專利名稱：一種治療性疫苗佐劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種治療性疫苗佐劑，更具體的說，涉及一種治療性疫苗佐劑的組合物，其包含的抗白細胞介素10受體通過靜電作用或π-π堆垛等物理作用吸附在氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)上。
背景技術(shù)：
慢性感染某些病毒可以引起癌癥。感染人乳頭瘤病毒可以引起宮頸癌，而乙型肝炎病毒感染與肝癌的發(fā)生有關(guān)。目前此類疾病尚無特效治療藥物。雖然預(yù)防慢性病毒感染的疫苗，如乙型肝炎病毒(HBV)疫苗、人乳頭瘤病毒疫苗(HPV)已經(jīng)在臨床應(yīng)用，但是針對已經(jīng)感染慢性病毒病人的治療性疫苗的研究，仍然處于起步階段。治療性疫苗是有效治療慢性病毒感染所致癌癥的研發(fā)熱點和難點。治療性疫苗至少由2種成分構(gòu)成，其一是特異性抗原，其二是免疫佐劑，兩種成分都會影響治療性疫苗的治療效果，因此，佐劑的研發(fā)在治療性疫苗的發(fā)展中起至關(guān)重要的作用?！ぢ圆《靖腥竞湍[瘤的發(fā)生、發(fā)展是其與機體免疫系統(tǒng)長期對抗的結(jié)果。為避免被機體免疫系統(tǒng)清除，病毒感染和腫瘤微環(huán)境逐漸發(fā)展成不利于免疫細胞功能的免疫抑制區(qū)。這一環(huán)境包括抑制細胞如調(diào)節(jié)T細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞、抑制性樹突細胞；免疫抑制因子如IL10、TGFii等；腫瘤細胞膜上抑制分子如ro-i在腫瘤細胞的表達。機體產(chǎn)生的這些對病毒或腫瘤抗原的無效的體液和細胞免疫反應(yīng)，往往可抑制固有和特異性免疫反應(yīng)，影響治療性疫苗的效率。研究發(fā)現(xiàn)乳頭瘤病毒抗原暴露的小鼠可抑制治療性疫苗細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應(yīng)。PV LI核殼蛋白(LlVLPs)致敏(prime)的小鼠，在接種攜帶HPV16E7CTL，HIV CTL決定簇的PV嵌和型LI的蛋白(L1E7，L1P18)治療性疫苗后，與未致敏小鼠相比，其E7、HIV P18特異性的CTL細胞分泌IFN Y受到抑制。不同研究小組也觀察到同樣的現(xiàn)象。如果PV LI蛋白致敏(primed)的小鼠是ILlO缺陷鼠，在接種攜帶HPV16E7CTL決定簇的PV嵌和型LI的蛋白治療性疫苗后，與未致敏小鼠相比，其E7特異性的CTL細胞產(chǎn)生IFN Y則不受到抑制。如果在免疫致敏小鼠時同時阻斷IL10，E7特異性CTL也不受到抑制。DNA疫苗免疫時阻斷IL10，可以提高疫苗誘導(dǎo)的T細胞反應(yīng)，清除小鼠LCMV病毒感染。綜上所述，ILlO與慢性病毒感染密切相關(guān)，治療性疫苗如果在免疫時阻斷IL10，可以提高疫苗誘導(dǎo)的T細胞反應(yīng)，提高慢性人乳頭瘤病毒感染治療性疫苗的效率，清除慢性病毒感染，阻斷宮頸癌的發(fā)生。類似的研究發(fā)現(xiàn)阻斷IL10、腫瘤局部注射Toll樣受體配體CpG可以抑制小鼠腸癌細胞、黑色素瘤細胞的生長。氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)是一種碳納米材料，由石墨經(jīng)化學(xué)氧化形成。GO由單層碳原子組成，邊緣含有大量的羰基、羧基等含氧活性基團，可提供了一個PH依賴的陰性電荷表面和膠體穩(wěn)定性，因此具有良好的生物相容性和水溶液穩(wěn)定性，同時有利于化學(xué)功能化修飾，以達到在不同領(lǐng)域應(yīng)用的目的。由于單原子層兩個基面都可以吸附，具有其他納米材料無法比擬的超高載藥率，因此，微量GO可以吸附更多的藥物、抗原或免疫刺激因子。有報道GO被用于承載化療藥物5-FU和阿霉素，可使藥物緩慢釋放，且發(fā)現(xiàn)荷瘤小鼠靜脈注射GO，GO能蓄積在腫瘤部位，表明局部給予GO和化療藥物，比單獨給予化療藥物，可以更長時間的維持免疫刺激強度和抗腫瘤藥物濃度。