基于CyPA和Gag的DNA疫苗的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及基于CyPA和Gag的DNA疫苗，其包含編碼CyPA的多核苷酸和編碼HIV的Gag蛋白的多核苷酸，其中所述DNA疫苗在接種于人類對象后允許在所述對象中表達所述CyPA和Gag蛋白，并由此引發(fā)Gag-特異性的抗HIV免疫應答。本發(fā)明還涉及使用所述DNA疫苗在人類對象中預防或治療HIV感染的方法。
【專利說明】基于CyPA和Gag的DNA疫苗
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及HIV感染的治療和預防。具體而言，本發(fā)明涉及一種DNA疫苗，其包含編碼CyPA的多核苷酸和編碼HIV的Gag蛋白的多核苷酸，其中所述DNA疫苗在接種于人類對象后允許在所述對象中表達所述CyPA和Gag蛋白或其片段，并由此引發(fā)Gag-特異性的抗HIV免疫應答。本發(fā)明還涉及使用所述DNA疫苗在人類對象中預防或治療HIV感染的方法。
【背景技術】
[0002]DNA疫苗問世已有二十多年，盡管其具有安全性高、構建周期短、能誘導一定強度特異性免疫應答尤其是T細胞應答等優(yōu)勢，但其仍然有投送效率低和免疫原性弱的巨大瓶頸。利用佐劑來提高DNA疫苗的免疫原性是有效途徑之一。針對DNA疫苗這一特殊的疫苗形式，篩選一些在DNA疫苗中能夠發(fā)揮佐劑效應的基因對于DNA疫苗的研發(fā)重大具有意義?，F(xiàn)行臨床試驗研究顯示，HIV-1 Gag DNA疫苗誘導的特異性免疫應答較弱，通過改良疫苗載體及投送途徑均不能有效引發(fā)針對Gag的細胞免疫應答，因此需要新的Gag特異性的基因佐劑以增強其免疫應答強度。
[0003]研究顯示在人體細胞組成型表達的肽基脯氨酸順反異構酶親環(huán)素A(CyclophilinA, CyPA)與HIV-1 Gag蛋白的片段P24的N末端存在特異性相互作用，并使得CyPA這種胞衆(zhòng)宿主蛋白特異性的摻入到病毒顆粒中(Franke EK, Yuan HE, Luban J.Specificincorporation of cyclophilin A into HIV-lvirions.Nature 1994;372:359-62;Thali M, Bukovsky A, Kondo E, Rosenwirth B, Walsh CT, Sodroski J,et al.Functionalassociation of cyclophilin A with HIV-1 virions.Nature 1994;372:363-5)。并證實，這種特異性的相互作用顯著影響病毒的復制能力(Braaten D7Luban J.Cyclophilin Aregulates HIV-linfectivity,as demonstrated by gene targeting in human T cells.The EMBO journal 2001 ；20:1300-9)以及引發(fā)的宿主針對HIV-1病毒的天然免疫應答(Manel N, Hogstad B, Wang Y, Levy DE, Unutmaz D, Littman DR.A cryptic sensor forHIV-1 activates antiviral innate immunity in dendritic cells.Nature2010 ；467:214-7)。

【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明基于以下發(fā)現(xiàn)，即與僅表達HIV Gag蛋白的DNA構建體相比，同時表達CyPA蛋白和HIV Gag蛋白的DNA構建體在接種于對象后能夠引發(fā)增強的針對Gag的特異性免疫應答。
[0005]因此，本發(fā)明提供一種DNA疫苗，其包含免疫學有效量的編碼CyPA的第一多核苷酸和編碼HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸分別可操縱地連接于啟動子，且所述DNA疫苗在接種于人類對象后允許在所述對象中表達所述CyPA和Gag蛋白或所述片段，并由此引發(fā)Gag-特異性的抗HIV免疫應答。[0006]在本發(fā)明的DNA疫苗中，所述第一多核苷酸編碼的CyPA包含與SEQ ID NO:1具有至少70%相同性的氨基酸序列。優(yōu)選地，所述CyPA包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。
[0007]在本發(fā)明的DNA疫苗中，所述第二多核苷酸編碼的Gag蛋白來自HIV-1或HIV-2。所述 HIV-1 包括但不限于以下亞型:A、B、C、D、F、G、H、J、K、CRF01_AE、CRF02_AG、CRF03_AB、CRF04_cpx、CRF05_DF、CRF06_cpx、CRF07_BC、CRF08_BC、CRF09_cpx、CRF10_CD、CRFl 1_cpx、CRF12_BF、CRF13_cpx、CRF14_BG、CRF15_01B、CRF16_A2D、CRF17_BF、CRF18_cpx、CRF19_cpx、CRF20_BG、CRF21_A2D、CRF22_0IAl、CRF23_BG、CRF24_BG、CRF25_cpx、CRF26_AU、CRF27_cpx、CRF28_BF、CRF29_BF、CRF30_0206、CRF31_BC、CRF32_06A1、CRF33_01B、CRF34_01B、CRF35_AD、CRF36_cpx、CRF37_cpx、CRF38_BF、CRF39_BF、CRF40_BF、CRF41_CD、CRF42_BF、CRF43_02G、CRF44_BF、CRF45_cpx、CRF46_BF、CRF47_BF、CRF48_01B、CRF49_cpx、CRF50_A1D、0^51_0川、0^52_018、0^53_018和0^54_018。在一些實施方式中，所述第二多核苷酸編碼完整的HIV Gag蛋白。所述Gag蛋白包含與SEQ ID NO: 10具有至少80%相同性的氨基酸序列。在一個具體的實施方式中，所述Gag蛋白包含SEQ ID NO: 11所示的氨基酸序列。在另一些實施方式中，所述第二多核苷酸編碼HIV Gag的免疫原性片段，例如，包含SEQ IDNO:12所示的氨基酸序列的Gag蛋白的免疫原性片段。
