專利名稱：腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的免疫抑制的解除劑及使用該解除劑的抗腫瘤劑的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的免疫抑制的解除劑及使用該解除劑的抗腫瘤劑。
背景技術(shù)：
已知調(diào)節(jié)T細(xì)胞在病理學(xué)上和生理學(xué)上都能抑制免疫反應(yīng)，參與自身耐受和免疫自穩(wěn)的維持(參照非專利文獻(xiàn)I)。例如，最初為⑶4+⑶25-的細(xì)胞受到各種因子的刺激而活化，其結(jié)果是⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞在外周血的⑶4+T細(xì)胞中占到約5-10%。該⑶4+⑶25+調(diào)節(jié)T細(xì)胞在⑶4+T細(xì)胞分化的同時(shí)表達(dá)FoxP3蛋白(參照非專利文獻(xiàn)2、3)。該過(guò)程中，細(xì)胞間相互作用及TGF-β (本說(shuō)明書(shū)中也記作TGF-b)和IL-10這樣的體液因子有著重要的作用(參照非專利文獻(xiàn)4)。該FoxP3蛋白不僅在⑶4+⑶25+T細(xì)胞中可見(jiàn)表達(dá)，在⑶8+⑶25+T細(xì)胞中也可見(jiàn)表達(dá)，因此被認(rèn)為是調(diào)節(jié)T細(xì)胞活化的特異性標(biāo)記物(參照非專利文獻(xiàn)5)。另外，如果在幼稚T細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)FoxP3，則顯示出調(diào)節(jié)T細(xì)胞樣表型，這就表示FoxP3對(duì)于調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能發(fā)揮具有重要的作用(參照非專利文獻(xiàn)6)。由此可以認(rèn)為，F(xiàn)oxP3基因是對(duì)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和功能進(jìn)行控制的 主基因(參照非專利文獻(xiàn)I)。作為這些調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能，已知例外地通過(guò)抑制其它細(xì)胞的功能(參照非專利文獻(xiàn)7)來(lái)抑制免疫反應(yīng)這一功能(參照非專利文獻(xiàn)I)。其機(jī)制不明，但提示了該功能依賴于細(xì)胞間相互作用，且有CTLA-4的參與(參照非專利文獻(xiàn)8)。尤其是顯示CTLA-4也參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化(參照非專利文獻(xiàn)8)。另一方面，已知雖然在癌癥患者的體內(nèi)存在有攻擊癌以將其排除的宿主免疫，但在癌細(xì)胞一邊也具有逃避宿主免疫的監(jiān)視的系統(tǒng)，例如，在體外和體內(nèi)揭示了如果在癌細(xì)胞的存在下除去調(diào)節(jié)T細(xì)胞，則針對(duì)癌細(xì)胞的免疫反應(yīng)會(huì)變化(參照非專利文獻(xiàn)17)。此夕卜，由于在胃癌(參照非專利文獻(xiàn)9、10)、直腸癌(參照非專利文獻(xiàn)11)、胰腺癌(參照非專利文獻(xiàn)12、13)、肺癌(參照非專利文獻(xiàn)14)、神經(jīng)膠質(zhì)瘤(參照非專利文獻(xiàn)17)中調(diào)節(jié)T細(xì)胞增加，因此可以認(rèn)為調(diào)節(jié)T細(xì)胞參與了癌細(xì)胞的免疫逃避系統(tǒng)。但是其機(jī)制不明，對(duì)于來(lái)源于調(diào)節(jié)T細(xì)胞的細(xì)胞因子作出了何種貢獻(xiàn)尚存在爭(zhēng)議(參照非專利文獻(xiàn)17)。而且，由于調(diào)節(jié)T細(xì)胞的缺陷會(huì)引發(fā)嚴(yán)重的自身免疫疾病(參照非專利文獻(xiàn)15)，因此可以認(rèn)為自身免疫和癌癥免疫存在共通的機(jī)制(參照非專利文獻(xiàn)16)。由此可知，調(diào)節(jié)T細(xì)胞通過(guò)免疫反應(yīng)的抑制,不僅參與針對(duì)癌細(xì)胞的免疫抑制,還參與自身免疫或變態(tài)反應(yīng)之類的過(guò)度免疫反應(yīng)(參照非專利文獻(xiàn)I)。
非專利文獻(xiàn)I =Miyara 和 Sakaguchi Trends Mol.Med.13，108-116，2007非專利文獻(xiàn)2:Fontenot 等 Nat.1mmunol.4, 330-336，2003非專利文獻(xiàn)3:Fontenot 等 Immunity 22, 329-341，2005非專利文獻(xiàn)4 =Zheng 等 J.1mmunol.172，5213-5221，2004非專利文獻(xiàn)5 =Bisikirska 等 J.Clin.1nvest.115，2904-2913，2005非專利文獻(xiàn)6 =Hori 等 Science 299，1057-1061，2003非專利文獻(xiàn)7 Jiang 和 Chess J.Clin.1nvest.114，1198-1208，2004非專利文獻(xiàn)8 =Atabani 等 Eur.J.1mmunol.35，2157-2162，2005非專利文獻(xiàn)9:Ichihara 等 Clin.Cancer Res.9, 4404-4408，2003非專利文獻(xiàn)10:ffolf 等 Clin.Cancer Res.9，606-612，2003非專利文獻(xiàn)11:Hicky 等 Semin.1mmunol.11, 125-137，1999非專利文獻(xiàn)12 =Liyanage 等 J.1mmunol.169，2756-2761，2002非專利文獻(xiàn)13 =Sasada 等 Cancer 98，1098-1099，2003
非專利文獻(xiàn)14:ffoo 等 Cancer Res.61，4766-4772，2001非專利文獻(xiàn)15:Sakaguchi 等 Immunol.Rev.182, 18-32，2001非專利文獻(xiàn)16 =Turk 等 Immunol.Rev.188，122-135，2002非專利文獻(xiàn)I7:Andaloussi 和 Lesniak Neuro-Oncology 8, 234-243, 2006發(fā)明的揭示通過(guò)在分子水平上闡明調(diào)節(jié)T細(xì)胞所導(dǎo)致的免疫抑制的作用機(jī)理，將其作為有調(diào)節(jié)T細(xì)胞參與的疾病的治療靶點(diǎn)，可以期待開(kāi)發(fā)出針對(duì)有調(diào)節(jié)T細(xì)胞參與的疾病的有效的治療方法。于是，本發(fā)明的目的在于提供增強(qiáng)細(xì)胞中的FoxP3基因表達(dá)的基因表達(dá)增強(qiáng)劑、將細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑、由它們的作用來(lái)抑制免疫的免疫抑制劑和過(guò)度免疫疾病治療劑、拮抗細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)增強(qiáng)的基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑、拮抗細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑、由它們的作用來(lái)解除免疫抑制的免疫抑制解除劑、腫瘤免疫激活劑及抗腫瘤劑等。已知鋒指轉(zhuǎn)錄因子Snail是癌癥的惡性化因子，Snail的表達(dá)越聞，癌癥就越是惡性化(Nature Rev Cancer 7, 415-428，2007)。認(rèn)為其原因之一是因?yàn)?Snail通過(guò)抑制E-鈣粘著蛋白等細(xì)胞間粘附分子的表達(dá)，從而對(duì)個(gè)體發(fā)育中的原腸胚內(nèi)陷或者組織及器官的發(fā)育過(guò)程、失去正常組織或細(xì)胞時(shí)的修復(fù)過(guò)程、癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的轉(zhuǎn)移過(guò)程等發(fā)生時(shí)的上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT:Epithelial-mesenchymal transition)進(jìn)行控制(Nature Rev Cancer 7,415-428,2007)。于是，本發(fā)明人認(rèn)真努力地嘗試在培養(yǎng)細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)Snail，闡明Snail導(dǎo)致癌癥惡性化的機(jī)理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在癌細(xì)胞中，Snail蛋白增強(qiáng)MCPl (單核細(xì)胞趨化蛋白-1, monocyte chemoattractant protein-1)基因、TSP I (血小板反應(yīng)蛋白-1,thrombospondin-l)基因、FSTLl (促濾泡素抑制素樣因子 I, Foil i statin-like I)基因或 IL_13Ra2(白細(xì)胞介素 13 受體 α 2, interleukin 13alpha 2receptor)基因的表達(dá)，對(duì)于⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞，它們的基因產(chǎn)物增強(qiáng)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化標(biāo)記物FoxP3的表達(dá)，從而完成了本發(fā)明。
由此，本發(fā)明的實(shí)施方式如下所述。(I) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)劑，該基因表達(dá)增強(qiáng)劑增強(qiáng)細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)，其特征在于，激活所述細(xì)胞的MCPl信號(hào)。(2) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)劑，該基因表達(dá)增強(qiáng)劑增強(qiáng)細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)，其特征在于，含有表達(dá)Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細(xì)胞。(3) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)劑，該基因表達(dá)增強(qiáng)劑增強(qiáng)細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。(4) (3)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)劑，其特征在于，含有表達(dá)Snail蛋白的細(xì)胞或者分泌MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細(xì)胞的培養(yǎng)上清。(5)⑵或(4)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)劑，其特征在于，所述細(xì)胞為腫瘤細(xì)胞。(6) 一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑將細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化誘導(dǎo)，其特征在于，激活所述細(xì)胞的MCPl信號(hào)。(7) 一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑將細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化誘導(dǎo)，其特征在于，含有表達(dá)Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細(xì)胞。(8) 一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑，該細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑將細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化誘導(dǎo)，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。(9) 一種免疫抑制劑，其特征在于，激活MCPl信號(hào)。(10) 一種免疫抑制劑，其特征在于，含有表達(dá)Snail蛋白的細(xì)胞或者表達(dá)MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的細(xì)胞。(11) 一種免疫抑制劑，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白。(12) 一種過(guò)度免疫疾病治療劑，其特征在于，激活MCPl信號(hào)。(13) 一種過(guò)度免疫疾病治療劑，其特征在于，含有表達(dá)Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的細(xì)胞。(14) 一種過(guò)度免疫疾病治療劑，其特征在于，含有MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2 蛋白。(15) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑，該基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑拮抗細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)增強(qiáng)，其特征在于，抑制所述細(xì)胞的MCPl信號(hào)。(16) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑，該基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑拮抗細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)增強(qiáng)，其特征在于，抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(17) (15)或(16)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑，其特征在于，含有具有MCPl拮抗活性的抗MCPl抗體。 (18) (16)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑，其特征在于，含有具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體、具有膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜結(jié)合型IL_13Ra2抗體或具有分泌型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗體。