專利名稱：一種10-羥基喜樹堿納米微球及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物醫(yī)學(xué)材料領(lǐng)域，具體涉及一種10-羥基喜樹堿納米微球及其制備方法。
背景技術(shù)：
喜樹堿是從我國特有的珙桐科植物喜樹中提取得到的微量生物堿。10-羥基喜樹堿是喜樹堿分子的第10位碳原子的氫被羥基取代，因此可認為是喜樹堿的天然衍生物。10-羥基喜樹堿抗瘤譜廣，其抗癌作用與抗代謝藥及烷化劑不同。研究表明，10-羥基喜樹堿可選擇性的抑制拓撲異構(gòu)酶，因而干擾DNA的復(fù)制，造成不可逆的DNA鏈破壞，從而導(dǎo)致細胞死亡。此外，動物實驗證明，10-羥基喜樹堿作用于S期，為細胞周期特異性藥物。對S期的作用較Gl期和G2期明顯。對GO期細胞無作用。在較高濃度時對核分裂有抑制作用。阻止細胞進入分裂期。10-羥基喜樹堿與其它常用的抗癌藥無交叉耐藥，因此對耐藥腫瘤也有較好的治療作用。10-羥基喜樹堿易溶于二甲亞砜(DMS0)，微溶于甲醇、氯仿、吡啶等有機溶劑，不溶于水，其結(jié)構(gòu)E環(huán)上的α-羥基內(nèi)酯環(huán)是必需的活性基團，但該部位在堿性條件下會迅速開環(huán)，使得療效降低，而且毒性增強。而目前我國臨床上所使用的10-羥基喜樹堿的多為注射劑，將其與氫氧化鈉反應(yīng)成鹽使之溶解，其結(jié)構(gòu)中E環(huán)上的內(nèi)酯環(huán)被打開，使得臨床應(yīng)用面臨如下諸多問題(I)注射劑型為HCPT鈉鹽或開環(huán)形式，其代謝較快，半衰期短；(2)HCPT鈉鹽注射液不穩(wěn)定，當(dāng)pH大于7.4時易水解失活，見光也易分解；(3) 95%以上的10-羥基喜樹堿在體內(nèi)與血清蛋白結(jié)合失效，且結(jié)合后毒副作用更強。為了提高10-羥基喜樹堿的臨床療效，增強水溶性，增加生物利用度，目前對10-羥基喜樹堿的研究多集中在改變?nèi)軇w系，劑型以及載藥系統(tǒng)的改造等方面。其中，納米微球載藥系統(tǒng)充分顯示出其獨特的優(yōu)勢(I)可以增強藥效的同時減少不良反應(yīng)；(2)使藥物溶解度增加，粘附性提高，表面積增大，從而改善吸收，提高生物利用度；(3)可以將藥物被動靶向輸送到肝、脾、肺、骨髓、淋巴等部位，或經(jīng)修飾后達到主動靶向輸送的目的，從而改變藥物的體內(nèi)分布，提高靶部位的藥物濃度；(4)調(diào)節(jié)藥物的體內(nèi)循環(huán)時間和控制藥物分子的釋放速度，達到緩釋控釋效果，使藥物作用時間延長?，F(xiàn)有技術(shù)中，已經(jīng)有關(guān)于羥基喜樹堿納米微球的研究。如中國專利(CN1362060A)和(CN1363394A)分別公開了羥基喜樹堿葡聚糖納米粒和聚乳酸納米粒的制備方法，其中都是通過加堿調(diào)節(jié)水溶液PH值至7. 5-12，然后溶解羥基喜樹堿，再通過超聲波處理形成載藥納米粒。其為了使羥基喜樹堿能夠溶解于表面活性劑的水溶液中將PH調(diào)為堿性，使羥基喜樹堿E環(huán)的內(nèi)酯環(huán)水解成為羧酸鹽結(jié)構(gòu)，從而致使所包封的藥物失活，必然會降低其治療效果，且增加毒副作用。中國專利(CN101219144A)公開了一種羥基喜樹堿長循環(huán)納米粒的制備方法，其通過加入載體材料、表面活性劑和膜修飾材料，采用剪切的方式制備納米粒。由于羥基喜樹堿的溶解性極差，僅溶于個別有機溶劑，因此制備過程中必須使用大量單一類型的有機溶劑才能溶解少量羥基喜樹堿(如IOmg羥基喜樹堿溶于8(Tl00ml有機溶劑中)，因此增加了溶劑殘留的可能性且易造成污染和浪費。此外，剪切乳化的方式機械應(yīng)力作用過強，易破壞某些性質(zhì)不穩(wěn)定的藥物。微球的制備方法有很多，依據(jù)形成機理的不同可分為兩種，即聚合反應(yīng)法和聚合材料分散法。