[0008]在一些實施方式中，本發(fā)明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸和第二多核苷酸由同一表達載體攜帶，優(yōu)選地，所述編碼CyPA的第一多核苷酸與編碼HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸被分別表達。在另外一些實施方式中，本發(fā)明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸與第二多核苷酸由不同表達載體攜帶。優(yōu)選地，本發(fā)明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸與第二多核苷酸的比例是大約1: 10至大約10: I。更加優(yōu)選地，所述第一多核苷酸與第二多核苷酸的比例是大約1:1。
[0009]本發(fā)明還提供在人類對象中預防或治療HIV感染的方法，其包括給所述對象施用如上所述的本發(fā)明的DNA疫苗，由此在所述對象中引發(fā)Gag-特異性的抗HIV免疫應答。優(yōu)選地，給所述對象施用兩次或更多次本發(fā)明的DNA疫苗，兩次施用的間隔為2至4周。優(yōu)選地，給所述對象施用3次本發(fā)明的DNA疫苗?？赏ㄟ^選自肌肉注射、皮下注射、皮內注射、靜脈注射、淋巴管注射和粘膜免疫的一或`多種途徑給所述對象施用本發(fā)明的DNA疫苗。優(yōu)選地，本發(fā)明的DNA疫苗在對象中引發(fā)Gag-特異性的抗HIV細胞免疫應答。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1 為 PDRVI4.0-Homo CyPA 質粒的圖譜。
[0011]圖2 為 pDRVI4.0-gag/Homo CyPA 質粒圖譜。
[0012]圖3顯示CyPA對HIV-1 Env和Gag誘導的特異性免疫應答具有不同的影響。
[0013]圖4顯示小鼠和人的CyPA增強了 Gag誘導的特異性細胞免疫應答，但對Gag誘導的特異性體液免疫應答無顯著性影響。
[0014]圖5顯示CyPA與Gag聯(lián)合使用擴大了 DNA疫苗引發(fā)的針對Gag抗原的T細胞免疫應答譜。
[0015]生物材料保藏
[0016]含有pDRVI4.0 質粒的大腸埃希氏菌(Escherichia coli)DH5 a (pDRVI4.0)已于2012年9月5日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC，北京市朝陽區(qū)北辰西路I號院3號，中國科學院微生物研究所)，保藏號CGMCC N0.6514。
[0017]發(fā)明詳述
[0018]除非另有說明，否則本說明書中所使用的科學及技術術語應具有本領域普通技術人員通常所了解的含義。通常，本說明書中所使用的與細胞及組織培養(yǎng)、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學及蛋白質與核酸化學有關的命名及其技術是本領域公知和常用的。
[0019]除非另有說明，否則本說明書中所使用的方法及技術一般根據(jù)本領域公知的和常規(guī)的方法和本說明書中所闡述的或引用的各種參考文獻中所述的方式來進行。例如參見 Sambrook J.及 Russell D.Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第 3 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2000) ；Ausubel 等人，Short Protocols in Molecular Biology:A Compendium of Methods from CurrentProtocols in Molecular Biology,Wiley,John & Sons,Inc.(2002) ;Harlow及Lane UsingAntibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold SpringHarbor, N.Y.(1998);及Coligan 等人,Short Protocols in Protein Science, Wiley, John& Sons, Inc.(2003)。
[0020]在本說明書及權利要求書中，“包含”一詞應理解為既可表示僅包括所 述的元件或元件的組，也可表示在所述的元件或元件的組的基礎上不排除任何其它元件或元件的組。除非另有說明，否則當本說明書使用術語“一”、“一個”或“一種”時，其意味著“至少一個(種)”或“一或多個(種)”。
[0021]本說明書中所引用的所有出版物、專利及專利申請均以全文引用的方式并入本說明書中。
[0022]本發(fā)明提供一種DNA疫苗，其包含免疫學有效量的編碼CyPA的第一多核苷酸和編碼HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸分別可操縱地連接于啟動子，且所述DNA疫苗在接種于人類對象后允許在所述對象中表達所述CyPA和Gag蛋白或所述片段，并由此引發(fā)Gag-特異性的抗HIV免疫應答。
[0023]在本說明書中，術語“疫苗”是指被施用于動物體以產(chǎn)生或者增強針對特定疾病的免疫力的組合物。術語“DNA疫苗”，也稱“核酸疫苗”或“基因疫苗”，是指包含編碼免疫原或與免疫原相關的分子的真核表達質粒DNA的組合物，它可經(jīng)一定途徑進入動物體內，并在動物體內轉錄和翻譯表達出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機體產(chǎn)生非特異性和特異性兩種免疫應答反應，從而起到免疫保護作用。
[0024]現(xiàn)行臨床試驗研究顯示，常規(guī)的基于HIV Gag的DNA疫苗誘導的特異性免疫應答較弱，通過改良疫苗載體及投送途徑均不能有效引發(fā)針對Gag的細胞免疫應答，因此需要新的Gag特異性的基因佐劑以增強其免疫應答強度。
[0025]本發(fā)明人出乎預料地發(fā)現(xiàn)，與僅表達HIV Gag蛋白的DNA疫苗相比，本發(fā)明的DNA疫苗能夠引發(fā)增強的Gag-特異性免疫應答。因此，在本發(fā)明的DNA疫苗中，編碼CyPA的第一多核苷酸的作用類似于基因佐劑。