(19) 一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑，該細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑拮抗細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，其特征在于，抑制所述細(xì)胞的MCPl信號(hào)。(20) 一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑，該細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑拮抗細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，其特征在于，抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(21) (19)或(20)所述的細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑，其特征在于，含有具有MCPl拮抗活性的抗MCPl抗體。(22) (20)所述的細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑，其特征在于，含有具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體、具有膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜結(jié)合型IL_13Ra2抗體或具有分泌型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗體。(23) 一種免疫抑制解除劑，其抑制MCPl信號(hào)。(24) 一種免疫抑制解除劑，其抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(25) 一種腫瘤免疫激活劑，其抑制MCPl信號(hào)。(26) 一種腫瘤免疫激活劑，其抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(27) 一種抗腫瘤劑，其抑制MCPl信號(hào)。(28) 一種抗腫瘤劑，其抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能。(29) 一種腫瘤增殖抑制`劑，其抑制MCPl信號(hào)或TSPl蛋白的功能。(30) 一種腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)抑制劑，其抑制MCPl信號(hào)或FSTLl蛋白的功能。(31) 一種腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑，其抑制MCPl信號(hào)或FSTLl蛋白的功能。(32) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)劑，該基因表達(dá)增強(qiáng)劑是細(xì)胞中的FoxP3基因、MCPl (monocyte chemoattractant protein-1)基因、TSPl (thrombospondin-l)基因、FSTLl (Folli statin-like I)基因或 IL_13Ra2 (interleukin 13alpha 2receptor)基因的基因表達(dá)增強(qiáng)劑，其特征在于，含有Snail蛋白活性增強(qiáng)物質(zhì)。(33) (32)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)劑，其特征在于，Snail蛋白活性增強(qiáng)物質(zhì)是snail基因表達(dá)載體。(34) (32)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)劑，其特征在于，所述細(xì)胞是Panc-1細(xì)胞。(35) 一種抗癌劑，該抗癌劑是血液癌癥的抗癌劑，其特征在于，含有拮抗Snail蛋白的功能的拮抗物質(zhì)。(36) (35)所述的抗癌劑，其特征在于，所述拮抗物質(zhì)拮抗snail基因的表達(dá)。(37) (35)或(36)所述的抗癌劑，其特征在于，血液癌癥是白血病。(38) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)方法，該方法增強(qiáng)細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)，其特征在于，包括激活所述細(xì)胞的MCPl信號(hào)的工序。(39) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)方法，該方法增強(qiáng)細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)，其特征在于，包括使所述細(xì)胞與表達(dá)選自Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL_13Ra2蛋白和分泌型IL-13Ra2蛋白的一種以上的蛋白的細(xì)胞接觸的工序。(40) (39)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)方法，其特征在于，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。(41) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)方法，該方法增強(qiáng)細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)，其特征在于，包括使所述細(xì)胞與選自Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL_13Ra2蛋白和分泌型IL-13Ra2蛋白的一種以上的蛋白接觸的工序。(42) (40)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)方法，該方法增強(qiáng)細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)，其特征在于，包括使所述細(xì)胞與表達(dá)選自Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白和分泌型IL_13Ra2蛋白的一種以上的蛋白的細(xì)胞的培養(yǎng)上清接觸的工序。(43) (42)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)方法，其特征在于，所述細(xì)胞是腫瘤細(xì)胞。(44) 一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)方法，該方法將細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化誘導(dǎo)，其特征在于，包括激活所述細(xì)胞的MCPl信號(hào)的工序。(45) 一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)方法，該方法將細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化誘導(dǎo)，其特征在于，包括使所述細(xì)胞與表達(dá)Snail蛋白、MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細(xì)胞接觸的工序。(46) 一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)方法，該方法將細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化誘導(dǎo)，其特征在于，包括使所述細(xì)胞與MC Pl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白接觸的工序。(47) 一種發(fā)生了過(guò)度免疫的患者的治療方法，其特征在于，包括對(duì)所述患者給與激活MCPl信號(hào)的活化劑的工序。(48) 一種發(fā)生了過(guò)度免疫的患者的治療方法，其特征在于，包括對(duì)所述患者給與表達(dá)Snail蛋白的細(xì)胞或者表達(dá)MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細(xì)胞的工序。(49) 一種發(fā)生了過(guò)度免疫的患者的治療方法，其特征在于，包括對(duì)所述患者給與MCPl蛋白、FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的工序。(50) 一種過(guò)度免疫疾病治療劑，其特征在于，激活MCPl信號(hào)。(51) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗方法，該基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗方法拮抗細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)增強(qiáng)，其特征在于，包括抑制所述細(xì)胞的MCPl信號(hào)的工序。(52) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗方法，該基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗方法拮抗細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)增強(qiáng)，其特征在于，包括抑制所述細(xì)胞中的MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能的工序。(53) (51)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗方法，其特征在于，使所述細(xì)胞與具有MCPl拮抗活性的抗MCPl抗體接觸。(54) (52)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗方法，其特征在于，使所述細(xì)胞與具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體、具有膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜結(jié)合型IL-13Ra2抗體或具有分泌型IL_13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗體接觸。(55) 一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗方法，該細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗方法拮抗細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，其特征在于，包括抑制所述細(xì)胞的MCPl信號(hào)的工序。(56) 一種細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗方法，該細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗方法拮抗細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，其特征在于，包括抑制所述細(xì)胞中的MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能的工序。(57) (55)所述的細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗方法，其特征在于，使所述細(xì)胞與具有MCPl拮抗活性的抗MCPl抗體接觸。(58) (56)所述的細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗方法，其特征在于，使所述細(xì)胞與具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體、具有膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白抗體或具有分泌型IL_13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2蛋白抗體接觸。(59) 一種解除免疫受到了抑制的患者的免疫抑制的免疫抑制解除方法，其特征在于，包括抑制所述患者體內(nèi)的MCPl信號(hào)的工序。(60) 一種解除免疫受到了抑制的患者的免疫抑制的免疫抑制解除方法，其特征在于，包括抑制所述患者體內(nèi)的MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能的工序。(61) 一種腫瘤免疫激活方法，該方法是激活腫瘤免疫受到了抑制的患者體內(nèi)的腫瘤免疫的方法，其特征在于，包括抑制所述患者體內(nèi)的MCPl信號(hào)的工序。(62) 一種腫瘤免疫激活方法，該方法是激活腫瘤免疫受到了抑制的患者體內(nèi)的腫瘤免疫的方法，其特征在于，包括抑制MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的功能的工序。(63) 一種腫瘤患者的治療方法，其特征在于，包括抑制所述患者體內(nèi)的MCPl信號(hào)的工序。(64) 一種腫瘤患者的治療方法，其特征在于，抑制所述患者體內(nèi)的MCPl蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能。(65) 一種腫瘤患者的治療方法，其特征在于，抑制所述患者體內(nèi)的TSPl蛋白的功倉(cāng)泛。(66) 一種基因表達(dá)增強(qiáng)方法，該方法是細(xì)胞中的FoxP3基因、MCPl (monocytechemoattractant protein-1)基因、TSPl (thrombospondin-l)基因、FSTLl (Fol I i statin-1 i ke I)基因或 IL_ 13Ra2 (i nt erl eukin 13alpha 2receptor)基因的基因表達(dá)增強(qiáng)方法，其特征在于，包括使所述細(xì)胞與Snail蛋白活性增強(qiáng)物質(zhì)接觸的工序。(67) (66)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)方法，其特征在于，Snail蛋白活性增強(qiáng)物質(zhì)是snail基因表達(dá)載體。(68) (66)所述的基因表達(dá)增強(qiáng)方法，其特征在于，所述細(xì)胞是Panc-1細(xì)胞。(69) 一種治療方法，該方法是患有血液癌癥的患者的治療方法，其特征在于，包括對(duì)所述患者給與拮抗Snail蛋白功能的拮抗物質(zhì)的工序。(70) (69)所述的治療方法，其特征在于，所述拮抗物質(zhì)拮抗snail基因的表達(dá)。(71) (69)所述的治療方法，其特征在于，血液癌癥是白血病。附圖的簡(jiǎn)單說(shuō)明

圖1是表不本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中強(qiáng)制表達(dá)了 snail基因的Panc-1細(xì)胞的表型的表格。圖2A是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中通過(guò)與經(jīng)TGF-β處理的Hs294T細(xì)胞的共培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)⑶4+細(xì)胞中的FoxP3表達(dá)的圖。圖2B是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中通過(guò)與Panc-1細(xì)胞及F3細(xì)胞的共培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)⑶4+細(xì)胞中的FoxP3表達(dá)的圖。圖2C是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用與Panc-1細(xì)胞、F3細(xì)胞及DlO細(xì)胞共培養(yǎng)后CD4+細(xì)胞來(lái)抑制T細(xì)胞增殖的圖。