其中，聚合材料分散法又分為納米沉淀法、鹽析法、乳化-溶劑擴散法和溶劑揮發(fā)法等。前三種方法的有機相所用溶劑為與水完全互溶或部分互溶的有機溶劑(如丙酮、乙腈和乙醇等)；在制備過程中，有機相-水相界面發(fā)生劇烈的相變，有機溶劑以高于一定臨界值的速度迅速向水相擴散，并在界面形成局部湍流，載體材料則在界面因有機溶劑的脫除而迅速沉積成納米粒。這些方法所得微球的載藥量和包封率通常較低。溶劑揮發(fā)法指采用與水完全不混溶的有機溶劑(如二氯甲烷、氯仿等)，通過使用均質(zhì)或是超聲等機械分散力的方式制備納米級液體，然后揮發(fā)除去溶劑形成固體納米粒。溶劑揮發(fā)法制備納米粒需要大量的有機溶劑不利于環(huán)保，且粒徑分布較寬。并且，常規(guī)的溶劑揮發(fā)法的包封率僅在2(Γ40%或更低的水平，載藥量也較低，對給藥量造成限制。
因此，尋找一種更好的方法制備10-羥基喜樹堿納米微球具有實際意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法。該方法針對10-羥基喜樹堿脂難溶、水不溶、堿性易開環(huán)失活的缺陷，通過使用混合溶劑將10-羥基喜樹堿包裹于可降解聚合物(聚乳酸一羥基乙酸共聚物)制成微球，從而改善10-羥基喜樹堿的疏水性質(zhì)，避免開環(huán)，延長10-羥基喜樹堿在體內(nèi)的停留和作用時間，提高生物利用度，增強靶向作用，進而為10-羥基喜樹堿的各類研究和臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。該方法可以極大提高羥基喜樹堿和聚合物濃度的適用范圍，且僅使用少量有機溶齊 ，產(chǎn)率高，可實現(xiàn)自動化和規(guī)?；a(chǎn)。本發(fā)明的另一目的在于提供所述制備方法制得的10-羥基喜樹堿納米微球。本發(fā)明的上述目的通過如下技術(shù)方案予以實現(xiàn)
一種10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法，采用如下按重量份數(shù)計算的原料
10-羥基喜樹堿f 20份；
聚乙烯醇3 10份；
聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA 1(Γ100份；
具體包括如下步驟
(1)選取10-羥基喜樹堿和聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA，按每I毫克的10-羥基喜樹堿，添加O. 25^2暈升的有機溶液使其充分溶解；
所述有機溶劑為由乙醇或甲醇與二氯甲烷組成的二元溶劑；所述二元溶劑中，乙醇或甲醇與二氯甲烷的體積比為1:3飛；
(2)將步驟(I)所得有機混合液滴加至聚乙烯醇濃度為O.5飛質(zhì)量％的水溶液中，得到乳液；有機混合液與水溶液的體積比為1:2、；
(3)將步驟(2)所得乳液在超聲條件下進行乳化；
(4)將超聲乳化后的乳液分散至聚乙烯醇濃度為O.f O. 5質(zhì)量％的水溶液中，進行攪拌或減壓蒸餾，使有機溶劑揮發(fā)完全；(5)待有機溶劑揮發(fā)完全后，通過低溫離心收集PLGA載10-羥基喜樹堿納米微球；
(6)將步驟(5)收集的PLGA載10-羥基喜樹堿納米微球加入凍干保護劑，冷凍干燥，得到所述10-羥基喜樹堿納米微球。發(fā)明人經(jīng)過大量的實驗發(fā)現(xiàn)，要解決10-羥基喜樹堿納米微球制備工藝的問題，首先必須考慮其活性結(jié)構(gòu)的溶解性問題。因此發(fā)明人經(jīng)過各種單一溶劑的篩選以及多種溶劑的組合試驗比較，并通過渦旋、超聲分散等方式提高藥物溶解度，最終找出最佳組合與最佳比例的二元混合溶劑，通過結(jié)合乳化-溶劑擴散和溶劑揮發(fā)法將10-羥基喜樹堿包裹在可降解的生物材料中制成納米微球藥物緩釋體系，該混合溶劑能在提高藥物溶解度的同時很好的保證制得的納米粒各項指標參數(shù)滿足要求。