[0026]人肽基脯氨酸順反異構酶親環(huán)素A(Cyclophilin A，CyPA)的長度為165個氨基酸，具有8個雙鏈反向平行β桶狀結構，且其活性位點結構域位于桶狀結構的一側(Kallen, J., Spitzfaden, C., Zurini, M.GM., Wider, G, Widmer, H., Wu..thrich, K., andffalkinshaw, M.D.(1991).Structure of human cyclophilin and its binding sitefor cyclosporin A determined by isoX-ray crystallographyand NMR spectroscopy.Nature 353,276-279 ;Kallen，J.，and Walkinshaw,M.D.(1992).The X-ray structure ofa tetrapeptide bound to the active site of human cyclophilin A.FEB S Lett.300,286-290 ;Ke，H.，Mayrose, D.，andCao，W.(1993).Crystal structure of cyclophilinA complexedwith substrate Ala-Pro suggests a solvent-assisted mechanism ofcis-trans isomerization.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90，3324-3328)。CyPA 與 Gag 蛋白N末端相互結合時，能夠形成一個約2.36人的晶體結構，CyPA活性位點與Gag蛋白的第85-93 位殘基相互作用(Gamble TR, Vajdos FF, Yoo S, Worthylake DK, Houseweart M, etal.(1996)Crystal structure of human cyclophilin A bound to the amino-terminaldomain of HIV-1 capsid.Cell 87:1285-1294)。
[0027]在優(yōu)選的實施方式中，用于本發(fā)明的DNA疫苗中的所述CyPA是來源于人的CyPA，其包含SEQ ID NO:1的氨基酸序列。用于本發(fā)明的DNA疫苗中的所述CyPA也可以是人CyPA的變體。所述CyPA的變體可以是天然存在的，例如來源于非人靈長類動物(例如恒河猴、黑猩猩)、鼠(例如小鼠、褐家鼠)、牛、節(jié)肢動物(例如家蠶)、魚類(例如斑馬魚)、兩棲類動物(例如非洲爪蛙)的CyPA。
[0028]用于本發(fā)明的DNA疫苗中的所述CyPA也涵蓋通過一或幾個氨基酸的缺失、插入或取代而衍生自SEQ ID NO:1且基本上保持人CyPA的功能活性的人工變體。
[0029]在一些實施方式中，可用于本發(fā)明的DNA疫苗中的所述CyPA的天然存在的變體或人工變體包含與SEQ ID NO:1具有至少70%、75%、80%、85%、90%、95%或99%相同性的氨基酸序列，且所述變體基本上保持人CyPA的功能活性。
[0030]多肽或蛋白質的序列相似性(亦稱為序列相同性)通常使用序列分析軟件來量測。蛋白質分析軟件使用歸因于各種取代、缺失及其它修飾(包括保守性氨基酸取代)的相似性的度量來匹配相似的序列。舉例而言，GCG含有諸如“Gap”及“Bestfit”的程序，其在默認參數(shù)下用于測定密切相關多肽(諸如來自不同生物物種的同源多肽)之間或野生型蛋白質與其突變蛋白質之間的序列同源性或序列相同性。例如參見6.1版GCG。多肽序列亦可使用FASTA(6.1版GCG中`的程序)，使用默認或推薦參數(shù)來比較。FASTA(例如FASTA2及FASTA3)提供查詢及搜索序列之間的最優(yōu)選重疊區(qū)域的比對及序列相同性百分比(Pearson, Methods Enzymo1.183:63-98(1990) ；Pearson, Methods Mol.Biol.132:185-219 (2000))。當將本發(fā)明的氨基酸序列與含有大量來自不同生物的序列的數(shù)據(jù)庫作比較時，替代算法為使用默認參數(shù)的計算機程序BLAST,尤其為blastp或tblastn。例如參見Altschul 等人，J.Mol.Biol.215:403-410 (1990) ;Altschul 等人,Nucleic Acids Res.25:3389-402(1997)。
[0031]當需要比對時，比對序列的最大同源性。變異位點可出現(xiàn)于多肽的任何位置，只要生物活性實質上類似于SEQ ID NO:1所示的人CyPA即可。
[0032]關于如何產(chǎn)生沉默氨基酸取代的教導可參見Bowie等人，Science, 247:1306-1310(1990)中，該文獻揭示了蛋白質對氨基酸取代的容許度(tolerance)是驚人的。
[0033]在蛋白質中引入氨基酸突變的方法是本領域技術人員所熟知的。例如參見Ausubel (編)，Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Inc.(1994) ；T.Maniatis, E.F.Fritsch 及 J.Sambrook, Molecular Cloning:A LaboratoryManual, Cold Spring Harbor laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989)。
[0034]也可使用市售試劑盒(諸如“QuikChangeTM定點誘變試劑盒”(Stratagene))或直接通過肽合成來引入突變。本領域技術人員能夠通過置換不顯著影響CyPA的功能的保守性氨基酸來產(chǎn)生CyPA的功能活性變體?！氨Ｊ匦园被崛〈笔前被釟埢?jīng)另一具有化學性質(例如電荷或疏水性)類似的側鏈R基團的氨基酸殘基取代的氨基酸取代。一般而言，保守性氨基酸取代不會實質上改變蛋白質的功能性質。在兩個或兩個以上氨基酸序列互不相同之處為保守性取代的情況下，可調高序列相同性或相似度百分比以校正該取代的保守性質。進行此調節(jié)的方式為本領域技術人員所熟知。例如參見Pearson，MethodsMol.Biol.243:307-31(1994)。
[0035]具有化學性質類似的側鏈的氨基酸組的實例包括:(I)脂肪族側鏈:甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸及異亮氨酸；(2)脂肪族羥基側鏈:絲氨酸及蘇氨酸；(3)含有酰胺的側鏈:天冬酰胺及谷氨酰胺；(4)芳香族側鏈:苯丙氨酸、酪氨酸及色氨酸；(5)堿性側鏈:賴氨酸、精氨酸及組氨酸；(6)酸性側鏈:天冬氨酸及谷氨酸；及(7)含硫側鏈:半胱氨酸及甲硫氨酸。優(yōu)選保守性氨基酸取代組為:纈氨酸-亮氨酸-異亮氨酸、苯丙氨酸-酪氨酸、賴氨酸-精氨酸、丙氨酸-纈氨酸、谷氨酸-天冬氨酸及天冬酰胺-谷氨酰胺。