GO對機體是安全的，小鼠靜脈注射250 yg G0，也沒有觀察到明顯副作用，具有良好的生物安全性。研究表明GO也可以有效地吸附單鏈DNA(ssDNA)，保護ssDNA免受酶的降解，這一特性提示GO可連接CpG，CpG是Toll樣受體9的配體，常常作為佐劑和用來打破免疫抑制的環(huán)境。GO可以吸附化療藥、ssDNA、CpG等，使得GO可以成為一個可以打破免疫抑制環(huán)境的很好的候選載體。本發(fā)明采用GO吸附抗白細胞介素10受體抗體的治療性疫苗佐劑，尚未見文獻報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是采用GO吸附抗白細胞介素10受體抗體的治療性疫苗佐劑，以作為慢性病毒感染性疾病及腫瘤等的治療性疫苗的佐劑，例如人乳頭瘤病毒、乙型或丙型肝炎病毒等慢性病毒性感染疾病和癌癥等，這些疾病的治療需要特異性細胞免疫應(yīng)答以清除受感染的細胞或腫瘤細胞。本發(fā)明的技術(shù)方案是一種治療性疫苗佐劑，其特征在于所述佐劑由氧化石墨烯·(GO)通過靜電或-Ji堆垛等物理作用吸附抗白細胞介素10受體(anti-IL10R)抗體組成，其中GO和anti-IL10R的重量比為2 3。所述治療性疫苗佐劑的疫苗類型包括T細胞疫苗、樹突狀細胞疫苗、多肽疫苗及核酸疫苗等，基于或主要基于細胞毒性T細胞(CTL)表位的疫苗。所述治療性疫苗佐劑可應(yīng)用于動物，也可應(yīng)用于人體，特別適用于人乳頭瘤病毒、乙型或丙型肝炎病毒等慢性病毒性感染疾病和癌癥等治療性疫苗中，可作為艾滋病、流感、結(jié)核、瘧疾等其他需要細胞免疫應(yīng)答的疾病的治療性疫苗的佐劑。由于慢性病毒感染或腫瘤患者往往存在不同程度的免疫缺陷或免疫耐受，治療性疫苗的目的是打破免疫耐受微環(huán)境，重建免疫應(yīng)答，以清除受病毒感染的細胞或腫瘤細胞。治療性疫苗普遍存在免疫原性弱等缺點，因此選擇能增強機體免疫應(yīng)答的佐劑顯得就尤為重要。本發(fā)明研究證實，在慢性人乳頭瘤病毒治療性疫苗免疫時阻斷IL10，可以提高疫苗誘導(dǎo)的T細胞反應(yīng)，打破免疫耐受，而碳納米材料GO強大的吸附能力可以吸附抗ILlO受體，不改變吸附抗體或刺激因子活性，并使承載的抗體和細胞因子長時間停留在免疫抑制微環(huán)境中，維持免疫刺激強度。在此系列研究基礎(chǔ)上，本發(fā)明研制出一種可增強治療性疫苗免疫應(yīng)答的佐劑。即將碳納米材料GO和抗白細胞介素10受體抗體按一定比例混合，使抗白細胞介素10受體抗體吸附在碳納米GO材料上。研究結(jié)果表明，GO可以吸附抗IL-10受體抗體。吸附在GO上的抗IL-10受體抗體以PH依賴的方式緩慢釋放，吸附的抗IL-10受體抗體在體內(nèi)和體外均有生物活性。GO吸附抗IL-10受體抗體可以作為治療性疫苗的佐劑，并運載到病毒感染細胞或腫瘤部位打破機體的免疫抑制環(huán)境。


圖1，GO可以吸附Anti-ILlOR抗體。圖2，吸附在GO上的Anti-ILlOR抗體體外可控釋放。圖3，G0/Anti-IL10R抗體體外可以提高LPS刺激的小鼠脾細胞產(chǎn)生IL_12p40水平。
圖4，G0/Anti-IL10R抗體在體內(nèi)有生物活性。
具體實施例方式實施例IGO可以吸附抗小鼠IL-10受體抗體。為了研究GO是否可以吸附IL-10受體(anti-IL10R)抗體，在200μ I G0(3mg/ml)中加入150μ I抗小鼠anti-IL10R抗體(6mg/ml)，渦漩混勻，然后4°C吸附過夜。PBS洗3次去除未吸附的抗體，IOOOOrpm離心5min后用200 μ I PBS重懸微粒。顯微鏡下觀察GO/anti-IL10R顆粒變得更大和聚集，見圖1A，PBS重懸后上清中可檢測到蛋白，見圖1B，提示anti-IL10R抗體可被吸附在GO上。采用直接ELISA法測定GO吸附的抗體。即每孔分別加入含有10 μ I GO、GO/anti-IL10R 和不同濃度 anti-ILlOR 抗體的 ELISA 包被液(ebioscience,美國)100 μ 1， 包被 ELISA 板(Nunc，丹麥)，4°C 過夜。0. I % PBST 洗滌 5 次后加 ELISA assay dilutebuffer (ebioscience,美國)室溫下阻斷Ih,再用0. 