作為一種更優(yōu)選方案，所述二元混合溶劑更優(yōu)選為甲醇與二氯甲烷體積比為1:4飛或乙醇與二氯甲烷體積比為1:3飛的混合溶劑。作為一種更優(yōu)選方案，步驟(I)中，所述有機溶劑更優(yōu)選為乙醇與二氯甲烷體積比為1:3飛的二元溶劑。經(jīng)過發(fā)明人的反復(fù)嘗試，發(fā)現(xiàn)乙醇混合的二元溶劑比以甲醇混合的二元溶劑在載藥量和包封率在同等條件下均好一些。作為一種最優(yōu)選方案，步驟(I)中，所述有機溶劑最優(yōu)選為乙醇與二氯甲烷體積比為1:4的二元溶劑。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在這實驗條件的范圍內(nèi)的這一比例下，所得到的納米微球的載藥量和包封率達到最高。作為一種優(yōu)選方案，步驟(3)中，所述超聲的條件為振幅為2(Γ80%，時間2(T90s。作為一種優(yōu)選方案，步驟(4)中，所述攪拌為在室溫下攪拌時間為61小時。作為一種優(yōu)選方案，步驟(4)中，所述減壓蒸餾為在10 200 mbar，3(T35°C。作為一種優(yōu)選方案，步驟(5)中，所述低溫離心的條件優(yōu)選為在4 °C，為800(Tl3000r/min，離心時間為10分鐘。凍干保護劑可以根據(jù)本領(lǐng)域常用的凍干保護劑作選擇。作為一種優(yōu)選方案，步驟(7 )中，所述凍干保護劑優(yōu)選為海藻糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇。由所述制備方法制得的10-羥基喜樹堿納米微球。該納米微球的外觀是規(guī)整的球形，在乳液中分散良好，粒徑在10(T500nm，分散性較好，多分散系數(shù)可達O. 047，載藥量高達16%，，包封率高達96. 4%。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果
(1)采用本發(fā)明的可降解聚合物載10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法，可以提高在同等有機溶劑用量條件下的10-羥基喜樹堿的溶解度，相應(yīng)的提高了藥物和聚合物的溶液濃度，因此提高微球的載藥量和包封率，且可實現(xiàn)自動化和規(guī)?；a(chǎn)；
(2)本發(fā)明制備得到的10-羥基喜樹堿納米微球，肉眼觀察可發(fā)現(xiàn)其能較好地分散于水中，形成顏色均勻穩(wěn)定的懸乳液，大大改善了藥物不溶于水的性質(zhì)；
(3)體外釋放實驗表明，本發(fā)明所制備的10-羥基喜樹堿納米微球可在pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液中持續(xù)釋放10天以上，大大延長了 10-羥基喜樹堿在體內(nèi)的作用時間，并且活性的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)得到較好的保護，幾乎100%都保持內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)。


圖I為實施例6制備的PLGA載10-羥基喜樹堿微球的掃描電鏡照片；圖2為實施例7制備的PLGA載10-羥基喜樹堿微球的透射電鏡照片；
圖3為實施例7制備的PLGA載10-羥基喜樹堿微球體外緩沖液中的藥物釋放曲線； 圖4為不同形式的10-羥基喜樹堿在不同模擬緩沖液中的內(nèi)酯活性成分比例研究。
具體實施例方式下面結(jié)合具體實施例進一步詳細說明本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明實施例述及的試劑均為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)使用的試劑。實施例I