[0036]或者，保守性置換是Gonnet等人，Science 256:1443-45 (1992)中所揭示的PAM250對數(shù)似然矩陣具有正值的任何改變?！爸卸缺Ｊ匦浴敝脫Q為PAM250對數(shù)似然矩陣具有非負值的任何改變。
[0037]人CyPA的功能活性變體亦可使用雜交技術來分離。簡言之，使用與編碼CyPA(例如SEQ ID NO:1)的核酸序列的全部或一部分具有高同源性的DNA來制備功能活性肽。因此，可用于本發(fā)明的CyPA也包括功能上等同于SEQ ID NO:1的人CyPA且由與編碼SEQ IDN0:1的核酸或其互補序列雜交的核酸分子編碼的肽。本領域技術人員可容易地使用易于得到的密碼子表來確定編碼本發(fā)明的肽的核酸序列。
[0038]編碼人CyPA的功能活性變體的核酸的雜交嚴格性為例如10%甲酰胺、5X SSPE、IX登哈特溶液(Denhart，s soluti`on)及IX鮭魚精DNA(低嚴格性條件)。更優(yōu)選條件為25%甲酰胺、5XSSPE、1X登哈特溶液及IX鮭魚精DNA (中等嚴格性條件)，且甚至更優(yōu)選條件為50%甲酰胺、5XSSPE、1X登哈特溶液及IX鮭魚精DNA(高嚴格性條件)。然而，除上述甲酰胺濃度外，若干種因素可影響雜交嚴格性，且本領域技術人員可適當?shù)剡x擇這些因素以達到類似嚴格性。
[0039]編碼人CyPA的功能活性變體的核酸分子也可通過基因擴增方法來分離，例如使用編碼人CyPA的核酸分子的一部分作為探針的PCR方法。
[0040]在一些實施方式中，可用于本發(fā)明的DNA疫苗中的所述CyPA包含選自如下一組的氨基酸序列:SEQ ID NO:1 (人 CyPA)、SEQ ID NO:2 (恒河猴，100% ), SEQ ID NO:3 (黑猩猩，100% )、SEQ ID NO:4(小鼠，95.8% )、SEQ ID NO:5 (褐家鼠，95.6% )、SEQ ID NO:6 (牛，79.2% )、SEQ ID NO:7 (家蠶，70.9% )、SEQ ID NO:8 (斑馬魚，73.8% )和 SEQ IDNO:9(非洲爪蛙，75.6%)，其中括號內給出的是CyPA的物種來源及其與SEQ ID NO:1的氨基酸序列相同性。
[0041]在本發(fā)明的DNA疫苗中，所述HIV的Gag蛋白來自HIV-1或HIV-2。所述HIV-1包括但不限于以下亞型:A、B、C、D、F、G、H、J、K以及流行性重組型(circulating recombinantform, CRF)病毒 CRFO 1_AE、CRF02_AG, CRFO3_AB, CRF04_cpx、CRF05_DF, CRF06_cpx,CRF07_BC、CRF08_BC、CRF09_cpx、CRF10_CD、CRFll_cpx、CRF12_BF、CRF13_cpx、CRF14_
BG、CRF15_01B、CRF16_A2D、CRF17_BF、CRF18_cpx、CRF19_cpx、CRF20_BG、CRF21_A2D、CRF22_01A1、CRF23_BG、CRF24_BG、CRF25_cpx、CRF26_AU、CRF27_cpx、CRF28_BF、CRF29_BF、CRF30_0206,CRF31_BC、CRF32_06A1、CRF33_01B、CRF34_01B、CRF35_AD、CRF36_cpx、CRF37_cpx、CRF38_BF、CRF39_BF、CRF40_BF、CRF41_CD、CRF42_BF、CRF43_02G、CRF44_BF、CRF45_cpx、CRF46_BF、CRF47_BF、CRF48_01B、CRF49_cpx、CRF50_A1D、CRF51_01B、CRF52_01B、CRF53_01B 和 CRF54_01B。
[0042]在本發(fā)明的DNA疫苗中，所述Gag蛋白包含與SEQ ID NO: 10 (Gag蛋白的標準氨基酸序列，來源于HIV-1 B亞型HXB2參考株)具有至少80%、85%、90%或95%相同性的氨基酸序列。在一些【具體實施方式】中，用于本發(fā)明的DNA疫苗中的所述Gag蛋白包含SEQ IDNO: 11所示的HIV-1 B’ /C亞型CN54株Gag蛋白的氨基酸序列。
[0043]HIV-1 Gag前體蛋白P55剪切后，產(chǎn)生包膜蛋白P24，其參與到病毒顆粒的組裝及后續(xù)病毒侵染細胞等過程。CyPA與HIV-1 Gag P24的N末端存在特異性相互作用，并使得CyPA這種胞衆(zhòng)宿主蛋白特異性地參入到病毒顆粒中(Franke EK, Yuan HE, LubanJ.Specific incorporation of cyclophilin A into HIV-1 virions.Nature 1994 ；372:359-62 ；Thali M, Bukovsky A, Kondo E, Rosenwirth B, Walsh CT, Sodroski J, etal.Functional association of cyclophilin A with HIV-1 virions.Nature 1994 ；372:363-5)。因此，在另外一些實施方式中，本發(fā)明的DNA疫苗中使用的是Gag蛋白的免疫原性片段，例如包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列的Gag蛋白的免疫原性片段P24。
[0044]在本發(fā)明的DNA疫苗的一些實施方式中，可以對編碼CyPA的所述第一多核苷酸和/或編碼HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸進行密碼子優(yōu)化，適合于在人類對象中表達。密碼子優(yōu)化的策略 是本領域人員已知的。
[0045]在一些實施方式中,本發(fā)明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸和第二多核苷酸由同一表達載體攜帶，優(yōu)選地，所述編碼CyPA的第一多核苷酸與編碼HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸被分別表達。在另外一些實施方式中，本發(fā)明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸與第二多核苷酸由不同表達載體攜帶。