圖3是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中通過(guò)與HCT116細(xì)胞的共培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)CD4+細(xì)胞中的FoxP3表達(dá)的圖。圖4是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用snail基因強(qiáng)制表達(dá)克隆的細(xì)胞上清來(lái)誘導(dǎo)⑶4+細(xì)胞中的FoxP3表達(dá)的圖。圖5是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中Panc-1、HCT116、Hs294T各細(xì)胞株中因Snail蛋白強(qiáng)制表達(dá)而發(fā)生表達(dá)亢進(jìn)的基因的圖。圖6是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用抗MCPl抗體、抗TSPl抗體、抗FSTLl抗體和抗IL-13Ra2抗體來(lái)抑制F3克隆的⑶4+細(xì)胞中的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)的圖。圖7A是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用抗MCPl抗體或抗TSPl抗體來(lái)抑制F3克隆的⑶4+細(xì)胞、⑶4+⑶25+細(xì)胞和⑶4+⑶25-細(xì)胞中的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)的圖。圖7B是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用抗FSTLl抗體來(lái)抑制F3克隆的CD4+細(xì)胞、⑶4+⑶25+細(xì)胞和⑶4+⑶25-細(xì)胞中的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)的圖。圖8是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用抗IL_13Ra2抗體來(lái)抑制FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)的圖。圖9是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用抗MCPl抗體和抗IL_13Ra2抗體來(lái)抑制小鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)的圖。圖10是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中MCP1、TSPU FSTLl或分泌型IL_13Ra2的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用的圖。圖11是表 本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中由表達(dá)Snail的細(xì)胞產(chǎn)生的FoxP3蛋白的直接表達(dá)增強(qiáng)作用和間接表達(dá)增強(qiáng)作用的圖。圖12是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用snail基因強(qiáng)制表達(dá)克隆的細(xì)胞上清來(lái)誘導(dǎo)⑶8+細(xì)胞中的FoxP3表達(dá)的圖。圖13是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用抗MCPl抗體和抗TSPl抗體來(lái)抑制由F3細(xì)胞產(chǎn)生的CD8+細(xì)胞中的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用的圖。圖14是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用抗IL_13Ra2抗體來(lái)抑制由Bll細(xì)胞產(chǎn)生的⑶8+細(xì)胞中的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用的圖。圖15是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用抗MCPl抗體和抗TSPl抗體來(lái)抑制表達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞的增殖的圖。圖16是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用抗MCPl抗體和抗FSTLl抗體來(lái)抑制表達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)的圖。圖17A是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中通過(guò)RT-PCR來(lái)考察白血病細(xì)胞株中的snail表達(dá)的結(jié)果的圖。圖17B是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中利用snail基因特異性s iRNA來(lái)抑制白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)的圖。圖18是表示本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例中，抗MCPl抗體、抗IL_13Ra2抗體、抗IL-13抗體、抗IL-4抗體、抗CCR2抗體和抗IL-10抗體抑制由表達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的腫瘤免疫抑制的圖。圖19是表示使用對(duì)snail基因或MCPl基因具有特異性的s iRNA的體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(A:測(cè)得的腫瘤體積，B:肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，C:腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析)的圖。圖20是表示使用抗TSPl抗體的體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)的結(jié)果(A:測(cè)得的腫瘤體積，B:肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，C:腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析)的圖。實(shí)施發(fā)明的最佳方式下面，例舉實(shí)施例對(duì)基于上述發(fā)現(xiàn)而完成的本發(fā)明的實(shí)施方式進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。實(shí)施方式和實(shí)施例中，沒(méi)有特別說(shuō)明的情況下，采用J.Sambrook, E.F.Fritsch和T.Maniatis (編 )，《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第三版)(Molecular cloning, a laboratorymanual (3rd edition))》,冷泉港實(shí)驗(yàn)室出版社(Cold Spring Harbor Pre ss),冷泉港(Cold SpringHarbor),紐約(2001) ; F.M.Ausubel, R.Brent, R.E.Kingston, D.D.Moore, J.G.Seidman, J.A.Smith, K.Struhl (編)，《現(xiàn)代分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)(Current Protocol sin MolecularBiology))),約翰威立出版有限公司(John Wiley&SonsLtd.)等標(biāo)準(zhǔn)試驗(yàn)方案集中記載的方法，或采用對(duì)其進(jìn)行了修飾或變形的方法。此外，使用市售的試劑盒或測(cè)定裝置時(shí)，沒(méi)有特別說(shuō)明的情況下，采用它們所附的試驗(yàn)方案。還有，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的記載，本發(fā)明的目的、特征、優(yōu)點(diǎn)及其設(shè)想對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的，根據(jù)本說(shuō)明書(shū)的記載，只要是本領(lǐng)域技術(shù)人員即可容易地再現(xiàn)本發(fā)明。以下記載的發(fā)明的實(shí)施方式及具體的實(shí)施例等是表示本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式的例子，是為了舉例或說(shuō)明而示出的。因此，本發(fā)明不受所記載的實(shí)施例的限定，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠顯而易見(jiàn)地掌握的所有形態(tài)均包含在本發(fā)明內(nèi)。此外，在本說(shuō)明書(shū)中揭示的本發(fā)明的意圖及范圍內(nèi)，可基于本說(shuō)明書(shū)的記載進(jìn)行各種變形和修飾，這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見(jiàn)的，這些變形形態(tài)和修飾形態(tài)也包含在本發(fā)明內(nèi)。==基因表達(dá)增強(qiáng)劑1.MCPUTSP1、FSTLl 和 IL_13Ra2 各基因==本發(fā)明的增強(qiáng)作為對(duì)象的細(xì)胞中的MCPl (monocyte chemoattractantprotein-1)基因、TSPl (thrombospondin-l)基因、FSTLl (Follistat in-likel)基因和IL-13Ra2 (interleukin 13alpha 2receptor)基因的表達(dá)的基因表達(dá)增強(qiáng)劑的特征在于，含有Snail蛋白活性增強(qiáng)物質(zhì)。Snail蛋白活性增強(qiáng)物質(zhì)是不僅增強(qiáng)Snail蛋白分子的固有活性、還在細(xì)胞內(nèi)整體上增強(qiáng)Snail蛋白活性的物質(zhì)即可，可以是任意物質(zhì)，作為一例，可例舉可實(shí)現(xiàn)Snail蛋白的表達(dá)增強(qiáng)的NBSl強(qiáng)制表達(dá)載體(Yang等Oncogene, 26，1459-1467，2007)、snail基因的強(qiáng)制表達(dá)載體等。該基因表達(dá)增強(qiáng)劑的使用方法根據(jù)作為有效成分的Snail蛋白活性增強(qiáng)物質(zhì)的性質(zhì)來(lái)決定即可，如果是作用于作為對(duì)象的細(xì)胞的細(xì)胞膜的物質(zhì)，則對(duì)細(xì)胞給藥即可，如果是通過(guò)細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)來(lái)起作用的物質(zhì),則需要導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi)。這里，作為基因表達(dá)增強(qiáng)的對(duì)象的細(xì)胞沒(méi)有特別限定，優(yōu)選腫瘤細(xì)胞，特別優(yōu)選Panc-1 細(xì)胞。==基因表達(dá)增強(qiáng)劑I1.FoxP3基因==本發(fā)明的增強(qiáng)作為對(duì)象的細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)的基因表達(dá)增強(qiáng)劑的特征在于，含有Snail蛋白活性增強(qiáng)物質(zhì)。Snail蛋白活性增強(qiáng)物質(zhì)是不僅增強(qiáng)Snail蛋白分子的固有活性、還在細(xì)胞內(nèi)整體增強(qiáng)Snail蛋白活性的物質(zhì)即可，無(wú)特別限定，作為一例，可例舉可實(shí)現(xiàn)Snail蛋白的表達(dá)增強(qiáng)的NBSl強(qiáng)制表達(dá)載體(Yang等Oncogene, 26，1459-1467，2007)、snail基因的強(qiáng)制表達(dá)載體等。該基因表達(dá)增強(qiáng)劑的使用方法是將用Snail蛋白活性增強(qiáng)物質(zhì)增強(qiáng)了 Snail蛋白活性的細(xì)胞或該細(xì)胞的培養(yǎng)上清給與作為要增強(qiáng)FoxP3基因的表達(dá)的對(duì)象的細(xì)胞。例如，可以將這些細(xì)胞在體內(nèi)或體外共培養(yǎng)，在作為對(duì)象的細(xì)胞位于生物體內(nèi)的情況下，將增強(qiáng)了 Snail蛋白活性的細(xì)胞或該細(xì)胞的培養(yǎng)上清注入至作為對(duì)象的細(xì)胞附近即可。這里，作為對(duì)象的細(xì)胞沒(méi)有特別限定，優(yōu)選T細(xì)胞，更優(yōu)選幼稚T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞或⑶8+T細(xì)胞。==基因表達(dá)增強(qiáng)劑II1.FoxP3基因==本發(fā)明的增強(qiáng)作為對(duì)象的細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)的基因表達(dá)增強(qiáng)劑的特征在于，激活作為對(duì)象的細(xì)胞和/或與作為對(duì)象的細(xì)胞共存的其它細(xì)胞中的MCPl信號(hào)。作為基因表達(dá)增強(qiáng)劑所含的有效成分，考慮例如表達(dá)Snail蛋白的細(xì)胞、表達(dá)MCPl的細(xì)胞、MCPl蛋白、MCPl受體活化物質(zhì)等，具體可例舉分泌MCPl的腫瘤細(xì)胞、導(dǎo)入了MCPl基因的強(qiáng)制表達(dá)載體的細(xì)胞、分泌MCPl蛋白的細(xì)胞的培養(yǎng)上清、高純度MCPl蛋白、激活MCPl受體的抗MCPl受體抗體等。此外，本發(fā)明的增強(qiáng)作為對(duì)象的細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)的基因表達(dá)增強(qiáng)劑也可含有表達(dá)Snail蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL_13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的細(xì)胞，或者含有FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。