1% PBST洗漆5次后每孔加入100 μ II 1000稀釋的羊抗鼠IgG-HRP (Sigma，美國)，室溫下孵育lh。每孔加入100 μ I IXTMB底物(ebioscience,美國)，避光顯色后用stop buffer (ebioscience,美國)終止反應(yīng)。在450nm波長處用酶標儀(Spectramax,美國)測量各孔的吸光度。包被G0/anti-IL10R抗體的孔可以檢測到抗大鼠抗體，而包被GO的孔檢測不到抗大鼠抗體，證實GO可以吸附抗小鼠anti-IL10R 抗體，見圖 1A。進一步米用Western Blot測定抗大鼠抗體抗體和Y干擾素IFN Y。即取10 μ IG0/anti-IL10R、IFN Y及相應(yīng)對照品，加入SDS-PAGE上樣緩沖液后上樣，12% SDS-PAGE凝膠電泳(Bio-Rad公司，美國)后轉(zhuǎn)移到PVDF膜(Bio-Rad公司，美國)，再用I : 1000稀釋的HRP標記的羊抗鼠抗體來結(jié)合抗小鼠anti-IL10R抗體或I : 250稀釋的大鼠抗小鼠IFNy抗體來結(jié)合小鼠IFNy，結(jié)合了小鼠IFNy的一抗再用I : 1000稀釋的HRP標記的羊抗鼠抗體(二抗)(Sigma公司，美國)孵育PVDF膜來結(jié)合,最后發(fā)光鑒定(Amersham,Arlington Heights,以色列)。在G0/Anti-IL10抗體中可以檢測到anti-IL10R抗體,而G0/IFN Y不能檢測到，進一步證實GO可以吸附anti-IL10R抗體，見圖1B。根據(jù)本研究的實驗資料，3mg GO可以吸附I I. 5mg anti-ILlOR抗體，同樣的,通過ELISA和Western Blot檢測證實GO可以吸附IFN Y，I μ g GO可以吸附60pg IFN Y，見圖1C。實施例2吸附在GO上的Anti-ILlOR抗體以PH依賴的方式緩慢可控釋放。G0/anti-IL10R抗體被加入不同PH的PBS和DMEM培養(yǎng)基中，保持在37°C，緩慢旋轉(zhuǎn)。在不同時間點收集上清，采用總蛋白測定方法來檢測被釋放到PBS中的anti-IL10R抗體。結(jié)果不同時間點收集的上清中均沒有檢測到蛋白，考慮到釋放的量太少，超過了總蛋白測定方法的檢測極限，見圖2A。采用檢測靈敏度更高的Western blot對上清進行檢測，結(jié)果上清可以檢測anti-IL10R抗體，在PH 6時信號最強，結(jié)果表明吸附在GO上的anti-IL10R抗體以PH依賴的方式緩慢釋放，見圖2B。腫瘤的微環(huán)境往往低PH，而Anti-ILlOR抗體的釋放的量在低PH比pH7. 4更大，提示在腫瘤部位應(yīng)用GO吸附Anti-ILlOR抗體可有更好治療效果。實施例3GO/anti-ILIOR抗體體外可以提高LPS刺激的小鼠脾細胞產(chǎn)生IL_12p40和IFN-Y水平，GO吸附anti-ILlOR和IFNy在激發(fā)免疫應(yīng)答方面有協(xié)同作用。C57BL/6小鼠腹腔用IOOng LPS刺激，取I X IO6脾細胞，分別用I μ I GO, GO/對照抗體，60/&11衍-11^101 (60&)，60/正^^ (GOb)和 G0/anti IL10R/IFNy (GOc)刺激處理，用ELISA法測定刺激后小鼠脾細胞體外產(chǎn)生IL12p40和IFN- Y的水平。GO不能刺激小鼠脾細胞產(chǎn)生IL12，LPS可刺激脾細胞產(chǎn)生IL12p40，中和ILlO可以提高IL12p40的產(chǎn)生。GO/Anti-ILlOR抗體能夠提高脾細胞產(chǎn)生IL12p40和IFN-Y的水平，表明吸附的anti-IL10R抗體在體外有生物活性，見圖SA15Anti-ILlOR抗體和IFNy被同時吸附在GO上，吸附在GO/anti-IL10R 上的 anti-IL10R 抗體濃度與 G0/Anti-IL10R/IFN Y 中的 anti-IL10R 抗體濃度均是相同的，為1.5mg/ml。