[0046]本發(fā)明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸和第二多核苷酸分別可操縱地連接于啟動子或置于其他表達調控元件的控制下，以使得本發(fā)明的DNA疫苗在接種于人類對象后能夠在所述對象中表達所述CyPA和Gag蛋白或所述片段。啟動子可以是任何適合于真核表達載體的啟動子，例如CMV或SV40啟動子。表達調控元件例如為具有雙鏈發(fā)卡結構 RNA 兀件(Li D, Liu Y, Zhang Y, Xu J, Hong K, et al.(2007)Adjuvant effectsof plasmid-generated hairpin RNA molecules on DNA vaccination.Vaccine 25:6992-7000.)，或某些具備增強外源基因表達功能的增強型元件(Li HS，Liu Y，Li DF7ZhangRR, Tang HL, et al.(2007)Enhancement of DNA vaccine-1nduced immune responses bya 72-bp element from SV40 enhancer.Chin Med J(Engl) 120:496-502 ；Sun J,Li D,HaoY, Zhang Y, Fan ff, et al.(2009)Posttranscriptional regulatory elements enhanceantigen expression and DNA vaccine efficacy.DNA Cell Biol 28:233-240)。優(yōu)選地，用于構建本發(fā)明的DNA疫苗的載體是真核細胞表達載體或其優(yōu)化形式。通常含有CMV或SV40啟動子，卡那霉素抗性基因，以及一些其他調節(jié)優(yōu)化基因元件如BCGpA和Exon等。
[0047]在一些實施方式中,本發(fā)明的DNA疫苗中的所述第一多核苷酸與第二多核苷酸的比例是大約1: 10至大約10: 1，例如大約1: 8至大約8: 1，大約1: 5至大約5: 1，大約1: 4至大約4: 1，大約1: 3至大約3: 1，或大約1: 2至大約2: I。優(yōu)選地，所述第一多核苷酸與第二多核苷酸的比例是大約1:1。所述比例優(yōu)選地指摩爾比或拷貝數(shù)比，不過，鑒于載體的長度一般遠大于所述第一多核苷酸和第二多核苷酸的長度，因此質量比在大多數(shù)情況下近似于摩爾比或拷貝數(shù)比。例如質量比與摩爾比或拷貝數(shù)比的實際差異在10%左右是允許的。也可以通過使用不同的表達調控元件例如啟動子來改變所述CyPA和Gag蛋白的表達水平來調節(jié)本發(fā)明的DNA疫苗在體內實際產(chǎn)生的CyPA和Gag蛋白的水平。 [0048]本發(fā)明的DNA疫苗還包含藥用可接受的賦形劑。術語“賦形劑”在本說明書中用于描述除活性成份(即所述第一多核苷酸和第二多核苷酸)外的任何成份。賦形劑的選擇將在很大程度上視例如特定施用方式、賦形劑對溶解性及穩(wěn)定性的作用及劑型的性質等因素而定。在本說明書中，“藥用可接受的賦形劑”包括任何及所有溶劑、分散介質、涂料、抗細菌劑及抗真菌劑、等滲劑及吸收延緩劑及生理學上相容的類似物。藥用可接受的賦形劑的一些實例為水、生理鹽水、磷酸鹽緩沖生理鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其類似物以及其組合。在多數(shù)情況下，優(yōu)選該組合物中包括等滲劑，例如糖、多元醇(諸如甘露糖醇、山梨糖醇)或氯化鈉。藥用可接受的物質的其它實例為濕潤劑或少量輔助物質，諸如濕潤劑或乳化劑、防腐劑或緩沖液，其增加活性成份的存放期或增強活性成份的有效性。
[0049]本發(fā)明的疫苗及其制備方法對于本領域技術人員為顯而易知。疫苗組合物及其制備方法可見于例如 Remington’ s Pharmaceutical Sciences,第 19 版(Mack PublishingCompany, 1995)中。疫苗組合物優(yōu)選在GMP條件下制造。
[0050]本發(fā)明的DNA疫苗組合物可以單一單位劑量形式或以多單一單位劑量形式整批制備并包裝。在本說明書中，“單位劑量”為包含預定量活性成份的DNA疫苗組合物的個別量?；钚猿煞莸牧恳话愕扔谙騻€體施用的活性成份的劑量或該劑量的合適部分(例如該劑量的一半或三分之一)。
[0051]可選擇多種方法來檢測本發(fā)明的DNA疫苗誘導的特異性免疫應答。例如，針對細胞免疫應答反應，可以通過ELISP0T技術檢測抗原特異性刺激后免疫細胞分泌的細胞因子的水平來測定免疫應答的強度，或者可以通過流式細胞術檢測抗原刺激后不同免疫細胞亞群來分析多種細胞因子的強度，由此分析多功能細胞免疫應答反應水平。針對體液免疫應答，可以通過ELISA技術檢測疫苗誘導的抗原特異性結合抗體強度，通過中和抗體技術可以檢測疫苗誘導的抗原特異性中和抗體水平及廣譜程度，從而反映疫苗針對病原體潛在的保護性?？梢圆捎蒙唐坊脑噭┖衼頇z測本發(fā)明的DNA疫苗誘導的特異性免疫應答。
[0052]本發(fā)明還提供在人類對象中預防或治療HIV感染的方法，其包括給所述對象施用如上所述的本發(fā)明的DNA疫苗，由此在所述對象中引發(fā)Gag-特異性的抗HIV免疫應答。
[0053]本領域所接受的任何施用DNA疫苗的方法均可適當?shù)赜糜诒景l(fā)明的方法中。例如，可通過選自肌肉注射、皮下注射、皮內注射、靜脈注射、淋巴管注射和粘膜免疫的一或多種途徑給所述對象施用本發(fā)明的DNA疫苗組合物。優(yōu)選地，可通過肌肉注射和淋巴管注射施用本發(fā)明的DNA疫苗組合物。[0054]注射的DNA在肌肉細胞中以環(huán)型分子存在，不能復制，并不能整合到宿主細胞染色體中。肌肉細胞中特有的橫管系統(tǒng)與細胞外空間有直接交通，因而可介導質粒DNA的內吞作用。而且橫紋肌中溶酶體和DNA酶的含量較低，可能也是質粒DNA能在細胞中存在較長時間的原因。
[0055]對于特定的施用方式，例如皮下注射，也可采用例如微離子轟擊介導的DNA免疫，即基因槍。其技術依據(jù)是亞微粒的鎢和金能自發(fā)地吸附DNA，將包裹有金粉或鎢粉的DNA質粒，借助高能電場以極快的速度轟擊動物表皮組織，能獲得滿意的免疫效果。而對于粘膜免疫，可以將本發(fā)明的DNA疫苗包囊化于脂質體中進行施用。
[0056]本發(fā)明的例示性、非限制性DNA疫苗組合物為呈無菌水溶液的配制物，其pH值在約6.5至約7.5的范圍內且包含約0.lmg/mL至約5mg/mL本發(fā)明的DNA疫苗、約I毫摩爾至約100毫摩爾磷酸鹽緩沖液(含約80毫摩爾磷酸氫二鈉，20毫摩爾磷酸二氫鈉，1.53摩爾氯化鈉)。
[0057]應了解用于任何特定對象的特定劑量視多種因素而定，包括所用DNA疫苗的活性、對象的年齡、體重、一般健康狀況、性別、飲食、施用時間、施用途徑、藥物組合及進行治療的特定疾病的嚴重程度。