此時(shí)，作為基因表達(dá)增強(qiáng)劑，具體可使用表達(dá)Snail蛋白、FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的腫瘤細(xì)胞，導(dǎo)入了編碼Snail、FSTL1、膜結(jié)合型IL-13Ra2或分泌型IL_13Ra2的基因的強(qiáng)制表達(dá)載體的細(xì)胞，表達(dá)Snail蛋白的細(xì)胞的培養(yǎng)上清，分泌FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白的細(xì)胞的培養(yǎng)上清，高純度的FSTLl蛋白或分泌型IL-13Ra2蛋白。`還有，基因表達(dá)增強(qiáng)劑可以含有上述物質(zhì)中的一種，也可以含有多種。作為這些基因表達(dá)增強(qiáng)劑的使用方法，例如向作為對(duì)象的細(xì)胞直接給與基因表達(dá)增強(qiáng)劑即可。此時(shí)，可以使該細(xì)胞與其它細(xì)胞共存，作為共存的細(xì)胞，優(yōu)選具有向T細(xì)胞遞呈抗原而使其增殖的作用的樹(shù)突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞。此外，也可以向除作為對(duì)象的細(xì)胞以外的其它細(xì)胞給與基因表達(dá)增強(qiáng)劑，將該細(xì)胞的培養(yǎng)上清給與作為對(duì)象的細(xì)胞。作為這里所用的細(xì)胞，優(yōu)選樹(shù)突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞。這里，作為對(duì)象的細(xì)胞沒(méi)有特別限定，優(yōu)選T細(xì)胞，更優(yōu)選幼稚T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞或⑶8+T細(xì)胞。==細(xì)胞分化促進(jìn)劑、免疫抑制劑==FoxP3蛋白是對(duì)具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和功能進(jìn)行控制的主基因(Miyara 和 Sakaguchi Trends Mol.Med.13，108-116，2007;Hori 等 Science299，1057-1061，2003; Jiang 和 Chess J.Clin.1nvest.114，1198-1208，2004;)。因此，上述的增強(qiáng)FoxP3基因的表達(dá)的基因表達(dá)增強(qiáng)劑可作為用于將作為對(duì)象的細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑和免疫抑制劑使用。實(shí)際上，含有表達(dá)snail基因的細(xì)胞的FoxP3基因表達(dá)增強(qiáng)劑使共培養(yǎng)的⑶4+細(xì)胞獲得T細(xì)胞的增殖抑制能力，這也表明FoxP3基因表達(dá)增強(qiáng)劑可用作細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑和免疫抑制劑。
還有，作為對(duì)象的細(xì)胞沒(méi)有特別限定，優(yōu)選T細(xì)胞，更優(yōu)選幼稚T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞或⑶8+T細(xì)胞。還有，這些細(xì)胞分化促進(jìn)劑和免疫抑制劑可以在體內(nèi)使用，也可以在體外使用。此外，免疫抑制劑可以抑制過(guò)度免疫，也可以抑制正常免疫。==過(guò)度免疫疾病治療劑==調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能下降會(huì)引發(fā)自身免疫或變應(yīng)性疾病等過(guò)度免疫疾病(Miyara 和 Sakaguchi Trends Mol.Med.13, 108-116, 2007;Turk 等 Immunol.Rev.188，122-135，2002)。因此，通過(guò)將作為對(duì)象的T細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化誘導(dǎo)，藉此抑制免疫，從而可治療這些過(guò)度免疫疾病。因此，上述細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑和免疫抑制劑可用作自身免疫或變應(yīng)性疾病等的過(guò)度免疫疾病治療劑。這里，過(guò)度免疫疾病是因調(diào)節(jié)T細(xì)胞的功能下降而引發(fā)的疾病即可，不限于自身免疫或變應(yīng)性疾病。還有，作為對(duì)象的細(xì)胞沒(méi)有特別限定，優(yōu)選T細(xì)胞，更優(yōu)選幼稚T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞或CD8+T細(xì)胞。過(guò)度免疫疾病治療劑的使用方法可適當(dāng)決定，對(duì)于患者，較好是全身給藥或在發(fā)生過(guò)度免疫的部位直接給藥。==FoxP3基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑==本發(fā)明的拮抗作為對(duì)象的細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)增強(qiáng)的FoxP3基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑的特征在于，抑制作為對(duì)象的細(xì)胞和/或與作為對(duì)象的細(xì)胞共存的細(xì)胞的MCPl信號(hào)。作為該基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑所含的有效成分，抑制例如MCPl蛋白或MCPl受體的功能即可，具體可例舉拮抗它們的功能的拮抗抗體、分泌該拮抗抗體的雜交瘤、表現(xiàn)出拮抗活性的低分子化合物等。 此外，本發(fā)明的FoxP3基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑的特征也可以在于，抑制FSTLl蛋白、膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白或分泌型IL_13Ra2蛋白的功能。該基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑所含的有效成分可例舉例如具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體、具有膜結(jié)合型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗膜結(jié)合型IL_13Ra2抗體或具有分泌型IL-13Ra2蛋白拮抗活性的抗分泌型IL_13Ra2抗體等。作為這些基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑的使用方法，只要在體內(nèi)或體外對(duì)作為對(duì)象的細(xì)胞或其附近給藥即可。但是，在FoxP3基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑通過(guò)抑制與作為FoxP3基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗的對(duì)象的細(xì)胞共存的細(xì)胞的MCPl信號(hào)來(lái)顯現(xiàn)效果的情況下，基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑以作用于該共存細(xì)胞的方式給藥。這里，該共存細(xì)胞可考慮樹(shù)突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞等。這里，作為對(duì)象的細(xì)胞沒(méi)有特別限定，優(yōu)選T細(xì)胞，更優(yōu)選幼稚T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞或⑶8+T細(xì)胞。==細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑、免疫抑制解除劑==如上所述，F(xiàn)oxP3蛋白是對(duì)具有免疫抑制功能的調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化和功能進(jìn)行控制的主基因(Miyara 和 Sakaguchi Trends Mol.Med.13，108-116，2007;Hori 等 Science299，1057-1061，2003; Jiang 和 Chess J.Clin.1nvest.114，1198-1208，2004;)。因此，如果抑制FoxP3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，則可拮抗作為對(duì)象的細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化誘導(dǎo)，進(jìn)而可解除調(diào)節(jié)T細(xì)胞所導(dǎo)致的免疫抑制。由此，上述的抑制FoxP3基因的表達(dá)增強(qiáng)的基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑可用作拮抗作為對(duì)象的細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑和免疫抑制解除劑。作為細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑和免疫抑制解除劑的使用方法，只要在體內(nèi)或體外對(duì)作為拮抗向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的對(duì)象的細(xì)胞或其附近給藥即可。但是，細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑和免疫抑制解除劑通過(guò)抑制與作為對(duì)象的細(xì)胞共存的細(xì)胞的MCPl信號(hào)來(lái)顯現(xiàn)效果的情況下，以作用于該共存細(xì)胞的方式給藥。這里，該共存細(xì)胞可考慮樹(shù)突狀細(xì)胞或巨噬細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞等。還有，作為對(duì)象的細(xì)胞沒(méi)有特別限定，優(yōu)選T細(xì)胞，更優(yōu)選幼稚T細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞或⑶8+T細(xì)胞。還有，這些細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑和免疫抑制解除劑可以在體內(nèi)使用，也可以在體外使用。==腫瘤免疫激活劑、抗腫瘤劑==本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在腫瘤細(xì)胞中，Snail蛋白增強(qiáng)MCPl基因、TSPl基因、FSTLl基因和IL-13Ra2基因的表達(dá)，它們的基因產(chǎn)物直接和間接地作用于⑶4+T細(xì)胞和⑶8+T細(xì)胞，增強(qiáng)調(diào)節(jié)T細(xì)胞的活化標(biāo)記物FoxP3的表達(dá)。即，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞通過(guò)MCPl蛋白、TSPl蛋白、FSTLl蛋白、IL-13Ra2蛋白、IL-13蛋白、IL-4蛋白、CCR2蛋白、IL-10蛋白等腫瘤免疫抑制中間蛋白影響周?chē)拿庖呒?xì)胞，使該免疫細(xì)胞分化成調(diào)節(jié)T細(xì)胞，藉此抑制宿主的癌癥免疫?；谠撌聦?shí)，拮抗這些中間蛋白的作用的本發(fā)明的FoxP3基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑可解除腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的腫瘤免疫抑制，激活腫瘤免疫。如果激活患者本身的腫瘤免疫,則患者可獲得腫瘤的治療效果。因此，本發(fā)明的FoxP3基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑可用作腫瘤免疫激活劑和抗腫瘤劑。這里，作為拮抗腫瘤免疫抑制中間蛋白的功能的拮抗物質(zhì)，可例舉腫瘤免疫抑制中間蛋白的抗體或競(jìng)爭(zhēng)性抑制分子(顯性負(fù)相突變體)等。實(shí)際上，如果是普通的腫瘤細(xì)胞，則會(huì)被包括樹(shù)突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞在內(nèi)的吞噬細(xì)胞吞噬而被消化排除，雖然表達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞拮抗該吞噬作用，但拮抗中間蛋白的作用的拮抗物質(zhì)可抑制表 達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的吞噬作用拮抗。腫瘤免疫激活劑和抗腫瘤劑的使用方法可適當(dāng)決定，對(duì)于患者，較好是在腫瘤部位或其附近直接給藥。==腫瘤增殖抑制劑==本發(fā)明的腫瘤增殖抑制劑通過(guò)抑制MCPl信號(hào)或TSPl蛋白的功能來(lái)抑制該腫瘤細(xì)胞的增殖。腫瘤增殖抑制劑含有例如MCPl蛋白、MCPl受體、或者拮抗TSPl蛋白的功能的拮抗抗體或分泌該拮抗抗體的雜交瘤作為有效成分。腫瘤增殖抑制劑的使用方法可適當(dāng)決定，對(duì)于患者，較好是全身給藥或者在腫瘤部位或其附近直接給藥。==腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)抑制劑、腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑==本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)抑制劑通過(guò)抑制MCPl信號(hào)或FSTLl蛋白的功能來(lái)抑制該腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)。腫瘤細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)浸潤(rùn)于正常細(xì)胞間或形成血管壁的細(xì)胞間。因此，通過(guò)抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)，可抑制腫瘤的轉(zhuǎn)移。因此，腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)抑制劑可用作腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑。本發(fā)明的腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)抑制劑和腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑含有例如MCPl蛋白、MCPl受體、或者拮抗FSTLl蛋白的功能的拮抗抗體或分泌該拮抗抗體的雜交瘤、MCPl的顯性負(fù)相突變體(7ND)作為有效成分。腫瘤轉(zhuǎn)移抑制劑的使用方法可適當(dāng)決定，對(duì)于患者，較好是全身給藥或者在腫瘤部位或其附近直接給藥。還有，對(duì)于上述本發(fā)明的所有藥劑，作為治療對(duì)象的腫瘤沒(méi)有特別限定，可以是實(shí)體癌，也可以是血液癌癥，還可以是上皮性的癌或除此以外的惡性腫瘤。==針對(duì)血液癌癥的抗癌劑==本發(fā)明的針對(duì)血液癌癥的抗癌劑是含有拮抗Snail蛋白的功能的拮抗物質(zhì)的抗癌劑。這里，拮抗Snail蛋白的功能的拮抗物質(zhì)不僅是拮抗Snail蛋白分子的固有活性的低分子化合物和蛋白質(zhì)(顯性負(fù)相突變體)等，只要是在細(xì)胞內(nèi)整體上拮抗Snail蛋白的功能的物質(zhì)即可，無(wú)特別限定，作為一例，可例舉拮抗Snail蛋白的表達(dá)的核酸(反義RNA、siRNA, shRNA等)、這些核酸的強(qiáng)制表達(dá)載體、競(jìng)爭(zhēng)性抑制蛋白等。該抗癌劑較好是通過(guò)拮抗癌化血液細(xì)胞的浸潤(rùn)來(lái)發(fā)揮其功能。還有，至今為止，完全不知道血液癌癥和Snail的關(guān)系。即使認(rèn)為Snail的表達(dá)與腫瘤的轉(zhuǎn)移相關(guān)，這也是因?yàn)槠鋵?duì)實(shí)體癌等中可見(jiàn)的E-鈣粘著蛋白等細(xì)胞間粘附分子進(jìn)行控制，關(guān)于懸浮類的血細(xì)胞的癌，Snail的參與是本領(lǐng)域技術(shù)人員所無(wú)法預(yù)見(jiàn)的。這里，作為血液癌癥沒(méi)有特別限定，可例舉例如白血病、惡性淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤。
