專利名稱：血管緊張素Ⅱ提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)心肌缺血損傷能力的用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種血管緊張素II提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)心肌缺血損傷能力用途。
背景技術(shù)：
血管緊張素II是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的重要成員。作為一種多功能肽，涉及多種生物學(xué)進(jìn)程，包括增殖、生長(zhǎng)、血管生成等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrow mesenchymal stem cells, MSCs)是具有多向分化潛能的骨髓干細(xì)胞中的一類。研究表明骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞能夠分化成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞等。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植技術(shù)是近年來(lái)發(fā)展迅速且頗具前景的組織修復(fù)的手段。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞除了向心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞分化以外，還通過(guò)旁分泌促進(jìn)組織保護(hù)和修復(fù)。然而骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植保護(hù)和修復(fù)組織的效果還不理想，主要是干細(xì)胞移植到缺血組織后面臨的惡劣的微環(huán)境，包括局部缺血缺氧和缺少營(yíng)養(yǎng)因子等，使干細(xì)胞存活率較低，分泌生長(zhǎng)因子較少，分化率低，組織保護(hù)和修復(fù)作用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供血管緊張素II提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)心肌缺血損傷能力用途。本發(fā)明采用的技術(shù)方案具體如下
血管緊張素II提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)心肌缺血損傷能力用途，是在常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為50 5000nmol/L的血管緊張素II及終體積濃度為10%的胎牛血清。所述的常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基為低糖DMEM培養(yǎng)基；
然后將經(jīng)傳代培養(yǎng)穩(wěn)定的的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞置于上述培養(yǎng)基中，于37°C、C02體積濃度為5%、空氣體積濃度95%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)6 24小時(shí)；
然后將培養(yǎng)后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞用于移植到大鼠缺血心肌組織。


圖1為用GFP標(biāo)記骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)的方法觀察MSCs移植到大鼠心梗及周邊區(qū)域后的存活情況。其中，圖1a是心梗模型組，圖1b是單純MSCs移植組，圖1c是用血管緊張素II處理的MSCs移植組；由圖可見(jiàn)心梗模型組沒(méi)有移植GFP標(biāo)記的干細(xì)胞所以沒(méi)有發(fā)出熒光的干細(xì)胞。單純MSCs移植組可以看到存活的干細(xì)胞發(fā)出的比較弱和少的熒光。用血管緊張素II處理的MSCs移植組可以看到存活的干細(xì)胞發(fā)出較強(qiáng)的熒光。因此，用血管緊張素II處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后存活情況更好。圖2為免疫組化法分析用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后心肌缺血組織血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)表達(dá)的情況。其中，圖2a是偽手術(shù)組，圖2b是心梗模型組，圖2c是單純MSCs移植組，圖2d是用血管緊張素II處理的MSCs移植組；由圖可見(jiàn)偽手術(shù)組和心梗模型組心肌缺血組織及其周邊表達(dá)的VEGF很少，單純MSCs移植組和用血管緊張素II處理的MSCs移植組表達(dá)的VEGF升高，后者明顯高于前者。因此，用血管緊張素II處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后干細(xì)胞分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的能力更高，更有利于干細(xì)胞的存活和分化。圖3為免疫組化法分析用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后心肌缺血組織及其周邊組織微小血管形成的情況(以VDI因子表達(dá)情況為指示)。圖3a是偽手術(shù)組，圖3b是心梗模型組，圖3c是單純MSCs移植組，圖3d是用血管緊張素II處理的MSCs移植組。由圖可見(jiàn)用血管緊張素II處理的MSCs移植組微小血管密度高于MSCs移植組。因此，用血管緊張素II處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后微小血管密度更高，說(shuō)明干細(xì)胞分化成內(nèi)皮細(xì)胞程度更高，進(jìn)而更有利于修復(fù)心肌缺血組織。