[0058]舉例而言，本發(fā)明的DNA疫苗組合物可以約0.1 μ g至約20mg的劑量向個體施用，例如約0.1 μ g至約5 μ g、約5 μ g至約10 μ g、約10 μ g至約25 μ g、約25 μ g至約50 μ g、約 50 μ g 至約 100 μ g、約 100 μ g 至約 500 μ g、約 500 μ g 至約 lmg、約 Img 至約 2mg,約 2mg至約10mg。
[0059]免疫治療可包含初始免疫，隨后為(例如一次、兩次、三次或三次以上)加強免疫。優(yōu)選地，給所述對象施用兩次或更多次包含本發(fā)明的DNA疫苗的疫苗組合物，兩次施用的間隔為2至4周。優(yōu)選地，給所述對象施用3次包含本發(fā)明的DNA疫苗的疫苗組合物。
[0060]優(yōu)選地，包含本發(fā)明的DNA疫苗的疫苗組合物在對象中引發(fā)Gag-特異性的抗HIV細胞免疫應答。這種免疫應答的特點是CyPA特異性增強Gag細胞免疫應答，提高Gag DNA疫苗的免疫原性。且該免疫應答主要側重于細胞免疫應答，對于體液免疫反應則無顯著性提高。無意于受到任何理論的約束，這種增強性的免疫應答被認為是與CyPA與Gag的相互作用有關。例如，CyPA可能促使宿主細胞提呈Gag抗原片段，以達到增強免疫原性的作用。
[0061]通過以下實施例進一步闡述本發(fā)明，這些實施例不應視為對本發(fā)明的限定。
實施例
[0062]實施例1:構建 pDRVI4.0_gp 1455m 及 pDRVI4.0-gag
[0063]pDRVI4.0是由中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心病毒免疫室構建的DNA疫苗載體，其以pDRVISVl.0為模板，運用PCR并結合克隆的方法，刪除pDRVISVl.0中非必要序列，構建成功包含擴增復制子ColEl和卡那霉素抗性基因Kan、CMV啟動子、CMV啟動子上游的72bp單拷貝SV40增強子，BCGpA調節(jié)序列等元件的pDRVI4.0質粒(徐智勇，新一代HIV DNA疫苗優(yōu)化設計及DNA疫苗導入技術的研究，碩士畢業(yè)論文)。含有該質粒的大腸桿菌已于2012年9月5日保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心CGMCC，保藏號CGMCC N0.6514。pDRVI4.0 的序列如 SEQ ID NO:147 所示。
[0064]通過EcoRV及SalI雙酶切pDRVI4.0質粒將其線性化。用EcoRV及SalI雙酶切PDRVISV1455M質粒。pDRVISV1455M是在DNA疫苗載體pDRVISVl.0基礎上構建攜帶遺傳密碼子優(yōu)化的HIV-1B’ /C重組毒株CN54env基因的質粒，其構建過程已在中國專利申請200810097471.3 (CN101591379A)中公開，含有該質粒的大腸桿菌于2008年5月22日保藏于CGMCC，保藏號為CGMCC N0.2514?；厥誫pl455m片段(SEQ ID N0:148，其編碼SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列)。將gpl455m片段連接進入pDRVI4.0質粒中，即獲得pDRVI4.0_gpl455m。
[0065]通過EcoRV及Sail雙酶切pDRVI4.0質粒將其線性化。用EcoRV及SalI雙酶切pCRScript-gpnef質粒。pCRScript-gpnef是攜帶遺傳密碼優(yōu)化的HIV-1B’ /C重組毒株CN54Gag蛋白的編碼序列的質粒，含有該質粒的大腸桿菌保藏于CGMCC，保藏號為CGMCCN0.1003?；厥誈ag片段(SEQ ID NO: 149，其編碼SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列)。將Gag片段連接進入pDRVI4.0質粒中，即獲得pDRVI4.0_Gag。
[0066]實施例2:構建 pDRVI4.0-Mouse CyPA
[0067]1.小鼠樹突狀細胞原代培養(yǎng)
[0068]選取5周齡C57BL/6雄性小鼠(維通利華實驗動物技術有限公司)經(jīng)頸椎脫位法處死，無菌狀態(tài)下取股骨和脛骨，浸泡在RPM1-1640培養(yǎng)基(Gibco公司)中4°C，直至所有骨樣本收集完畢。剔除股骨、脛骨上的肉，將骨浸泡在70%酒精中2min進行無菌處理，再用預冷的RPM1-1640洗滌2次。用Iml注射器吸取RPM1-1640培養(yǎng)液，從骨干的一端刺入骨髓腔，將骨髓沖洗到無菌培養(yǎng)皿中，反復4~6遍。收集培養(yǎng)皿中的骨髓細胞懸液，1200rpm離心IOmin0棄去上清,加入5ml無菌紅細胞裂解液(Tris 1.3g、NH4Cl3.55g,用雙蒸水定容至終體積為500ml，調pH值至7.2，高壓滅菌)，于室溫下靜置2分鐘溶解紅細胞后，再次1200rpm離心lOmin，棄上清。用RPM1-1640培養(yǎng)液洗滌后將細胞用完全培養(yǎng)基(440ml的RPM1-1640細胞培養(yǎng)液中加入50ml的胎牛血清(Gibco公司)，5ml青霉素/鏈霉素，5ml谷氨酰氨)懸浮，調整細胞濃度至I X IO6細胞/ml，分至6孔培養(yǎng)板中，并在每孔中加入完全培養(yǎng)基至4ml，再加入重組小鼠粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(rmGM-CSF)(購自R&D公司，貨號415-ML-050)至終濃度10ng/ml,白細胞介素4 (IL-4)(購自R&D公司，貨號404-ML-050-CF)至終濃度10ng/ml。將細胞培養(yǎng)板放入37°C，含5% C02的孵箱中培養(yǎng)。48小時后輕輕吹打細胞后，連同培養(yǎng)液一起吸去懸浮細胞，僅保留貼壁細胞，補充加入新鮮的完全培養(yǎng)基及相同濃度的rmGM-CSF。繼續(xù)培養(yǎng)至第5天，半量換液，并補足rmGM-CSF及IL-4 ;盡量保留懸浮細胞。繼續(xù)培養(yǎng)至第7天，用吸管輕輕吹打后收集所有懸浮細胞，即為富集的小鼠骨髓來源的樹突狀細胞(Bone marrow-derived dendritic cell,BMDC)。用PE標記的CDllc單克隆熒光抗體(eBioscience，貨號17-0114-82)標記BMDC，通過流式細胞儀檢測BMDC純度，其純度達到80%以上。
[0069]2.提取總RNA提取
[0070]參照RNeasy Plus Kit試劑盒(Qiagen公司，貨號74134)說明書，提取BMDC的總RNA。