精密稱量IOmglO-羥基喜樹堿原料藥和lOOmgPLGA。將10-羥基喜樹堿和PLGA溶于5ml甲醇二氯甲烷(v/v=l: 3)的二元溶劑中。充分溶解后將上述有機溶液滴加至IOml質(zhì)量濃度為2%聚乙烯醇水溶液中，并在振幅為38%的條件下超聲乳化30s。隨后將乳化得到的乳液加至85ml質(zhì)量濃度為O. 2%的聚乙烯醇水溶液中分散固化。室溫攪拌6h，使有機溶劑揮發(fā)完全。固化后的微球在4°C，離心轉(zhuǎn)速IOOOOr/min下離心10分鐘后收集，加入凍干保護劑冷凍干燥，即得10-羥基喜樹堿微球粉末。激光粒度分析表明，所得微球以304. 3nm為有效直徑呈正態(tài)分布，多分散性系數(shù)為O. 152。透射電鏡下觀察該納米微粒具有規(guī)整的球形外觀，在乳液中分散良好。載藥量與包封率測量結(jié)果分別為7. I %和78. 6%。實施例2
精密稱量IOmglO-羥基喜樹堿原料藥和lOOmgPLGA。將10-輕基喜樹堿和PLGA溶于5ml甲醇二氯甲燒(v/v=l: 4)的二元溶劑中。充分溶解后將上述有機溶液滴加至IOml質(zhì)量濃度為3%聚乙烯醇水溶液中，并在振幅為60%的條件下超聲乳化30s。將乳化后的乳液加至85ml質(zhì)量濃度為O. 3%的聚乙烯醇水溶液中分散固化。室溫攪拌8h，使有機溶劑揮發(fā)完全。固化后的微球在4°C，離心轉(zhuǎn)速lOOOOr/min下離心10分鐘后收集，加入凍干保護劑冷凍干燥，即得10-羥基喜樹堿微球粉末。激光粒度分析表明，所得微球以353. Ixm為有效直徑呈正態(tài)分布，多分散性系數(shù)為0. 241,zeta電位為-28. 7mV。透射電鏡下觀察該納米微粒具有規(guī)整的球形外觀，在乳液中分散良好。載藥量與包封率測量結(jié)果分別為8. 2%和88. 3%。實施例3
精密稱量20mgl0-羥基喜樹堿原料藥和lOOmgPLGA。將10-輕基喜樹堿和PLGA溶于5ml甲醇二氯甲燒(v/v=l: 4)的二元溶劑中。充分溶解后將上述有機溶液滴加至IOml質(zhì)量濃度為3%聚乙烯醇水溶液中，并進行并在振幅為38%的條件下超聲乳化30s。將乳化后的乳液加至55ml質(zhì)量濃度為0. 3%的聚乙烯醇水溶液中分散固化。減壓蒸餾為在1(T200 mbar, 30^35°C，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)2h，使有機溶劑揮發(fā)完全。固化后的微球在4°C，離心轉(zhuǎn)速10000r/min下離心10分鐘后收集，加入凍干保護劑冷凍干燥，即得10-羥基喜樹堿微球粉末。激光粒度分析表明，所得微球以357. 5nm為有效直徑呈正態(tài)分布，多分散性系數(shù)為0. 198,zeta電位為-15. 4mV。透射電鏡下觀察該納米微粒具有規(guī)整的球形外觀，在乳液中分散良好。載藥量與包封率測量結(jié)果分別為15. 4%和92.0%。實施例4精密稱量IOmglO-羥基喜樹堿原料藥和lOOmgPLGA。將10-羥基喜樹堿和PLGA溶于5ml乙醇二氯甲烷(v/v=l: 3)的二元溶劑中。充分溶解后將上述有機溶液滴加至IOml質(zhì)量濃度為3%聚乙烯醇水溶液中，并進行并在振幅為60%的條件下超聲乳化30s。將乳化后的乳液加至85ml質(zhì)量濃度為O. 3%的聚乙烯醇水溶液中分散固化。 室溫攪拌8h，使有機溶劑揮發(fā)完全。固化后的微球在4°C，離心轉(zhuǎn)速10000r/min下離心10分鐘后收集，加入凍干保護劑冷凍干燥，即得10-羥基喜樹堿微球粉末。激光粒度分析表明，所得微球以288. 6nm為有效直徑呈正態(tài)分布，多分散性系數(shù)為0. 047,zeta電位為-14. 6mV。透射電鏡下觀察該納米微粒具有規(guī)整的球形外觀，在乳液中分散良好。載藥量與包封率測量結(jié)果分別為7. 8%和86. 6%。實施例5