實(shí)施例[IJPanc-1細(xì)胞中的snail基因的強(qiáng)制表達(dá)〈目的〉在人胰腺癌細(xì)胞株P(guān)anc-1細(xì)胞中強(qiáng)制表達(dá)snail基因，對(duì)于Snail的表達(dá)得到了增強(qiáng)的細(xì)胞克隆D6、DIO、F3、F5，考察與細(xì)胞的形狀、Snail和E-鈣粘著蛋白的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平、細(xì)胞增殖能力、細(xì)胞粘附能力、細(xì)胞遷移能力、細(xì)胞浸潤(rùn)能力相關(guān)的表型。<實(shí)驗(yàn)方法>(I) snail基因的強(qiáng)制表達(dá)載體的制作及其導(dǎo)入由經(jīng)已知為EMT誘導(dǎo)劑之一的TGF- β刺激后的Panc-1細(xì)胞通過(guò)PCR擴(kuò)增snailcDNA(CDS 71-865，795bp)，插入具有G418抗性基因的pcDNA3.1 (+)質(zhì)粒載體(英杰公司(Invitrogen社))的限制酶EcoR1-Xho I位點(diǎn)。通過(guò)電穿孔將其導(dǎo)入腫瘤細(xì)胞株，培養(yǎng)2周后用G418(2mg/mL)篩選抗藥性細(xì)胞，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行克隆。(2)利用RT-PCR進(jìn)行的導(dǎo)入snail基因的細(xì)胞株的基因表達(dá)分析用RNeasy (凱杰公司(QIAGEN社))從人腫瘤細(xì)胞株中提取RNA，用AMV逆轉(zhuǎn)錄(420C.50 分一70°C.15 分)，采用所得 cDNA 進(jìn)行 PCR(iCycler，伯樂(lè)公司(BIO-RAD 社))。針對(duì)snail cDNA的引物的序列如下。正向(Forward)5’-CAGATGAGGACAGTGGGAAAGG-3’(序列編號(hào) I)反向(Reverse)5’ -ACTCTTGGTGCTTGTGGAGCAG-3’ (序列編號(hào) 2)(3)利用免疫組化染色進(jìn)行的導(dǎo)入 snail基因的細(xì)胞株的蛋白質(zhì)表達(dá)分析為考察腫瘤細(xì)胞中的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平，將腫瘤細(xì)胞(5X104個(gè))在載玻片室(slide chamber)內(nèi)培養(yǎng)過(guò)夜(37°C, 5% CO2),用4%低聚甲醒固定。采用正常山羊血清的非特異性染色的封閉處理后，為進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色而用Cytofix/Cytoperm(BD制藥公司(BDPhermingen社))處理(4°C、20分鐘)，然后用各種抗體(例如抗Snail抗體(圣克魯茲公司(SANTA CRUZ 社))+Alexa488 標(biāo)記抗山羊 IgG(分子探針公司(Molecular Probes 社))、或抗E-1丐粘著蛋白抗體(BD生命科學(xué)公司(BDBioscience社))+Alexa568標(biāo)記抗小鼠IgG(分子探針公司))于4°C染色I(xiàn)小時(shí)。然后用Vecter Shield(載體實(shí)驗(yàn)室公司(VectorLaboratories社))將細(xì)胞封入，用突光顯微鏡(LSM 5PASCAL,卡爾蔡司公司(Carl Zeiss社))觀察、攝像。〈結(jié)果〉圖1A中，將導(dǎo)入snail基因的細(xì)胞株的表型匯總于表中。雖然在作為親細(xì)胞株的Panc-1細(xì)胞中也可見(jiàn)Snail蛋白的固有的表達(dá)，但通過(guò)導(dǎo)入snail基因的強(qiáng)制表達(dá)載體，表中所示的克隆中的Snail蛋白的表達(dá)水平亢進(jìn)。其結(jié)果是，各克隆中，細(xì)胞形狀均從球狀(round)變成了扁平的紡錘形(spi ndl e/spreadi ng),在體外和體內(nèi)細(xì)胞增殖能力(proliferation)均下降，E-1丐粘著蛋白(E-cadherin)的蛋白水平和細(xì)胞粘附能力(Adhesion)均下降，細(xì)胞遷移能力(migration)和細(xì)胞浸潤(rùn)能力(Invas ion)均亢進(jìn)。特別是在克隆F3中，由于觀察到了與上皮一間充質(zhì)轉(zhuǎn)換(EMT)相關(guān)的顯著效果，因此在以下實(shí)施例中使用F3。[2]通過(guò)與Hs294T細(xì)胞的共培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)CD4+細(xì)胞中的FoxP3表達(dá)〈目的〉揭示通過(guò)將經(jīng)TGF-β處理的人黑色素瘤Hs294T細(xì)胞與PBMC共培養(yǎng)，在PBMC中的⑶4+細(xì)胞中發(fā)生FoxP3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，F(xiàn)oxP3蛋白的表達(dá)因snai I基因的下調(diào)(knockdown)而消失。<實(shí)驗(yàn)方法> (I)腫瘤細(xì)胞的TGF-β處理采用6孔板，在人黑色素瘤Hs294T細(xì)胞的培養(yǎng)基中以2 μ g/3 X IO5個(gè)/2mL的量添加下述的snail基因特異性s iRNA(英杰公司)或者作為陰性對(duì)照的其無(wú)義序列的寡核苷酸，然后進(jìn)行培養(yǎng)。2天后，洗滌這些細(xì)胞后，添加TGF-β (5ng/mL)，再培養(yǎng)3天。Snail基因特異性siRNA#l的序列正向5’ -GCGAGCUGCAGGACUCUAA-3’ (序列編號(hào) 3)反向5’ -UUAGAGUCCUGCAGCUCGC-3’ (序列編號(hào) 4)snail基因特異性siRNA#2的序列正向5’ -CCCACUCAGAUGUCAAGAA-3’ (序列編號(hào) 5)反向5’ -UUCUUGACAUCUGAGUGGG-3’ (序列編號(hào) 6)siRNA對(duì)照的序列正向5’ -GCGCGUCAGGACUCGAUAA-3’ (序列編號(hào) 7)反向5’ -UUAUCGAGUCCUGACGCGC-3’ (序列編號(hào) 8)(2)利用RT-PCR進(jìn)行的腫瘤細(xì)胞的基因表達(dá)分析回收腫瘤細(xì)胞，與[I]中同樣地通過(guò)RT-PCR測(cè)定snail基因的表達(dá)。同時(shí)，用下述引物測(cè)定作為用于進(jìn)行表達(dá)定量的對(duì)照的GAPDII基因的表達(dá)。正向5’ -GTCAACGGATTTGGTCGTATT-3’ (序列編號(hào) 9)
反向5’ -ATCACTGCCACCCAGAAGACT-3’ (序列編號(hào) 10)(3)人外周血細(xì)胞(PBMC)的分離采集健康人的血液并添加1/10量的4%檸檬酸鈉后，使其在菲可(Ficoll)(比重1.090)中分層，離心分離(1500rpm、20分鐘、室溫)，將存在于中間層的細(xì)胞組分用作“(成團(tuán)(bulk))PBMC”。(4) PBMC和腫瘤細(xì)胞(Hs294T細(xì)胞)的共培養(yǎng)預(yù)先通過(guò)用MMCdOO μ g/mL、2小時(shí)、37°C )處理或照射X射線(20K rad)來(lái)使所得腫瘤細(xì)胞失活。PBMC和腫瘤細(xì)胞以1:10的比例(例如，96孔板的情況下為I X IO5個(gè)PBMC和IXlO4個(gè)腫瘤細(xì)胞，24孔板的情況下為5 X IO5個(gè)PBMC和5 X IO4個(gè)腫瘤細(xì)胞)接種于板，在37°C、5% CO2的條件下共培養(yǎng)，3 5天后回收PBMC。(5)FoxP3蛋白的表達(dá)分析

首先使所得PBMC與市售的抗CD4抗體(BD制藥公司)和抗CD25抗體(BD制藥公司)反應(yīng)I小時(shí)。接著，為進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)染色而用Cytofix/Cytoperm(BD制藥公司)處理(4°C、20分鐘)，用抗FoxP3抗體(電子生命科學(xué)公司(eBioscienc e社))于4°C反應(yīng)I小時(shí)，然后用流式細(xì)胞儀FACScan (碧迪公司(Becton Dickinson社))對(duì)CD4+或CD4+CD25+細(xì)胞組分進(jìn)行門(mén)選(gating),考察FoxP3的表達(dá)水平。< 結(jié)果 >圖2A所不為snail基因的表達(dá)和FoxP3的表達(dá)的考察結(jié)果。如果對(duì)人黑色素瘤Hs294T細(xì)胞進(jìn)行TGF-β處理，則snail基因的表達(dá)亢進(jìn)(圖中的對(duì)照)，利用snail基因特異性siRNA可抑制其表達(dá)。此時(shí)，⑶4+細(xì)胞組分中表達(dá)FoxP3的細(xì)胞的比例與未經(jīng)TGF-β處理時(shí)(25% )相比，在處理后有所增加(31% )，如果用snail基因特異性siRNA抑制snail基因的表達(dá)，則無(wú)論是否有TGF-β處理，⑶4+細(xì)胞組分中表達(dá)FoxP3的細(xì)胞的比例均有所減少(無(wú)處理:25%— 17%，有處理:31%—20% )。這就表示⑶4+細(xì)胞中的FoxP3的表達(dá)亢進(jìn)是由Hs294T細(xì)胞中的snail基因的表達(dá)亢進(jìn)導(dǎo)致的。[3]通過(guò)Panc-1細(xì)胞和F3細(xì)胞或DlO細(xì)胞的共培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)⑶4+細(xì)胞中的FoxP3表達(dá)并獲得T細(xì)胞增殖抑制活性〈目的〉揭示通過(guò)將PBMC與F3細(xì)胞或DlO細(xì)胞共培養(yǎng)，PBMC中的⑶4+細(xì)胞中發(fā)生FoxP3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)，且CD4+細(xì)胞獲得抑制T細(xì)胞增殖的活性。<實(shí)驗(yàn)方法>(I) PBMC和腫瘤細(xì)胞(Panc-1細(xì)胞或F3細(xì)胞)的共培養(yǎng)采用Pacn-1細(xì)胞或F3細(xì)胞，通過(guò)與[2]相同的方法進(jìn)行與PBMC的共培養(yǎng)。⑵⑶4+細(xì)胞和新鮮T細(xì)胞的共培養(yǎng)使與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)了 3 5天后的PBMC在菲可(比重1.090)中分層，離心分離(1500rpm、20分鐘、室溫)采集存在于中間層的細(xì)胞組分并洗滌后，加入磁珠結(jié)合抗⑶4抗體(MACS抗體，美天旎生物技術(shù)公司(Miltenyi Biotec社))，于4°C反應(yīng)30分鐘，用MACS細(xì)胞自動(dòng)分離機(jī)(美天旎生物技術(shù)公司)分離CD4+細(xì)胞。另一方面，作為用于觀察T細(xì)胞增殖反應(yīng)的材料，通過(guò)與[2]相同的方法從同一健康人中重新制備PBMC，通過(guò)與上述相同的方法用MACS抗體(抗⑶4抗體或抗⑶8抗體)分離T細(xì)胞(⑶4+細(xì)胞或⑶8+細(xì)胞)。在該新鮮T細(xì)胞(2 X IO5個(gè))中加入抗⑶3抗體(終濃度I μ g/mL)以及從事先與腫瘤細(xì)胞一起培養(yǎng)的PBMC中分離的⑶4+細(xì)胞(2 X IO5個(gè))，在96孔板中培養(yǎng)4天。加入1/10量的Premix WST-1溶液(寶生物公司(夕力5 才社))，再培養(yǎng)24小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(450-655nm)，將該數(shù)值作為T(mén)細(xì)胞的增殖量。(3) FoxP3蛋白的表達(dá)分析與[2]中記載的方法同樣地考察FoxP3蛋白的表達(dá)。< 結(jié)果 >(l)FoxP3蛋白的表達(dá)分析圖2B所示為FACS分析的結(jié)果。上部(淋巴細(xì)胞中的⑶4+⑶25+)是根據(jù)⑶4和⑶25的表達(dá)來(lái)劃分細(xì)胞的結(jié)果，圖中的數(shù)字表示淋巴球組 分中的⑶4+⑶25-(左)或⑶4+⑶25+(右)的細(xì)胞所占的比例(% )0下部(⑶4+組分中的FoxP3+)表示⑶4+細(xì)胞組分中的FoxP3+蛋白的表達(dá)水平(各圖中FoxP3蛋白的表達(dá)水平沿著X軸升高)，圖中的數(shù)字表示存在于根據(jù)與所使用的FoxP3抗體的同種型對(duì)照(Isotypecontrol)(大鼠IgG2a)的比較分析被判斷為表達(dá)陽(yáng)性的范圍內(nèi)的⑶4+細(xì)胞組分中的FoxP3+細(xì)胞所占的比例(％ )。對(duì)于CD4+細(xì)胞，和未與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的情況(圖中的無(wú)腫瘤(Notumor):FoxP3的表達(dá)水平為14.56)相比，通過(guò)與未強(qiáng)制表達(dá)snail的Panc-1細(xì)胞共培養(yǎng)(圖中的親代(Parent):30.83)，可見(jiàn)FoxP3的表達(dá)增強(qiáng)。但是，如果與強(qiáng)制表達(dá)snail基因的F3細(xì)胞共培養(yǎng)(圖中的F3:43.44),FoxP3的表達(dá)進(jìn)一步增強(qiáng)。該結(jié)果表明，snail基因的表達(dá)水平與FoxP3的表達(dá)增強(qiáng)能力相關(guān)。如上所述，表達(dá)snail基因的細(xì)胞使共培養(yǎng)的⑶4+細(xì)胞的FoxP3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。此外，如果強(qiáng)制表達(dá)snail基因，使Snail蛋白的表達(dá)水平亢進(jìn)，則FoxP3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)能力也亢進(jìn)。還有，如果向F3細(xì)胞導(dǎo)入對(duì)snail基因具有特異性的s i RNA來(lái)抑制snail基因的表達(dá)，則FoxP3的表達(dá)增強(qiáng)能力下降，由此可以確認(rèn)，F(xiàn)oxP3的表達(dá)增強(qiáng)能力不是因克隆間的差異等而產(chǎn)生的人為偏差，實(shí)際上是snail基因的強(qiáng)制表達(dá)的結(jié)果。(2) CD4+細(xì)胞與T細(xì)胞的共培養(yǎng)圖2C所示為各T細(xì)胞的增殖測(cè)定的結(jié)果(左圖為⑶4+T細(xì)胞，右圖為⑶8+T細(xì)胞)。還有，無(wú)(None)表示未添加抗CD3抗體也未添加CD4+細(xì)胞的T細(xì)胞增殖的單純的背景值。此外，作為陽(yáng)性對(duì)照，未添加CD4+細(xì)胞而只添加抗CD3抗體的T細(xì)胞的增殖在CD4+細(xì)胞和⑶8+細(xì)胞中均顯示出2.0以上的值(圖中未表示)。即使與Panc-1細(xì)胞共培養(yǎng)，T細(xì)胞的增殖也受到強(qiáng)烈抑制(圖中的親代(Prt)或模擬物(Mock)為I 1.5)，但將T細(xì)胞與DlO細(xì)胞及F3細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)受到更強(qiáng)烈的抑制，可見(jiàn)顯著的抑制效果(P〈0.001)。如上所述，表達(dá)snail基因的細(xì)胞使共培養(yǎng)的CD4+細(xì)胞獲得T細(xì)胞的增殖抑制能力，即，可使其向調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化誘導(dǎo)。[4]通過(guò)與HCTl 16細(xì)胞的共培養(yǎng)來(lái)誘導(dǎo)CD4+細(xì)胞中的FoxP3表達(dá)〈目的〉