圖4為Masson染色法分析用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后心肌缺血組織纖維化程度；圖4a是偽手術(shù)組，圖4b是心梗模型組，圖4c是單純MSCs移植組，圖4d是用血管緊張素II處理的MSCs移植組；由圖可見(jiàn)偽手術(shù)組組織纖維化程度最低；心梗模型組組織纖維化程度最高；用血管緊張素II處理的MSCs移植組組織纖維化程度明顯低于單純MSCs移植組。因此，用血管緊張素II處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后心肌缺血組織纖維化程度更低，干細(xì)胞修復(fù)心肌缺血損傷能力更強(qiáng)。圖5為TTC染色法分析用本發(fā)明所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后心肌梗死面積的情況；圖中從左到右各組依次為偽手術(shù)組、心梗模型組、單純MSCs移植組、用血管緊張素II處理的MSCs移植組。由圖可見(jiàn)偽手術(shù)組梗死面積最小，心梗模型梗死面積最大，用血管緊張素II處理的MSCs移植組梗死面積明顯小于單純MSCs移植組，P〈0. 01。因此，用血管緊張素II處理的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后心肌缺血組織梗死面積減小，干細(xì)胞修復(fù)心肌缺血損傷能力更強(qiáng)。圖6為超聲心動(dòng)圖分析用`本發(fā)明所述的培養(yǎng)基培養(yǎng)的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植后心功能改善的情況。圖6a為移植干細(xì)胞2天后與21天后，實(shí)驗(yàn)各組心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)的變化值的柱狀圖。圖中從左到右各組依次為偽手術(shù)組、心梗模型組、單純MSCs移植組、用血管緊張素II處理的MSCs移植組。由圖可見(jiàn)偽手術(shù)組EF值下降最少，心梗模型組EF值下降最多，用血管緊張素II處理的MSCs移植組EF值下降程度明顯小于單純MSCs移植組，P〈0.01。圖6b為移植干細(xì)胞21天后，實(shí)驗(yàn)各組心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)柱狀圖。圖中從左到右各組依次為偽手術(shù)組、心梗模型組、單純MSCs移植組、用血管緊張素II處理的MSCs移植組。由圖可見(jiàn)偽手術(shù)組EF最高，心梗模型組EF值最低，血管緊張素II處理的MSCs移植組EF值明顯高于單純MSCs移植組，P〈0. 01。血管緊張素II處理的干細(xì)胞修復(fù)心肌缺血損傷效果更好。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此
實(shí)施例11.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取。麻醉大鼠，在無(wú)菌條件下取其股骨、脛骨骨干，用低糖DMEM (L-DMEM)沖洗骨髓腔，將沖出的骨髓液移入預(yù)先置有Percoll細(xì)胞分離液的離心管中離心。收集中間層的單個(gè)核細(xì)胞，用L-DMEM洗滌2次之后接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，用含胎牛血清的L-DMEM在37 V，5 % C02的條件下進(jìn)行培養(yǎng)；根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)情況，每2天半量換液I次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿瓶底的80 90 %時(shí)細(xì)胞傳代。使用第3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。2.向低糖DMEM培養(yǎng)基中加入胎牛血清使其終體積濃度為10%，再加入血管緊張素II，使其終濃度分別為50nmol/L、100nmol/L、1000nmol/L、5000nmol/L ;待細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)基下生長(zhǎng)至鋪滿瓶底的70 %時(shí)，換成上述配好的培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)6 24小時(shí)后，獲得處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到大鼠缺血心肌組織。以下有益效果以血管緊張素II終濃度為lOOnmol/L的培養(yǎng)基培養(yǎng)干細(xì)胞12小時(shí)的應(yīng)用效果為例。3.大鼠心肌缺血模型的建立及干細(xì)胞移植。用10%水合氯醛麻醉大鼠。大鼠麻醉后做心電圖(ECG)。固定大鼠、消毒、備皮。連接呼吸機(jī)。在大鼠肩下約兩指位置縱向剪口 1cm，鈍性分離肌肉，直到見(jiàn)3-4肋間，鈍性撕開(kāi)3-4肋間，用擴(kuò)胸器保持開(kāi)口，剪開(kāi)心包膜，結(jié)扎左心耳下緣2-3mm處。關(guān)胸并縫合皮膚。20min后再做ECG觀察結(jié)扎是否成功。移植前，將干細(xì)胞消化下來(lái)、計(jì)數(shù)、離心、重懸、輕吹混勻，吸取細(xì)胞懸液進(jìn)入舒銳⑧一次性無(wú)菌胰島素注射器。移植時(shí)，吸取細(xì)胞懸液入注射器中，注射到心肌缺血及周邊區(qū)，所注射的細(xì)胞總數(shù)約為1X106個(gè)/只。4.檢測(cè)GFP標(biāo)記的干細(xì)胞存活情況。取70g GFP轉(zhuǎn)基因SD大鼠(江蘇省基因藥物技術(shù)中心提供)。提取表達(dá)GFP的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(見(jiàn)步驟I)，建立大鼠心肌缺血模型及移植干細(xì)胞(見(jiàn)步驟3)。