精密稱量IOmglO-羥基喜樹堿原料藥和lOOmgPLGA。將10-輕基喜樹堿和PLGA溶于5ml乙醇二氯甲燒(v/v=l :4)的二元溶劑中。充分溶解后將上述有機溶液滴加至IOml質(zhì)量濃度為3%聚乙烯醇水溶液中，并進行并在振幅為38%的條件下超聲乳化30s。將乳化后的乳液加至85ml質(zhì)量濃度為0. 3%的聚乙烯醇水溶液中分散固化。室溫攪拌8h，使有機溶劑揮發(fā)完全。固化后的微球在4°C，離心轉(zhuǎn)速10000r/min下離心10分鐘后收集，加入凍干保護劑冷凍干燥，即得10-羥基喜樹堿微球粉末。激光粒度分析表明，所得微球以232. 6nm為有效直徑呈正態(tài)分布，多分散性系數(shù)為0. 083,zeta電位為-27. 9mV。透射電鏡下觀察該納米微粒具有規(guī)整的球形外觀，在乳液中分散良好。載藥量與包封率測量結(jié)果分別為8. 6%和95. 6%。實施例6
精密稱量IOmglO-羥基喜樹堿原料藥和lOOmgPLGA。將10-輕基喜樹堿和PLGA溶于5ml乙醇二氯甲燒(v/v=l:5)的二元溶劑中。充分溶解后將上述有機溶液滴加至IOml質(zhì)量濃度為3%聚乙烯醇水溶液中，并進行并在振幅為60%的條件下超聲乳化30s。將乳化后的乳液加至85ml質(zhì)量濃度為0. 3%的聚乙烯醇水溶液中分散固化。室溫攪拌8h，使有機溶劑揮發(fā)完全。固化后的微球在4°C，離心轉(zhuǎn)速10000r/min下離心10分鐘后收集，加入凍干保護劑冷凍干燥，即得10-羥基喜樹堿微球粉末。激光粒度分析表明，所得微球以294. 6nm為有效直徑呈正態(tài)分布，多分散性系數(shù)為0. 175,zeta電位為-17. 3mV。透射電鏡下觀察該納米微粒具有規(guī)整的球形外觀，在乳液中分散良好。載藥量與包封率測量結(jié)果分別為7. 5%和82.4%。本實施例制備得到的微球的掃描電鏡見圖I。實施例7
精密稱量20mgl0-羥基喜樹堿原料藥和lOOmgPLGA。將10-羥基喜樹堿和PLGA溶于5ml乙醇二氯甲烷(v/v=l:4)的二元溶劑中。充分溶解后將上述有機溶液滴加至IOml質(zhì)量濃度為3%聚乙烯醇水溶液中，并進行并在振幅為60%的條件下超聲乳化30s。將乳化后的乳液加至85ml質(zhì)量濃度為0. 3%的聚乙烯醇水溶液中分散固化。室溫攪拌8h，使有機溶劑揮發(fā)完全。固化后的微球在4°C，離心轉(zhuǎn)速lOOOOr/min下離心10分鐘后收集，加入凍干保護劑冷凍干燥，即得10-羥基喜樹堿微球粉末。激光粒度分析表明，所得微球以277. 3nm為有效直徑呈正態(tài)分布，多分散性系數(shù)為O. 138,zeta電位為-15. 3mV。透射電鏡下觀察該納米微粒具有規(guī)整的球形外觀，在乳液中分散良好。載藥量與包封率測量結(jié)果分別為16%和96.4%。本實施例制備得到的微球的透射電鏡見圖2。對比例I
精密稱量IOmglO-羥基喜樹堿原料藥和lOOmgPLGA。將10-羥基喜樹堿和PLGA溶于5ml 二氯甲烷中。充分溶解后將上述有機溶液滴加至IOml質(zhì)量濃度為3%聚乙烯醇水溶液中，并進行超聲乳化。將乳化后的乳液加至85ml質(zhì)量濃度為O. 3%的聚乙烯醇水溶液中分散固化。減壓蒸餾為在10 200 mbar，3(T35°C，旋 轉(zhuǎn)蒸發(fā)lh，使有機溶劑揮發(fā)完全。固化后的微球在4°C，離心轉(zhuǎn)速10000r/min下離心10分鐘后收集，加入凍干保護劑冷凍干燥，即得10-羥基喜樹堿微球粉末。激光粒度分析表明，所得微球以297. 9nm為有效直徑呈正態(tài)分布，多分散性系數(shù)為O. 365,zeta電位為-19. 4mV。透射電鏡下觀察該納米微粒具有規(guī)整的球形外觀，在乳液中分散良好。載藥量與包封率測量結(jié)果分別為6. 9%和76. 3%。實施例8體外釋放實驗