用人結(jié)腸癌細(xì)胞株HCT116代替Panc-1細(xì)胞，進(jìn)行與[I] [2]相同的實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法與[I] [2]相同。〈結(jié)果〉圖3所示為FACS分析的結(jié)果。和未與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的情況(圖中的無(wú)腫瘤:FoxP3的表達(dá)水平為20.42)相t匕，即使與未強(qiáng)制表達(dá)Snail的HCTl 16細(xì)胞共培養(yǎng)，F(xiàn)oxP3的表達(dá)也不增強(qiáng)(圖中的親代:18.30)。但是，如果與強(qiáng)制表達(dá)snail基因的Bll克隆共培養(yǎng)，則FoxP3的表達(dá)增強(qiáng)(圖中的Bll:44.79)。如上所述，在多種癌癥中觀察到snail基因的表達(dá)水平與FoxP3的表達(dá)增強(qiáng)能力的相關(guān)性。[5]利用snail基因強(qiáng)制表達(dá)克隆的細(xì)胞培養(yǎng)上清來(lái)誘導(dǎo)⑶4+細(xì)胞中的FoxP3表達(dá)〈目的〉揭示不僅是F3細(xì)胞，F(xiàn)3細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)上清也能增強(qiáng)⑶4+細(xì)胞的FoxP3蛋白表達(dá)。< 方法 >(1)培養(yǎng)上清的制備方法將1 X IO5個(gè)腫瘤細(xì)胞在25cm2的燒瓶中培養(yǎng)3 4天，將其培養(yǎng)上清轉(zhuǎn)移至另一試管，高速離心(3000rpm、20分鐘、4°C )分離后，將其上清作為培養(yǎng)上清。4°C保存至用于實(shí)驗(yàn)。

(2)使用培養(yǎng)上清的處理方法使用24孔板，將等容量比的5 X IO5個(gè)PBMC (或其中的一組分)的懸浮液和腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清、即2倍稀釋的腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清于37°C、5% CO2的條件下培養(yǎng)3 4天，然后回收該P(yáng)BMC。還有，作為陰性對(duì)照，用未進(jìn)行培養(yǎng)的培養(yǎng)基代替腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。(3)其它與[2]同樣地進(jìn)行FoxP3蛋白的表達(dá)分析。< 結(jié)果 >圖4所示為FACS分析的結(jié)果。對(duì)于⑶4+細(xì)胞(圖A上部)、⑶4+⑶25-細(xì)胞(圖A下部)、⑶4+⑶25+細(xì)胞(圖B)，親細(xì)胞株(圖A中的親代-上清(Prt-sup)，圖B中的親代)和導(dǎo)入Snail的細(xì)胞(圖A中的D6-snail+等、圖B中的Snail-Tr)的培養(yǎng)上清與單純使用培養(yǎng)基的情況(圖A中的培養(yǎng)基(Medium),圖B中的無(wú)刺激物(No stimulant))相比,均能增強(qiáng)FoxP3蛋白的表達(dá)。這就表明由Snail蛋白的表達(dá)產(chǎn)生的FoxP3蛋白表達(dá)的增強(qiáng)作用是體液因子介導(dǎo)的。如上所述,表達(dá)Snail蛋白的細(xì)胞的培養(yǎng)上清也可用作FoxP3蛋白表達(dá)的增強(qiáng)劑。還有，⑶ 4+⑶25+細(xì)胞有時(shí)也會(huì)進(jìn)行向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化而具有最大限度的FoxP3蛋白表達(dá)，因此有時(shí)無(wú)法獲得表達(dá)Snail的細(xì)胞的上清的效果(參照后述圖6)。

[6]因Panc-1、HCT116、Hs294T各細(xì)胞株中的Snail蛋白強(qiáng)制表達(dá)而發(fā)生表達(dá)亢進(jìn)的基因〈目的〉
揭示在Panc-1、HCT116和Hs294T中，通過(guò)Snail蛋白的強(qiáng)制表達(dá)，MCPU TSPUFSTLl或分泌型IL-13Ra2的表達(dá)亢進(jìn)。< 方法 >(l)MCPl、TSPl、FSTLl或分泌型IL_13Ra2的表達(dá)水平的測(cè)定方法對(duì)于MCPl (ELISA 試劑盒:內(nèi)生公司(END0GEN 社)制 #EHMCP1)、TSPl (ELISA 試劑盒:貴彌功公司(CHEMIC0N社)制#CYT168)、分泌型IL_13Ra2 (ELISA試劑盒:艾碧康公司(ABCAi^i )制#ab46112)的蛋白的表達(dá)，用市售的ELISA試劑盒按照所附的試驗(yàn)方案進(jìn)行檢測(cè)。還有，作為陰性對(duì)照，用未進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)基進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。此外，F(xiàn)STLl的基因表達(dá)按照[I]所示的RT-PCR法測(cè)定。引物采用以下的寡核苷酸。還有，作為陰性對(duì)照(NC)，在不添加mRNA的條件下進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。正向2 5’-GCACAGGCAACTGTGAGAAA-3’(序列編號(hào) 11)反向2 5’-CATAGTGTCCAAGGGCTGGT-3’(序列編號(hào) 12)(2) IL-13Ra2蛋白的細(xì)胞內(nèi)局部分布的檢測(cè)方法腫瘤細(xì)胞中的膜結(jié)合型以及存在于細(xì)胞內(nèi)/核內(nèi)的IL_13Ra2的表達(dá)與Snail蛋白的表達(dá)同樣地按照[I] (3)所示的免疫染色法進(jìn)行。< 結(jié)果 >結(jié)果示于圖5。(A)所示為MCPUTSP1和sIL_13Ra2 (分泌型)的蛋白表達(dá)水平的比較結(jié)果，(B)所示為FSTLl的mRNA表達(dá)水平的比較結(jié)果。此外，(C)所示為各腫瘤細(xì)胞中的IL-13Ra2的局部分布。在各強(qiáng)制表達(dá)Snail的克隆(D6、DIO、F3、F5)中，上述細(xì)胞因子的表達(dá)與親代(Prt)相比均有所亢進(jìn)。此外，不僅是分泌型(圖5A)IL-13Ra2的表達(dá)亢進(jìn)，如圖5C所示，在各克隆中，在細(xì)胞膜或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)以及核內(nèi)，IL-13Ra2的表達(dá)均亢進(jìn)。如上所述，通過(guò)增強(qiáng)Snail蛋白的活性，可增強(qiáng)MCP1、TSP1、IL_13Ra2、FSTLl的表達(dá)。[7]利用針對(duì)MCPl、TSPl、FSTLl、IL_13Ra2各蛋白的抗體來(lái)抑制F3克隆所導(dǎo)致的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)〈目的〉揭示針對(duì)MCP1、TSPU FSTLU IL_13Ra2各蛋白的抗體可拮抗F3克隆的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用。< 方法 >(I)本實(shí)施例中所用的抗體采用市售的抗MCPl抗體(BD制藥公司制#551226)、抗TSPl抗體(艾碧康公司制#ab3131)、抗FSTLl抗體(安迪公司(R&D社)制#MAB1694)、抗TGF-β I抗體(安迪公司制#ΜΑΒ246)、抗IL-10抗體(安迪公司制#ΜΑΒ2171)、抗IL_13Ra2抗體(安迪公司制#AF146)、小鼠IgG抗體(BD制藥#557273)。(2)添加有抗體的培養(yǎng)上清的回收以I 5μ g/mL的終濃度在失活的腫瘤細(xì)胞中 直接添加或在其培養(yǎng)基中添加抗MCPl抗體、抗TSPl抗體、抗FSTLl抗體、抗IL13Ra2抗體，與PBMC —起培養(yǎng)3天，回收該P(yáng)BMC。作為陽(yáng)性對(duì)照，采用抗TGF- β I抗體、抗IL-10抗體，作為陰性對(duì)照，采用小鼠I gG抗體。(3)其它腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng)上清的制備方法和FoxP3蛋白的表達(dá)分析與[5]同樣地進(jìn)行。< 結(jié)果 >圖6所示為使用各抗體時(shí)的CD4+細(xì)胞中的FoxP3蛋白的表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果。此夕卜，圖7所示為使用各抗體時(shí)的⑶4+細(xì)胞、⑶4+⑶25+細(xì)胞、⑶4+⑶25-細(xì)胞中的FoxP3蛋白的表達(dá)水平的測(cè)定結(jié)果。已知TGF-b和IL-10參與FoxP3蛋白的表達(dá)誘導(dǎo)，這里，對(duì)于CD4+細(xì)胞、CD4+CD25+細(xì)胞、⑶4+⑶25-細(xì)胞中的任一種，抗TGF-b抗體和抗IL-10抗體也均抑制F3克隆的培養(yǎng)上清的FoxP3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)能力。例如，通過(guò)給與抗TGF-b抗體(圖中的抗TGF-b (Ant1-TGF-b))，對(duì)于CD4+細(xì)胞，F(xiàn)oxP3蛋白的表達(dá)水平從35.34降至23.43 (圖6)或者從38.39降至30.63 (圖7)，對(duì)于⑶4+⑶25+細(xì)胞，F(xiàn)oxP3蛋白的表達(dá)水平從38.39降至28.86，對(duì)于CD4+CD25-細(xì)胞，F(xiàn)oxP3蛋白的表達(dá)水平從35.66降至28.41。此外，抗IL-10抗體的情況(圖中的抗IL-1O(Ant1-1L-1O))也同樣，分別降至11.42 (圖6)或30.88 (圖7) (CD4+ 細(xì)胞)、29.89 (CD4+CD25+ 細(xì)胞)、28.05 (CD4+CD25-細(xì)胞)。另一方面，給與抗MCPl抗體的情況下(圖中的抗MCPl (Ant1-MCPl))，也分別降至16.27 (圖 6)或 22.89 (圖 7) (CD4+ 細(xì)胞)、22.08 (CD4+CD25+ 細(xì)胞)、19.02 (CD4+CD25-細(xì)胞)，抗TSPl抗體(圖中的抗TSPl (Ant1-TSPl))也同樣，分別降至9.26 (圖6)或21.35(圖7) (CD4+ 細(xì)胞)、27.78 (CD4+CD25+ 細(xì)胞)、16.56 (CD4+CD25-細(xì)胞)。給與抗 FSTLl 抗體的情況下(圖中的抗FSTLl (Ant1-FSTLl))，其效果較弱，但即使如此，也分別降至14.86(圖6)或 34.67 (圖 7) (CD4+細(xì)胞)、29.85 (CD4+CD25+細(xì)胞)、32.64 (CD4+CD25-細(xì)胞)。給與抗IL13Ra2抗體的情況下(圖中的抗IL13Ra2 (Anti_IL13Ra2))，從35.34降至11.86 (圖6)(⑶4+細(xì)胞)。這就表明抗MCPl抗體、抗TSPl抗體、抗FSTLl抗體和抗IL13Ra2抗體抑制培養(yǎng)上清的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)能力`。此外，同時(shí)使用了抗MCPl抗體、抗TSPl抗體、抗FSTLl抗體和抗IL13Ra2抗體，結(jié)果表明⑶4+細(xì)胞中的抑制效果最強(qiáng)(35.34降至8.54)(圖6)，這些細(xì)胞因子均對(duì)F3克隆的培養(yǎng)上清中的FoxP3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)作用作出過(guò)剩(redundant)的貢獻(xiàn)。因此，拮抗MCP1、TSPU FSTLl的功能的物質(zhì)可拮抗表達(dá)Snail的細(xì)胞所具有的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)能力。[8]利用抗IL_13Ra2抗體來(lái)抑制FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)〈目的〉揭示抗IL_13Ra2抗體可拮抗由Bll克隆產(chǎn)生的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)活性< 方法 >除抗體使用抗MCPl抗體和抗IL_13Ra2抗體、腫瘤細(xì)胞使用Bll克隆以外，與[7]同樣地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。這里，使用抗IL-13抗體作為拮抗FoxP3表達(dá)增強(qiáng)活性的陽(yáng)性對(duì)照。< 結(jié)果 >圖8所示為使用抗MCPl抗體和抗IL_13Ra2抗體的結(jié)果。抗MCPl抗體使經(jīng)Bll克隆的培養(yǎng)上清增強(qiáng)的FoxP3蛋白表達(dá)從23.69 (無(wú)抗體；圖中的無(wú)抗體(No mAbs))降至4.69 (給與抗體；圖中的抗MCT (Ant1-MCT))，抗IL_13Ra2抗體使其降至7.60 (給與抗體；圖中的抗IL-13Ra2 (Anti_IL13Ra2))。如上所述，這些抗體可拮抗Bll克隆的培養(yǎng)上清的表達(dá)增強(qiáng)活性。還有，之所以未見(jiàn)抗IL-13Ra2抗體針對(duì)親代細(xì)胞HCT116細(xì)胞的效果，是因?yàn)镠CT116細(xì)胞不表達(dá)Snail。如上所述，不僅是拮抗MCPl的功能的物質(zhì)，拮抗IL13Ra2的功能的物質(zhì)也可拮抗表達(dá)Snail的細(xì)胞所具有的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)能力。[9]利用抗MCPl抗體和抗IL_13Ra2抗體來(lái)抑制小鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)〈目的〉揭示抗MCPl抗體和抗IL_13Ra2抗體拮抗小鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)活性。〈方法〉(I)脾臟細(xì)胞的制備方法作為免疫細(xì)胞，用小鼠脾臟細(xì)胞代替成團(tuán)PBMC。首先，從小鼠體內(nèi)取出脾臟，勻漿后與成團(tuán)PBMC同樣地用菲可分離細(xì)胞懸浮液，使用位于中間層的細(xì)胞組分。⑵其它基本上與人培養(yǎng)細(xì)胞同樣地進(jìn)行，但對(duì)于人細(xì)胞，共培養(yǎng)或培養(yǎng)上清存在下的培養(yǎng)進(jìn)行3 4天，而對(duì)于小鼠黑色素瘤，共培養(yǎng)或培養(yǎng)上清存在下的培養(yǎng)進(jìn)行5 6天?！唇Y(jié)果〉