[0071]3.反轉錄合成cDNA
[0072]參照Transcriptor High Fidelity cDNA Synthesis Kit 試劑盒(Roche 公司，貨號05-091-284-001)說明書，進入如下逆轉錄反應:反應體系1(總體積11.4 μ 1，包含
5.4μ I總RNA，2.0μ I隨機引物6聚體及4.0 μ I水)，65°C反應lOmin，立即置于冰上驟冷；配置反應體系 2 (包含 4.0 μ I Transcriptor High Fidelity Reverse TranscriptaseReaction Buffer,0.5 μ I Protector RNase Inhibitor,2.0 μ I dNTp,1.0 μ I DTT,1.1 μ ITranscriptor High Fidelity Reverse Transcriptase);將反應體系 2加入驟冷后的反應體系I中，再置于50°C反應30min，然后85°C反應5min。
[0073]4.PCR擴增小鼠CyPA的編碼序列
[0074]擴增引物序列為if 向引物 AAAACTGCAGATGGTCAACCCCACCGTGTTCTTC (SEQ ID NO:14)(下劃線為引入的酶切位點 PstI)，反向引物 GCTCTAGATTAGAGCTGTCCACAGTCGGAAATG(SEQ ID NO:15)(下劃線為引入的酶切位點XbaI) οδΟμΙ反應體系中加入4.5μ I cDNA。反應條件為 98°C預變性 10min，98°C 30s, 59°C 30s, 72°C lmin，重復 30 個循環(huán)，72°C延伸 IOmin0
[0075]5.構建 pDRVI4.0-Mouse CyPA
[0076]通過PstI 及 XbaI (New England BioLabs 公司)雙酶切上述 CyPA PCR 產(chǎn)物及pDRVI4.0質粒，分別進行酶切產(chǎn)物的回收(詳見QIAquickPCR Purification Kit (貨號28104)說明書)，連接轉化，挑取陽性克隆即獲得pDRVI4.0-Mouse CyPA，其攜帶小鼠來源的CyPA的編碼序列(SEQ ID NO:150，其編碼SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列，NCBI參考序列:NM 008907.1)。
[0077]實施例3:構建 pDRVI4.0-Homo CyPA
[0078]1.人CyPA編碼序列的合成
[0079]委托金唯智生物科技有限公司合成人CyPA(SEQ ID NO:1，NCBI參考序列:匪021130.3)的編碼序列(SEQ ID NO:151)，并在5’端添加PstI酶切位點，3’端添加XbaI酶切位點。通過平末端連接至PUC57質粒中，獲得pUC57-Homo CYPA。
`[0080]2.構建 pDRVI4.0-Homo CyPA
[0081]通過PstI 及 XbaI (New England BioLabs 公司)雙酶切處理 pUC57_Homo CYPA 及PDRVI4.0質粒，將上述酶切后人CyPA片段及pDRVI4.0進行PCR回收(詳見QIAquickPCRPurification Kit (貨號 28104)說明書)，連接進入 pDRVI4.0,即得 pDRVI4.0-HomoCyPA(圖1)，其攜帶人來源的CyPA的編碼序列。
[0082]實施例4:構建 pDRVI4.0-gag/Homo CyPA 及 pDRVI4.0-gag/Homo CyPAmut
[0083]1.構建 pDRVI4.0-gag/Homo CyPA
[0084]1.1.擴增含有人CyPA的表達盒
[0085]PCR 擴增 pDRVI4.0-Homo CyPA 質粒中的 SV40-CMV-Exon-HomoCyPA-BGHpA 的表達盒，正向引物TATTACTGTGACGTTGAATTCTGGTTGC(SEQ ID NO: 16),反向引物 CCGGAATTCAGATCTGGATCCAACGTCGGTACC (SEQ ID NO:17)(下劃線為引入的酶切位點EcoRI)。反應條件為94°C預變性10min，94°C 30s, 60°C 30s, 72°C 2min，重復30個循環(huán)，72°C延伸lOmin。膠回收上述擴增產(chǎn)物(詳見 QIAquick Gel Extraction Kit (貨號 28704)說明書)。
[0086]1.2.構建 pDRVI4.0-gag/Homo CyPA
[0087]利用EcoRI (New England BioLabs公司)酶切上述人CyPA表達盒PCR產(chǎn)物及pDRVI4.Ο-gag,回收(詳見 QIAquickPCR Purification Kit (貨號 28104)說明書)，連接轉化，挑選陽性克隆，即得到PDRVI4.0-gag/Homo CyPA (圖2)。其包含Gag和Homo CyPA兩個表達盒，分別都具有CMV啟動子，SV40增強子，Exon及BGHpA調節(jié)元件。
[0088]2.構建 pDRVI4.0-gag/Homo CyPAmut[0089]2.1.對 pDRVI4.0-Homo CyPA 進行突變
[0090]選擇人CyPA序列中如下位點進行突變:H54Q/R55A/F60A，正向引物GTTATAAGGGTTCCTGCTTTCAGGCAATTATTCCAGGGGCTATGTGTCAGGGTGG (SRO ID NO: 18)(下劃線為突變位點改變后的堿基序列)，反向引物 CCACCCTGACACATAGCCCCTGGAATAATTGCCTGAAAGCAGGAACCCTTATAAC (SEQ ID NO:19)。反應條件為 95°C預變性 lmin，95°C 30s, 55°C lmin，72°C 3.5min，重復18個循環(huán)，72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物直接進行轉換，挑取陽性克隆，即得pDRVI4.0-HomoCyPAmut，其攜帶編碼具有H54Q/R55A/F60A突變的人CyPA的核苷酸序列(SEQ ID N0:152,其編碼如SEQ ID NO:153所示的人CyPA突變體的氨基酸序列)。
[0091]2.2.擴增含有人CyPAmut的表達盒