實施例7所制備的10-羥基喜樹堿納米微球的藥物釋放曲線如圖3。秤取2mgl0-羥基喜樹堿納米微球3份，分散于20ml pH7. 4的PBS緩沖溶液中，置于37°C的搖床中孵育，在設(shè)定時間點取樣，然后在10000r/min下離心5min,取O. 5ml上清液,檢測其中10-輕基喜樹堿的含量。從圖3可以看出，本發(fā)明所制備的10-羥基喜樹堿納米微球可在中性磷酸鹽緩沖溶液持續(xù)釋放10天以上，大大延長了 10-羥基喜樹堿在體內(nèi)的作用時間。實施例9內(nèi)酯結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性試驗
實施例7所制備的10-羥基喜樹堿納米微球的穩(wěn)定性曲線如圖4。秤取2mgl0-羥基喜樹堿納米微球6份，分別分散3份于pH7. 4的PBS和含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中；另外秤取ImglO-羥基喜樹堿原料藥，將原料藥溶解于Iml DMSO中，然后以相同藥物濃度稀釋三份于ρΗ7· 4的PBS和含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，分別于0、0. 5、2、4、6、12和24小時定時取樣lml，HPLC檢測10-羥基喜樹堿的兩種構(gòu)型的含量并計算比例，即得內(nèi)酯構(gòu)型和羧酸構(gòu)型的轉(zhuǎn)換情況。從圖4中可以看出，本發(fā)明所制備的10-羥基喜樹堿納米微球可在PBS和含血清的DMEM培養(yǎng)基中對活性的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)形成較好的保護，24小時后幾乎100%還都保持內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)。而相比之下，原料藥在O. 5h之內(nèi)就有超過80%的構(gòu)型為無效的羧酸構(gòu)型。實施例10
對以上實施例7制備的微球與市售10-羥基喜樹堿注射液和原料藥進行細胞試驗，得出3種10-羥基喜樹堿制劑的ICki (IC5ci是指細胞生長被抑制一半時所使用藥物的對應(yīng)濃度)。其中所選用的市售10-羥基喜樹堿注射液為黃石飛云生產(chǎn)，規(guī)格為2ml :5mg。具體步驟為首先用含10%胎牛血清的培養(yǎng)液將細胞配成單個細胞懸液，以每孔2000個細胞接種到96孔板，每孔體積200 μ I。過夜培養(yǎng)后，將上述各組分的樣品配制出6個濃度梯度的藥物，與培養(yǎng)基混合均勻后加入96孔板中，對照組更換含等體積溶劑的培養(yǎng)基即可，每孔200 μ 1，每組設(shè)5個平行孔，于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)48h。而后棄去上清液，PBS緩沖液清洗3次，然后每孔加入200 μ I新鮮配制的含O. 5mg/ml的MTT的培養(yǎng)基，37°C ,5% CO2下繼續(xù)培養(yǎng)，4 h后小心棄上清，并加入150 μ I DMS0，在酶標儀上選用570 nm波長測吸光值。以同一樣品的不同濃度對腫瘤細胞生長抑制率作圖可得到劑量-存活率曲線，從中求出樣品的IC5(I。其結(jié)果如表I所示
表I不同形式的10-羥基喜樹堿作用于不同腫瘤系的IC5tl值
權(quán)利要求
1.一種10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法，其特征在于，采用如下按重量份數(shù)計算的原料 10-羥基喜樹堿f 20份； 聚乙烯醇3 10份； 聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA 1(Γ100份； 具體包括如下步驟 (1)選取10-羥基喜樹堿和聚乳酸-羥基乙酸共聚物PLGA，按每I毫克的10-羥基喜樹堿，添加O. 25^2暈升的有機溶液使其充分溶解； 