)用，該順鉑礦化液對腫瘤細(xì)胞具有更強(qiáng)的殺傷力，并且對于順鉑難以治療的具有明顯耐藥性的腫瘤具有明顯的治療效果。
文檔編號A61K33/24GK103043635SQ20121057165
公開日2013年4月17日 申請日期2012年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月25日
發(fā)明者陳偉, 肖云, 劉雪瑤, 陳燕紅, 章嬌嬌, 徐旭榮, 唐?？?申請人:浙江大學(xué)