圖9(上部)所示為使用抗MCPl抗體、抗TSPl抗體和抗IL_13Ra2抗體的結(jié)果。作為陰性對(duì)照，采用小鼠IgG，作為陽(yáng)性對(duì)照，采用抗TGF-b抗體和抗IL-10抗體。用抗TSPl抗體未能抑制小鼠黑色素瘤B16-F10的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用，但如圖所示，抗MCPl抗體和抗IL-13Ra2抗體抑制了 28 45%左右的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用。如上所述，F(xiàn)oxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用的抑制不僅在人腫瘤細(xì)胞中可見(jiàn)其效果，在小鼠腫瘤細(xì)胞中也可見(jiàn)其效果。[101MCPU TSPU FSTLl或分泌型IL_13Ra2各細(xì)胞因子的FoxP3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)作用〈目的〉揭示MCP1、TSP1、FSTL1或分泌型IL_13Ra2各細(xì)胞因子使CD4+細(xì)胞的FoxP3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)。< 方法 >除使用以Ing/mL的濃度添加有各細(xì)胞因子的培養(yǎng)基代替培養(yǎng)上清以外，與[5]同樣地進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。作為陽(yáng)性對(duì)照，采用Panc-1細(xì)胞和F3克隆的培養(yǎng)上清、TGF-b和IL-10細(xì)胞因子。各細(xì)胞因子使用市售的細(xì)胞因子(MCP1:安迪公司#279-MC，TSPl:安迪公司#3074-TH, FSTLl:安迪公司 #669_F0，分泌型 IL_13Ra2:艾碧康公司 #ab46112，TGF_b:安迪公司#100-B，IL-10:電子生命科學(xué)公司#34-8109)。< 結(jié)果 >圖10所示為FoxP3蛋白的表達(dá)的測(cè)定結(jié)果。與未添加任何物質(zhì)的培養(yǎng)基(圖中用培養(yǎng)基(Medium)表示；表達(dá)水平為2.55)相t匕，MCPl蛋白(表達(dá)水平為17.35)、TSPl蛋白(表達(dá)水平為18.40)、FSTLl蛋白(表達(dá)水平為16.00)、分泌型IL-13Ra2蛋白(表達(dá)水平為20.21)均顯示出與F3克隆的培養(yǎng)上清(表達(dá)水平為17.08)相同程度的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用。如上所述，MCP1、TSP1、FSTL1和分泌型IL_13Ra2各細(xì)胞因子可用作FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)劑。[11]由表達(dá)Snail的細(xì)胞產(chǎn)生的FoxP3蛋白的直接表達(dá)增強(qiáng)作用和間接表達(dá)增強(qiáng)作用〈目的〉揭示由表達(dá)Snail的細(xì)胞產(chǎn)生的FoxP3蛋白的表達(dá)增強(qiáng)作用包括直接作用和間接作用，間接作用中至少有樹(shù)突狀細(xì)胞參與。< 方法 >作為免疫細(xì)胞，用分離的CD4+細(xì)胞代替成團(tuán)PBMC，在(I)在單獨(dú)的CD4+細(xì)胞中加入F3細(xì)胞的情況、⑵在⑶4+細(xì)胞+樹(shù)突狀細(xì)胞(DC)中加入F3細(xì)胞的情況、(3)在⑶4+細(xì)胞+其它細(xì)胞(其它(others) =從成團(tuán)PBMC中除去CD4+細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞后留下的細(xì)胞)中加入F3細(xì)胞的情況、⑷在單獨(dú)的CD4+細(xì)胞中加入F3細(xì)胞培養(yǎng)上清的情況、(5)在單獨(dú)的CD4+細(xì)胞中加入F3細(xì)胞/DC的共培養(yǎng)上清的情況、(6)在單獨(dú)的CD4+細(xì)胞中加入F3細(xì)胞/其它細(xì)胞的共培養(yǎng)上清的情況、(7)在單獨(dú)的CD4+細(xì)胞中加入F3細(xì)胞/DC/其它細(xì)胞的共培養(yǎng)上清的情況下，分別考察CD4+細(xì)胞中的FoxP3蛋白的表達(dá)水平。⑶4+細(xì)胞和⑶I Ic+細(xì)胞(樹(shù)突狀細(xì)胞)通過(guò)與⑵相同的方法用MACS抗體(美天旎生物技術(shù)公司)從成團(tuán)PBMC中分離。其它實(shí)驗(yàn)方法也如上所述。< 結(jié)果 >
圖11所示為FoxP3蛋白的表達(dá)的測(cè)定結(jié)果。圖中，中部所示為添加有細(xì)胞時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，下部所示為添加有培養(yǎng)上清時(shí)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。如果將成團(tuán)PBMC換成單獨(dú)的⑶4+細(xì)胞并加入F3細(xì)胞，則FoxP3蛋白表達(dá)水平下降(成團(tuán)+F3細(xì)胞為35.34、⑶4+F3細(xì)胞為10.93)。如果向其中加入DC或其它細(xì)胞，則FoxP3蛋白表達(dá)水平上升(⑶4+DC+F3細(xì)胞為25.72、⑶4+其它+F3細(xì)胞為16.15)，這就表示成團(tuán)PBMC細(xì)胞內(nèi)的CD4+細(xì)胞中的FoxP3蛋白表達(dá)水平的上升有CD4+細(xì)胞以外的細(xì)胞(DC或DC以外的細(xì)胞)參與。但是，如果在單獨(dú)的⑶4+細(xì)胞中加入F3細(xì)胞(⑶4+F3為10.93)，則與不對(duì)成團(tuán)PBMC進(jìn)行任何刺激的情況(成團(tuán)(無(wú)刺激(no stim))為2.55)相比，F(xiàn)oxP3蛋白表達(dá)水平上升，這就表示也存在F3細(xì)胞或其培養(yǎng)上清中的體液因子直接作用于CD4+細(xì)胞的機(jī)制。此外，將添加細(xì)胞的情況與添加上清的情況進(jìn)行比較時(shí)，添加細(xì)胞的情況下FoxP3蛋白表達(dá)水平都要高2倍左右。例如，⑶4+F3細(xì)胞為10.93，相對(duì)地⑶4+F3上清為5.48 ；CD4+DC+F3 細(xì)胞為 25.72，相對(duì)地 CD4+ 上清(Tu+DC)為 14.98 ;CD4+ 其它 +F3 細(xì)胞為 16.15，相對(duì)地⑶4+上清(Tu+其它)為6.37。因此可以認(rèn)為，不僅體液因子的作用對(duì)FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)有貢獻(xiàn)，細(xì)胞間的直接的相互作用也對(duì)FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)有貢獻(xiàn)。[12]利用snail基因強(qiáng)制表達(dá)克隆的細(xì)胞上清來(lái)誘導(dǎo)⑶8+細(xì)胞中的FoxP3表達(dá)〈目的〉揭示與⑶4+細(xì)胞同樣，利用snail基因強(qiáng)制表達(dá)克隆F3的細(xì)胞上清也能誘導(dǎo)⑶8+細(xì)胞中的FoxP3蛋白表達(dá)。< 方法 >除將作為對(duì)象的細(xì)胞從CD4+細(xì)胞換成CD8+細(xì)胞以外，通過(guò)與[5]相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。< 結(jié)果 >圖12所示為FoxP3蛋白的表達(dá)的測(cè)定結(jié)果。與CD4+細(xì)胞所得的結(jié)果同樣，與未添加腫瘤細(xì)胞的上清的情況(圖中的無(wú)腫瘤)相比，在親細(xì)胞株P(guān)anc-1的細(xì)胞上清(圖中的親代(Snail-))中，F(xiàn)oxP3蛋白表達(dá)僅有少量上升，但如果添加F3的細(xì)胞上清(圖中的F3(Snail+))，則在⑶8+細(xì)胞中也可見(jiàn)FoxP3蛋白表達(dá)的增強(qiáng)。如上所述，表達(dá)Snail的細(xì)胞的培養(yǎng)上清也能使⑶8+細(xì)胞的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)。[13]利用抗TSPl抗體和抗IL_13Ra2抗體來(lái)抑制CD8+細(xì)胞的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)〈目的〉揭示與⑶4+細(xì)胞同樣，利用抗TSPl抗體和抗IL_13Ra2抗體也能抑制⑶8+細(xì)胞中的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)。< 方法 >
除將作為對(duì)象的細(xì)胞從CD4+細(xì)胞換成CD8+細(xì)胞以外，通過(guò)與[7]相同的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。還有，對(duì)F3細(xì)胞使用抗MCPl抗體和抗TSPl抗體，對(duì)BI I細(xì)胞使用抗IL_13Ra2抗體。使用小鼠IgG抗體作為陰性對(duì)照進(jìn)行同樣的實(shí)驗(yàn)。< 結(jié)果 >圖13所示為對(duì)F3細(xì)胞使用抗MCPl抗體和抗TSPl抗體的情況下的FoxP3蛋白的表達(dá)的測(cè)定結(jié)果，圖14所示為對(duì)Bll細(xì)胞使用抗IL-13Ra2抗體的情況下的FoxP3蛋白的表達(dá)的測(cè)定結(jié)果。使用抗MCPl抗體(圖13 ;僅用培養(yǎng)上清(mlgG)時(shí)為14.71、用抗MCPl抗體(抗MCP1)時(shí)為11.97)、抗TSPl抗體(圖13 ;僅用培養(yǎng)上清(mlgG)時(shí)為14.71、用抗TSPl抗體(抗TSP1)時(shí)為5.28)和抗IL-13Ra2抗體(圖14;用Bll培養(yǎng)上清(無(wú)抗體)時(shí)為14.87、用抗IL-13Ra2抗體(抗IL_13Ra2)時(shí)為10.21)的情況下，由培養(yǎng)細(xì)胞上清產(chǎn)生的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用受到了拮抗。這就表明對(duì)于由培養(yǎng)細(xì)胞上清產(chǎn)生的FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用，至少M(fèi)CPl、TSPl和IL-13Ra2是主要的原因分子。如上所述，對(duì)于CD8+細(xì)胞，至少M(fèi)CPUTSP1和IL_13Ra2也具有FoxP3蛋白表達(dá)增強(qiáng)作用。[14]利用抗MCPl抗體和抗TSPl抗體來(lái)抑制表達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞的增殖〈目的〉揭示如果對(duì)表達(dá)snail基因的腫瘤細(xì)胞添加抗MCPl抗體和抗TSPl抗體，則可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖。< 方法 >(I)細(xì)胞增殖測(cè)定方法
以2 μ g/mL的濃度在Panc-1細(xì)胞和F3細(xì)胞的培養(yǎng)基中添加抗MCPl抗體、抗TSPl抗體或作為對(duì)照的抗TGF-b抗體，培養(yǎng)3天后，加入1/10量的PremixWST-1溶液(寶生物公司)，再培養(yǎng)24小時(shí)，然后用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度(450-655nm)，將其數(shù)值作為T(mén)細(xì)胞的增殖量。測(cè)定結(jié)果還表示了將對(duì)照mlgG所得的值設(shè)為100%時(shí)的增殖拮抗率。< 結(jié)果 >結(jié)果示于圖15。對(duì)于 Panc-1 細(xì)胞(圖中的親代-snail (-) (Parent-snail (-)))和F3細(xì)胞(圖中的F3-snail (+))這兩者，抗MCPl抗體和抗TSPl抗體都能將增殖拮抗至34% 77%。 如上所述，通過(guò)拮抗MCPl或TSPl的功能，可降低腫瘤細(xì)胞的增殖能力。[15]利用抗MCPl抗體和抗FSTLl抗體來(lái)抑制表達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)〈目的〉揭示如果對(duì)表達(dá)snail基因的腫瘤細(xì)胞添加抗MCPl抗體和抗FSTLl抗體，則可抑制腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)。< 方法 >將5X IO4個(gè)F3細(xì)胞加入至用matrigel涂膜的Transwell小室(孔徑8ym,BD生命科學(xué)公司)的上層，培養(yǎng)過(guò)夜(37°C，5% CO2) 0以Iy g/mL的濃度在上層和下層中添加抗MCPl抗體或抗FSTLl抗體進(jìn)行培養(yǎng)。將膜上的細(xì)胞完全除去后，用結(jié)晶紫溶液對(duì)浸潤(rùn)至下層的細(xì)胞進(jìn)行固定和染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)，從而測(cè)定細(xì)胞浸潤(rùn)能力。也示出了將陰性對(duì)照(mlgG)所得的結(jié)果設(shè)為100%時(shí)的浸潤(rùn)細(xì)胞的個(gè)數(shù)的比例。還有，作為陽(yáng)性對(duì)照，采用抗IL-10抗體和抗TGF-b抗體。< 結(jié)果 >細(xì)胞浸潤(rùn)能力的測(cè)定結(jié)果示于圖16。與親株P(guān)anc-1細(xì)胞(圖中用親代表示)相比，F(xiàn)3細(xì)胞(圖中用mlgG表示)的細(xì)胞浸潤(rùn)能力增強(qiáng)。對(duì)該F3細(xì)胞給與抗TSPl抗體的情況下，細(xì)胞的浸潤(rùn)能力無(wú)變化，但在使用抗MCPl抗體或抗FSTLl抗體時(shí)，細(xì)胞的浸潤(rùn)能力降至約45%。如上所述，抗MCPl抗體和抗FSTLl抗體具有降低表達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞浸潤(rùn)能力的作用。[16]通過(guò)白血病細(xì)胞中的snail表達(dá)抑制來(lái)抑制浸潤(rùn)〈目的〉揭示白血病細(xì)胞中，通過(guò)抑制Snail表達(dá)，可降低白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)能力。< 方法 >首先，通過(guò)RT-PCR 來(lái)考察白血病細(xì)胞株(Molt-3、Molt_4、UFl、KTl、K562、MC3)中的Snail、MCPl、FSTLl的表達(dá)。方法如[I] [2] [6]所述，但對(duì)于MCP1，使用具有以下序列的引物。正向5’ -GTGTTTGACATCTTTGAACTC-3’ (序列編號(hào) 13)反向5’ -CCAAAGACAAACCTCACATTC-3’ (序列編號(hào) 14)接著，使用6孔板，在白血病細(xì)胞株(Molt-4、EL4、Daudi, KTl)的培養(yǎng)基中分別添加與[2] (I)中使用的s iRNA相同的snial基因特異性s iRNA或siRNA對(duì)照進(jìn)行培養(yǎng)(2 μ g/1 X IO6 個(gè) /2mL ,英杰公司)。培養(yǎng)2天后，用涂有matrigel的Transwell小室(孔徑8 μ m,BD生命科學(xué)公司)培養(yǎng)4小時(shí)，計(jì)數(shù)浸潤(rùn)至濾器的細(xì)胞。