所述有機溶劑為由乙醇或甲醇與二氯甲烷組成的二元溶劑；所述二元溶劑中，乙醇或甲醇與二氯甲烷的體積比為1:3 5 ； (2)將步驟(I)所得有機混合液滴加至聚乙烯醇濃度為O.5飛質(zhì)量％的水溶液中，得到乳液；有機混合液與水溶液的體積比為1:2、； (3)將步驟(2)所得乳液在超聲條件下進行乳化； (4)將超聲乳化后的乳液分散至聚乙烯醇濃度為O.f O. 5質(zhì)量％的水溶液中，進行攪拌或減壓蒸餾，使有機溶劑揮發(fā)完全； (5)待有機溶劑揮發(fā)完全后，通過低溫離心收集PLGA載10-羥基喜樹堿納米微球； (6)將步驟(5)收集的PLGA載10-羥基喜樹堿納米微球加入凍干保護劑，冷凍干燥，得到所述10-羥基喜樹堿納米微球。
2.如權(quán)利要求I所述10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述有機溶劑為乙醇與二氯甲烷體積比1:3飛的二元溶劑。
3.如權(quán)利要求I所述10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法，其特征在于，步驟(I)中，所述有機溶劑為乙醇與二氯甲烷體積比1:4的二元溶劑。
4.如權(quán)利要求I所述10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法，其特征在于，步驟(3)中，所述超聲的條件為振幅為20 80%，時間2(T90s。
5.如權(quán)利要求I所述10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述攪拌為在室溫下攪拌時間為61小時。
6.如權(quán)利要求I所述10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法，其特征在于，步驟(4)中，所述減壓蒸餾的條件為10 200毫巴，3(T35°C。
7.如權(quán)利要求I所述10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法，其特征在于，步驟(5)中，所述低溫離心的條件為在4°C，離心轉(zhuǎn)速為800(Tl3000r/min，離心時間為10分鐘。
8.如權(quán)利要求I所述10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法，其特征在于，步驟(6)中，所述凍干保護劑為海藻糖、葡萄糖、蔗糖或甘露醇。
9.由權(quán)利要求Γ8任意一項權(quán)利要求所述制備方法制備得到的10-羥基喜樹堿納米微球。
全文摘要
本發(fā)明公開一種10-羥基喜樹堿納米微球及其制備方法。所述10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法為采用由乙醇或甲醇與二氯甲烷組成的二元溶劑將10-羥基喜樹堿納米微球及PLGA溶解，然后與聚乙烯醇溶液混合，乳化，分散，離心，冷凍干燥得到。采用本發(fā)明的可降解聚合物載10-羥基喜樹堿納米微球的制備方法，可以極大提高羥基喜樹堿和聚合物濃度的適用范圍，使用有機溶劑量少，微球的載藥率和包封率高，可實現(xiàn)自動化和規(guī)模化生產(chǎn)；所述制備的10-羥基喜樹堿納米微球，在模擬磷酸鹽緩沖溶液條件下可持續(xù)釋放10天以上，大大延長了10-羥基喜樹堿在體內(nèi)的作用時間，并且活性的內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)得到較好的保護，幾乎100%都保持內(nèi)酯環(huán)結(jié)構(gòu)。
文檔編號A61K47/34GK102908318SQ201210424260
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月31日
發(fā)明者劉杰, 蔣慶 申請人:中山大學(xué)