干細(xì)胞移植后10天，處死大鼠，取心臟，中性甲醛液固定I天，依次用20%和30%的蔗糖溶液脫水各I天，冰凍切片，熒光顯微鏡觀察熒光干細(xì)胞。結(jié)果見(jiàn)圖1。5.免疫組化法檢測(cè)組織局部VEGF表達(dá)情況及微血管形成情況(以VDI因子表達(dá)情況為指示)。建立大鼠心肌缺血模型及移植干細(xì)胞(見(jiàn)步驟3)，21天后處死大鼠，取心臟，用10%中性甲醛固定，石蠟包埋用于常規(guī)及免疫組化檢測(cè)。采用快速免疫組化方法，即用型快速免疫組化MaxVisionTM試劑盒(福州邁新生物公司提供(KIT-5030))是根據(jù)多聚合酶技術(shù)把多分子量過(guò)氧化物酶與抗鼠或/和抗兔IgG分子結(jié)合在聚合物上形成多聚物分子。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中加空白對(duì)照(以PBS代替各種一抗)以監(jiān)測(cè)抗體特性。主要染色過(guò)程如下①.石蠟切片脫蠟水化，微波中檔抗原修復(fù)10分鐘。自然冷卻，用PBS液(O. 01mol/L PH7. 4)沖洗3次X2min。②正常山羊血清封閉，室溫孵育10分鐘。傾去血清，勿洗，滴加抗體，37°C孵育I小時(shí)。③PBS沖洗，2分鐘X 3次。④滴加即用型快速免疫組化MaxVisionTM 二抗，37°C或室溫孵育10 - 15分鐘。⑤PBS沖洗，2分鐘X 3次。⑥滴加新鮮配制的顯色劑(DAB)3 一 5分鐘，顯微鏡下觀察。⑦自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗返藍(lán)。⑧梯度酒精脫水、二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3。6. Masson染色檢測(cè)心肌纖維化程度。配制染色液①M(fèi)asson復(fù)合染色液酸性品紅I g，麗春紅2 g，橘黃G 2 g ,0. 25%醋酸300 ml。②甲苯胺藍(lán)染色液甲苯胺藍(lán)I g，0.2%醋酸100ml。染色步驟中性甲醛液固定組織，石蠟切片，常規(guī)脫蠟至水。Masson復(fù)合染色液5 min。O. 2%醋酸水溶液稍洗。5%磷鎢酸5 — IOmin。0. 2%醋酸水溶液浸洗2次。甲苯胺藍(lán)液5min，0.2%醋酸水洗2次。無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封固。結(jié)果膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維呈紅色，紅細(xì)胞呈橘紅色。見(jiàn)圖4。7. TTC檢測(cè)心肌梗死面積。樣本前處理大鼠用10%水合氯醛麻醉后，開(kāi)胸暴露心臟，并用組織沖洗液將心臟中的血液沖洗干凈。取下的心臟在冷生理鹽水中漂洗后，放A -20 0C冰箱中速凍20min左右。染色前從冰箱中取出心臟，快速用刀片每隔2mm切片備用。切片時(shí)放在有錫紙的冰袋上，避免組織粘于冰塊。染色步驟將新鮮組織切片置裝有TTC染液的12孔板中，37°C避光于水浴箱中孵育30min。移液器移除染過(guò)的TTC染液，然后吸取已配好的組織沖洗應(yīng)用液將表面多余的染色液沖洗掉，此時(shí)肉眼觀察，擺放整齊拍照。心臟切片中，非梗死區(qū)染為紅色，梗死區(qū)成灰白色，紅色與灰色區(qū)之間為缺血區(qū)。用Imagepro plus 6. 0軟件根據(jù)顏色分析心肌梗死面積。結(jié)果見(jiàn)圖5。8.超聲心動(dòng)圖檢測(cè)心功能。建立大鼠心肌缺血模型及移植干細(xì)胞(見(jiàn)步驟3)。手術(shù)2天后和21天后由不知情的技術(shù)人員做超聲心動(dòng)圖，檢測(cè)大鼠心臟射血分?jǐn)?shù)(EF)。所用儀器為 VisualSonics Vevo 2100 Imaging System。結(jié)果見(jiàn)圖 6。結(jié)論培養(yǎng)基中10%胎牛血清可以保持細(xì)胞的營(yíng)養(yǎng)，50 5000nmol/L的血管緊張素II有預(yù)刺激的作用。這種處理·能提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到缺血損傷心肌后的生存能力，分泌血管生長(zhǎng)因子、分化形成微小血管的能力；能使移植了該細(xì)胞的缺血損傷心肌組織纖維化程度降低，能使心肌梗死面積減少，心功能改善。
權(quán)利要求
1.血管緊張素II用于制備治療心肌缺血損傷疾病的藥物的用途。
2.血管緊張素II提高骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)心肌缺血損傷能力用途。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種血管緊張素Ⅱ用于制備治療心肌缺血損傷疾病的藥物的用途。是將常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)基中加入終濃度為50～5000nmol/L的血管緊張素Ⅱ及終濃度為10%的胎牛血清；將經(jīng)傳代培養(yǎng)穩(wěn)定的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞置于該細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)6～24小時(shí)后，獲得處理后的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植到大鼠缺血心肌組織。
文檔編號(hào)A61K38/08GK103055301SQ20121052757
公開(kāi)日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月10日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月10日
發(fā)明者李慶平, 劉超, 宋奕辰, 胡亮, 王露露, 肖容容 申請(qǐng)人:南京醫(yī)科大學(xué)