G0/Anti-IL10R和G0/IFN Y均能提高LPS刺激小鼠脾細胞產(chǎn)生IL12p40的水平，而當GO同時吸附anti-IL10R和IFN Y，脾細胞可產(chǎn)生更多的IL12p40，采用流式檢測⑶llc+MHC 11+樹突狀細胞⑶86的表達(MFI)較單獨G0/Anti_IL10R、GO/·IFNy要高，見圖3B。GO吸附anti-IL10R和IFN Y在激發(fā)免疫應(yīng)答方面有協(xié)同作用，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生更強的免疫應(yīng)答強度。實施例4G0/Anti-IL10R抗體在體內(nèi)有生物活性，且GO吸附的Anti-ILlOR抗體比未吸附的Anti-ILlOR抗體更能提高疫苗的T細胞免疫反應(yīng)。C57BL/6 (H_2b)雌性小鼠，6_8周，購自中山大學(xué)實驗動物中心。每組小鼠5只，皮下采用50 μ g OVA+15 μ gLPS致敏，7天后進行激發(fā)免疫，分別皮下注射 50 μ g0VA+15μ gLPS+10μ 1G0,50 μ g0VA+15μ gLPS+10μ lG0/anti-IL10R,50 μ gOVA+15 μ gLPS+10 μ Ianti-ILlOR, 50 μ g0VA+15 μ gLPS+NRS (正常大鼠血清)。6 天后取小鼠脾細胞，采用ELISP0T方法檢測特異性CD8+T細胞應(yīng)答。即單個脾臟細胞或淋巴結(jié)懸液加入預(yù)先包被了抗IFN- Y抗體(BD Harlingen公司，美國)膜上96孔板(Millipore公司，美國)，然后加入不同濃度的多肽，多肽與細胞在37°C作用18小時后，加入生物素化的抗IFN- Y抗體(BD Harlingen公司，美國)，親和素-辣根過氧化物酶(Sigma-Aldrich公司，美國)和DAB (Sigma-Aldrich公司，美國)來檢測抗原特異性分泌IFN- Y的細胞，結(jié)果通過 ELISP0T 計數(shù)儀 ELR02 (AIDAutoimmun Diagnosticka GMbH 公司，德國)來計數(shù)。結(jié)果表明小鼠采用G0/anti-IL10R較單獨anti-ILlOR抗體，激發(fā)更多OVA特異性的⑶8+T細胞應(yīng)答，表明吸附在GO上的G0/anti-IL10R抗體在體內(nèi)具有生物活性。見圖4。
權(quán)利要求
1.一種治療性疫苗佐劑，其特征在于所述佐劑由氧化石墨烯(GO)通過靜電或π-π堆垛等物理作用吸附抗白細胞介素10受體(anti-IL10R)抗體組成，其中GO和anti_IL10R的重量比為2:3。
2.根據(jù)權(quán)利要求I的治療性疫苗佐劑，所述疫苗類型包括T細胞疫苗、樹突狀細胞疫苗、多肽疫苗及核酸疫苗等，基于或主要基于細胞毒性T細胞(CTL)表位的疫苗。
3.根據(jù)權(quán)利要求I的治療性疫苗佐劑，所述佐劑可應(yīng)用于動物，也可應(yīng)用于人體，特別適用于人乳頭瘤病毒、乙型或丙型肝炎病毒等慢性病毒性感染疾病和癌癥等治療性疫苗中，可作為艾滋病、流感、結(jié)核、瘧疾等其他需要細胞免疫應(yīng)答的疾病的治療性疫苗的佐劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種治療性疫苗佐劑。所述佐劑由碳納米材料氧化石墨烯(Graphene oxide，GO)吸附抗白細胞介素10受體抗體組成。氧化石墨烯GO吸附的抗白細胞介素10受體可以打破免疫抑制環(huán)境，提高治療性疫苗誘導(dǎo)的特異性T細胞應(yīng)答。碳納米材料GO吸附的抗白細胞介素10受體緩慢釋放，維持免疫刺激強度。因此，本發(fā)明的佐劑可以作為慢性病毒感染性疾病及腫瘤等的治療性疫苗的佐劑。例如人乳頭瘤病毒、乙型或丙型肝炎病毒等慢性病毒性感染疾病和癌癥等，這些疾病的治療需要特異性細胞免疫應(yīng)答以清除受感染的細胞或腫瘤細胞。
文檔編號A61P37/04GK102872458SQ201210410638
公開日2013年1月16日 申請日期2012年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2012年10月24日
發(fā)明者王躍建, 劉曉松, 倪國穎, 陳姝, 張斌, 吳校連 申請人:佛山市第一人民醫(yī)院, 劉曉松