< 結(jié)果 >根據(jù)圖17A所示的RT-PCR的結(jié)果，在考察的范圍內(nèi)，所有的白血病細(xì)胞株中均檢測(cè)到Snail的高表達(dá)。此外，圖17B所示為對(duì)各白血病細(xì)胞株進(jìn)行測(cè)定而得的浸潤(rùn)細(xì)胞數(shù)。在各白血病細(xì)胞株中，與未經(jīng)對(duì)snail基因具有特異性的siRNA處理的白血病細(xì)胞(圖中的無(wú)或?qū)φ?Control))相比，用snail基因特異性siRNA進(jìn)行處理的情況下，浸潤(rùn)能力均受到顯著抑制(P〈0.001 0.05)。如上所述，在白血病細(xì)胞中，通過(guò)抑制Snail表達(dá)，可降低白血病細(xì)胞的浸潤(rùn)能力。因此，抑制Snail的功能的物質(zhì)作為抗白血病藥物有用。[17]通過(guò)拮抗表達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞所生成的中間蛋白的作用來(lái)抑制腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的腫瘤免疫抑制〈目的〉揭示腫瘤細(xì)胞被吞噬細(xì)胞吞噬而被消化排除，但表達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞拮抗該吞噬作用，而且針對(duì)MCPl蛋白、IL-13Ra2蛋白、IL-13蛋白、IL-4蛋白、CCR2蛋白、IL-10蛋白的抗體抑制表達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的吞噬拮抗作用?！此每贵w〉抗MCPl抗體:BD制藥公司、抗CCR2抗體:艾碧康公司、抗IL-13抗體:艾碧康公司、抗IL-13Ra2抗體:安迪公司、抗IL-4抗體:BD生命科學(xué)公司、抗IL-10抗體:安迪公司< 方法 >將人結(jié)腸癌HCT116細(xì)胞或強(qiáng)制表達(dá)snail基因的Bll克隆與人PBMC在各抗體(I μ g/mL)的存在下共培養(yǎng)3天使其接觸，將該P(yáng)BMC用PKH26紅色熒光標(biāo)記。以1:1的比例在該P(yáng)BMC中加入用CSFE綠色熒光標(biāo)記的HCT116細(xì)胞，37°C培養(yǎng)2小時(shí)后，用流式細(xì)胞儀(FCM)分析同時(shí)被紅色和綠色兩種熒光標(biāo)記的細(xì)胞(即吞噬了癌細(xì)胞的PBMC中的細(xì)胞)的比例。還有，為了觀察自然發(fā)生的吞噬(背景)，在低溫(4°C)下培養(yǎng)2小時(shí)。< 結(jié)果 >經(jīng)不表達(dá)snail基因的HCT116細(xì)胞處理的PBMC(圖18中的經(jīng)模擬物處理的PBMC (Mock-treated PBMCs))中，約25%的細(xì)胞同時(shí)被兩種熒光標(biāo)記。但是，經(jīng)Bll克隆處理的PBMC (圖18中的經(jīng)Bll處理的PBMC(Bll-treated PBMCs))中，僅約10%的細(xì)胞同時(shí)被兩種熒光標(biāo)記。如上所述，表達(dá)Snail的腫瘤細(xì)胞具有抑制PBMC所包含的吞噬細(xì)胞的作用的功能。但是，如果在PBMC與Bll克隆接觸時(shí)預(yù)先添加各抗體，則同時(shí)被兩種熒光標(biāo)記的細(xì)胞的比例上升至15 % 35 %，因與表達(dá)Snai I的腫瘤細(xì)胞接觸而導(dǎo)致的同時(shí)被兩種熒光標(biāo)記的細(xì)胞的比例的下降被拮抗。如上所述，通過(guò)拮抗腫瘤免疫抑制中間蛋白的功能，可解除腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的腫瘤免疫抑制，激活腫瘤免疫。[18]利用對(duì)snail基因或MCPl基因具有特異性的siRNA的體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)

〈目的〉揭示通過(guò) 在體內(nèi)抑制Snail蛋白的功能或MCPl信號(hào)，可解除腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的腫瘤免疫抑制?！捶椒ā?br> 對(duì)于小鼠黑色素瘤B16-F10，與[I]同樣地制作強(qiáng)制表達(dá)snail基因的細(xì)胞(H6-snail+)，移植至C57BL/6N小鼠(在I只個(gè)體內(nèi)同時(shí)進(jìn)行I X IO6個(gè)的皮下接種和2 X IO5個(gè)的靜脈內(nèi)接種)。7天后,用PEI (多轉(zhuǎn)染公司(PolyplusTransfection社))將形成脂質(zhì)復(fù)合體的對(duì)Snail或MCPl基因具有特異性的siRNA或?qū)φ誷iRNA(5 μ g/只，英杰公司)分別注入該皮下移植的腫瘤內(nèi)。小鼠snail基因特異性siRNA的序列:正義5’ -GGAAGAUCUUCAACUGCAA-3’ (序列編號(hào) 15)反義5’ -UUGCAGUUGAAGAUCUUCC-3’ (序列編號(hào) 16)小鼠MCPl基因特異性siRNA的序列:正義5’ -CCAGCAAGAUGAUCCCAAU-3’ (序列編號(hào) 17)反義5’ -AUUGGGAUCAUCUUGCUGG-3’ (序列編號(hào) 18)
小鼠siRNA用對(duì)照的序列:正義5’ -CCAGAAGUACUACCGCAAU-3’ (序列編號(hào) 19)反義 5，-AUUGCGGUAGUACUUCUGG-3’ (序列編號(hào) 20)I周后，從移植小鼠體內(nèi)摘出腫瘤和肺，測(cè)定腫瘤體積和肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)，用流式細(xì)胞儀FACScan對(duì)腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞進(jìn)行分析。將實(shí)體瘤在培養(yǎng)液內(nèi)勻漿后采集腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞，與針對(duì)小鼠抗原的各種抗體(抗CD4抗體、抗CD8抗體、抗CDllc抗體和抗I_A(b)抗體是BD制藥公司的產(chǎn)品、抗FoxP3抗體是電子生命科學(xué)公司的產(chǎn)品)或H-2K(b)約束性gp70四聚體(肽序列:KSPWFTTL，MBL公司、序列編號(hào)21)于4V反應(yīng)I小時(shí)后進(jìn)行分析?！唇Y(jié)果〉圖19所示為測(cè)得的腫瘤體積(A)、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)(B)和腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析(C)的結(jié)果。如圖19A和圖19B所示，移植了 B16-F10的小鼠(圖中的模擬物)中，腫瘤的增殖顯著，而向肺的轉(zhuǎn)移少。相對(duì)地,移植了 H6-snail+的小鼠(圖中的Cont)中，腫瘤的增殖程度不如模擬物，而向肺的轉(zhuǎn)移得到顯著促進(jìn)。但是，如果注入對(duì)snail基因或MCPl基因具有特異性的s iRNA(圖中分別為Snail和MCP1)，細(xì)胞增殖和向肺的轉(zhuǎn)移均受到抑制。此外，如圖19C所示，與B16-F10 (圖中的模擬物)相比，強(qiáng)制表達(dá)snail基因的H6-snail +中，浸潤(rùn)至腫瘤內(nèi)的細(xì)胞數(shù)顯著減少，而如果注入對(duì)snail基因或MCPl基因具有特異性的siRNA，則浸潤(rùn)至腫瘤內(nèi)的細(xì)胞數(shù)增加至多于B16-F10。如上所述，通過(guò)利用對(duì)snail基因或MCPl基因具有特異性的siRNA在體內(nèi)抑制Snail蛋白的功能或MCPl信號(hào)，可解除腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的腫瘤免疫抑制，產(chǎn)生抑制腫瘤體積增加、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、增強(qiáng)向腫瘤內(nèi)的細(xì)胞浸潤(rùn)等抗腫瘤效果。[19]利用抗TSPl抗體的體內(nèi)治療實(shí)驗(yàn)〈目的〉揭示通過(guò)在體內(nèi)抑制TSPl蛋白的功能，可解除腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的腫瘤免疫抑制?！捶椒ā祵X IO6個(gè)小鼠黑色素瘤B16-F10和H6_snail+皮下接種于C57BL/6N小鼠，7天后向該皮下接種腫瘤內(nèi)注入抗TSPl抗體(5 μ g/只、卡爾生物化學(xué)公司(Calbi ochem社))，I周后進(jìn)行以下測(cè)定。(I)測(cè)定腫瘤體積。(2)為檢測(cè)出各臟器(LG肺；SP脾臟；PB外周血；BM骨髄)中的腫瘤細(xì)胞的微量轉(zhuǎn)移，通過(guò)RT-PCR考察B16-F10細(xì)胞特異性表達(dá)的癌抗原gplOO的基因表達(dá)。還有，除使用下述引物以外，與[I]同樣地進(jìn)行RT-PCR。對(duì)gp 100具有特異性的弓丨物序列:正向5’ -ACAGCCAGTGTATCCACAGG-3’ (序列編號(hào) 22)反向5’ -ACTTCCATTGTGTGTGTGCC-3’ (序列編號(hào) 23)對(duì)作為對(duì)照的GAPDH具有特異性的引物序列:正向5’ -TTGACCTCAACTACATGGTCTA-3’ (序列編號(hào) 24)反向5’ -ACCAGTAGACTCCACGACATAC-3’ (序列編號(hào) 25)(3)與[18]同樣地用流式細(xì)胞儀FACScan分析腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞。< 結(jié)果 >圖20所示為測(cè)得的腫瘤體積(A)、肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)數(shù)(B)和腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)細(xì)胞的流式細(xì)胞儀分析(C)的結(jié)果。(I)如圖20A所示，不論是在移植B16-F10的情況下(圖中的模擬物)還是在移植H6-snail+的情況下(圖中的H6_snail+`)，通過(guò)給與抗TSPl抗體(圖中的抗TSP1)，腫瘤體積顯著減少。(2)如圖20B所示，移植H6_snail+、給與小鼠IgG作為抗體的對(duì)照的情況下(圖中的H6+對(duì)照mlgG (H6+Control mlgG))，與移植B16-F10的情況(圖中的模擬物)相比，各組織中檢測(cè)出高水平的gplOO表達(dá)，腫瘤轉(zhuǎn)移得到促進(jìn)，而通過(guò)給與抗TSPl抗體(圖中的H6+抗TSPl (H6+Ant1-TSPl))，各組織中g(shù)plOO表達(dá)降低，向組織的轉(zhuǎn)移被顯著抑制。(3)如圖20C所示，與B16_F10(圖中的模擬物；mIgG)相比，強(qiáng)制表達(dá)snail基因的H6-snail+(圖中的H6-snail+;mIgG)中，向腫瘤細(xì)胞內(nèi)浸潤(rùn)的細(xì)胞數(shù)顯著減少，而通過(guò)給與抗TSPl抗體(圖中的H6+抗TSP1)，向腫瘤內(nèi)浸潤(rùn)的細(xì)胞數(shù)增加至多于B16-F10 (圖中的模擬物；mIgG)。如上所述，通過(guò)利用抗TSPl抗體來(lái)拮抗TSPl的作用，可解除腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的腫瘤免疫抑制，產(chǎn)生抑制腫瘤體積增加、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、增強(qiáng)向腫瘤內(nèi)的細(xì)胞浸潤(rùn)等抗腫瘤效
果O產(chǎn)業(yè)上利用的可能性通過(guò)本發(fā)明，可提供增強(qiáng)細(xì)胞中的FoxP3基因表達(dá)的基因表達(dá)增強(qiáng)方法、將細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞分化誘導(dǎo)的細(xì)胞分化誘導(dǎo)劑、由它們的作用來(lái)抑制免疫的免疫抑制劑和過(guò)度免疫疾病治療劑、拮抗細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)增強(qiáng)的基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑、拮抗細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化誘導(dǎo)的細(xì)胞分化誘導(dǎo)拮抗劑、由它們的作用來(lái)解除免疫抑制的免疫抑制解除劑、腫瘤免疫激活劑及抗腫瘤劑等。
權(quán)利要求
1.一種抑制細(xì)胞的FSTLl蛋白的功能的物質(zhì)在制備基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑中的應(yīng)用，該基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑拮抗細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)增強(qiáng)。
2.如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述物質(zhì)為具有FSTLl蛋白拮抗活性的抗FSTLl抗體。
3.如權(quán)利要求1或2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述劑拮抗細(xì)胞向調(diào)節(jié)T細(xì)胞的分化誘導(dǎo)。
4.如權(quán)利要求3所 述的應(yīng)用，其特征在于，所述劑解除免疫抑制。
5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，所述劑激活腫瘤免疫。
6.如權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述劑治療腫瘤。
全文摘要
本發(fā)明涉及腫瘤細(xì)胞所導(dǎo)致的免疫抑制的解除劑及使用該解除劑的抗腫瘤劑，提供一種抑制細(xì)胞的FSTL1蛋白的功能的物質(zhì)在制備基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑中的應(yīng)用，該基因表達(dá)增強(qiáng)拮抗劑拮抗細(xì)胞中的FoxP3基因的表達(dá)增強(qiáng)。
文檔編號(hào)A61P35/00GK103223165SQ20121040885
公開(kāi)日2013年7月31日 申請(qǐng)日期2008年8月22日 優(yōu)先權(quán)日2007年8月24日
發(fā)明者工藤千惠, 河上裕 申請(qǐng)人:學(xué)校法人慶應(yīng)義塾