[0092]PCR 擴增 pDRVI4.0-Homo CyPAmut 質粒中的 SV40-CMV-Exon-HomoCyPAmut-BGHpA的表達盒，正向引物TATTACTGTGACGTTGAATTCTGGTTGC(SEQ ID NO:20),反向引物ccggaattcAGATCTGGATCCAACGTCGGTACC(SEQ ID NO:21)(下劃線為引入的酶切位點EcoRI)。反應條件為 94°C預變性 10min，94°C 30s, 60°C 30s, 720C 2min，重復 30 個循環(huán)，72?延伸 lOmin。膠回收上述擴增產(chǎn)物(詳見QIAquick Gel Extraction Kit (貨號28704)說明書)。
[0093]2.3.構建 pDRVI4.0-gag/Homo CyPA
[0094]利用EcoRI (New England BioLabs公司)酶切上述人CyPAmut表達盒PCR產(chǎn)物及pDRVI4.Ο-gag,回收(詳見 QIAquickPCR Purification Kit (貨號 28104)說明書)，連接轉化，挑選陽性克隆，得到pDRVI4.0-gag/Homo CyPAmut,其包含Gag和Homo CyPAmut兩個表達盒，分別都具有CMV啟動子，SV40增強子，Exon及BGHpA調節(jié)元件。
[0095]實施例5:動物免疫接種方案和免疫應答檢測
[0096]1.免疫接種方案
`[0097]方案I
[0098]首先為了驗證CyPA的的編碼序列佐劑效應，并考慮可能潛在的種屬差異性，先構建了含有小鼠CyPA的編碼序列的pDRVI4.0-Mouse CyPA質粒。為了驗證pDRVI4.0-MouseCyPA特異性針對HIV-1 Gag的反應，構建表達HIV-1 gpl455m的pDRVI4.0_gpl455m作為對照之一。方案I的具體接種情況見表1。
[0099]上述各組均是免疫三針，第0，2，4周免疫，第6周處死老鼠，檢測特異性細胞及體液免疫應答。
[0100]表1
【權利要求】
1.一種DNA疫苗，其包含免疫學有效量的編碼CyPA的第一多核苷酸和編碼HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段的第二多核苷酸，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸分別可操縱地連接于啟動子，且所述DNA疫苗在接種于人類對象后允許在所述對象中表達所述CyPA和Gag蛋白或所述片段，并由此引發(fā)Gag-特異性的抗HIV免疫應答。
2.權利要求1的DNA疫苗，其中所述CyPA包含與SEQID NO:1所示的人CyPA具有至少70%相同性的氨基酸序列。
3.權利要求1的DNA疫苗，其中所述CyPA是來源于靈長類、鼠、牛、節(jié)肢動物、魚類或兩棲類動物的CyPA。
4.權利要求3的DNA疫苗，其中所述CyPA包含選自如下一組的氨基酸序列:SEQIDNO: 1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID N0:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8 和 SEQ ID NO:9。
5.權利要求1的DNA疫苗，其中所述HIV的Gag蛋白來自HIV-1或HIV-2。
6.權利要求5的DNA疫苗，其中所述HIV-1選自以下亞型:A、B、C、D、F、G、H、J、K、CRF01_AE、CRF02_AG、CRF03_AB、CRF04_cpx、CRF05_DF、CRF06_cpx、CRF07_BC、CRF08_BC、CRF09_cpx、CRF10_CD、CRFIl_cpx、CRF12_BF、CRF13_cpx、CRF14_BG、CRF15_01B、CRF16_A2D、CRF17_BF、CRFl8_cpx、CRFl9_cpx、CRF20_BG、CRF21_A2D、CRF22_0IAl、CRF23_BG、CRF24_BG、CRF25_cpx、CRF26_AU、CRF27_cpx、CRF28_BF、CRF29_BF、CRF30_0206、CRF31_BC、CRF32_06A1、CRF33_01B、CRF34_01B, CRF35_AD、CRF36_cpx、CRF37_cpx、CRF38_BF、CRF39_BF、CRF40_BF、CRF41_CD、CRF42_BF、CRF43_02G、CRF44_BF、CRF45_cpx、CRF46_BF、CRF47_BF、CRF48_01B、CRF49_cpx、CRF50_A1D、CRF51_01B、CRF52_01B、CRF53_01B 和 CRF54_01B。
7.權利要求1的DNA疫苗，其中所述Gag蛋白包含與SEQID NO:10具有至少80%相同性的氨基酸序列。
8.權利要求7的DNA疫苗，其中所述Gag蛋白包含SEQID NO: 11所示的氨基酸序列。
9.權利要求1的DNA疫苗，其中所述Gag蛋白的免疫原性片段包含SEQID NO:12所示的氨基酸序列。
10.權利要求1的DNA疫苗，其中所述第一多核苷酸和/或第二多核苷酸已經(jīng)密碼子優(yōu)化，適合于在人類對象中表達。
11.權利要求1的DNA疫苗,其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸由同一表達載體攜帶。
12.權利要求11的DNA疫苗，其中所述CyPA與HIV的Gag蛋白或其免疫原性片段被分別表達。
13.權利要求1的DNA疫苗,其中所述第一多核苷酸與第二多核苷酸由不同表達載體攜帶。
14.權利要求1的DNA疫苗，其中所述第一多核苷酸與第二多核苷酸的比例是大約I: 10至大約10: I。
15.權利要求11的DNA疫苗，其中所述第一多核苷酸與第二多核苷酸的比例是大約I: 10
16.權利要求1的DNA疫苗，其還包含藥用可接受的賦形劑。
17.在人類對象中預防或治療HIV感染的方法，其包括給所述對象施用權利要求1-16中任一項的DNA疫苗，由此在所述對象中引發(fā)Gag-特異性的抗HIV免疫應答。
18.權利要求17的方法，其中給所述對象施用兩次或更多次所述DNA疫苗，兩次施用的間隔為2至4周。
19.權利要求17的方法，其中給所述對象施用3次所述DNA疫苗。
20.權利要求17的方法，其中通過選自肌肉注射、皮下注射、皮內注射、靜脈注射、淋巴管注射和粘膜免疫的一或多種途徑給所述對象施用所述DNA疫苗。
21.權利要求17的方法， 其中所述Gag-特異性的抗HIV免疫應答是細胞免疫應答。
【文檔編號】A61K39/21GK103656675SQ201210341820
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2012年9月7日 優(yōu)先權日:2012年9月7日
【發(fā)明者】邵一鳴, 侯爵, 劉穎 申請人:中國疾病預防控制中心性病艾滋病預防控制中心